Name: ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶ、ヒトiPS細胞を脳微小血管内皮細胞様細胞へ分化させるEECMプロトコル。血脳関門の免疫細胞相互作用を研究するモデルとして活用でき、多発性硬化症などの神経疾患の病態理解に貢献します。

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HNは、上原記念財団、ECTRIMS特別研究員、日本学術振興会の助成を受けて、日本学術振興会(JRPs)JPJSJRP20221507および科研費第22K15711号、JSTフォレストプログラム(課題番号JPMJFR2269、日本)、横山臨床薬理財団 YRY-2217、金原一郎財団、成重神経科学研究財団、 ノバルティス学術振興財団、山口大学基金BEは、スイスMS協会とスイス国立科学財団(助成金310030_189080およびZLJZ3_214086)および戦略的日スイス科学技術プログラム(SJSSTP)助成金IZLJZ3_214086によって支援されました。

<ol><li>Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+junctional+complexes+of+endothelial%2C+epithelial+and+glial+brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372(2019).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li>
<li>Marchetti, L., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+trafficking+across+the+blood-brain+barrier+in+the+absence+and+presence+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation.</a> Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).</li>
<li>Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+mechanisms+of+blood-brain+barrier+damage+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).</li>
<li>Nishihara, H., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers+and+multiple+sclerosis%3A+novel+treatment+approaches+from+a+brain+barriers+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).</li>
<li>Pan, Y., Nicolazzo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+blood-brain+barrier+and+blood-spinal+cord+barrier+dynamics+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+Impact+on+medication+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety.</a> British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+pathology+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease%3A+implications+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy.</a> Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).</li>
<li>Song, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+comparison+of+human+and+mouse+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12358(2020).</li>
<li>Lecuyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+ALCAM+in+neuroinflammation+and+blood-brain+barrier+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+in+vitro+tissue-engineered+blood-brain+barrier+models%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32(2018).</li>
<li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733(2014).</li>
<li>Hollmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li>
<li>Praca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+brain+capillary-like+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).</li>
<li>Al-Ahmad, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+expression+and+activity+of+glucose+transporters+between+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+and+hCMEC%2FD3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+neurovascular+unit+model+comprised+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%2C+pericytes%2C+astrocytes%2C+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25(2019).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
<li>Lu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+epithelium+misidentified+as+brain+microvascular+endothelium+requires+ETS+factors+to+acquire+vascular+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118(2021).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-purified+rat+brain+microvascular+endothelial+cell+cultures+exhibit+improved+barrier+properties+in+response+to+glucocorticoid+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction.</a> Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).</li>
<li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crawl%2C+cross%3A+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).</li>
<li>Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calponin+and+SM+22+as+differentiation+markers+of+smooth+muscle%3A+spatiotemporal+distribution+during+avian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development.</a> Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).</li>
<li>Gastfriend, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+mediates+acquisition+of+blood-brain+barrier+properties+in+na%C3%AFve+endothelium+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells.</a> eLife. 10, e70992(2021).</li>
<li>Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+expression+of+E-+and+P-selectins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo.</a> Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+blood-brain+barrier+dysfunction+contributes+to+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).</li>
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BEは、血液脳関門を越えるT細胞遊走に対するナタリズマブの長期投与を研究するためのバイオジェンからの助成金と、神経疾患における血液脳関門機能障害の分子基盤を研究するためのCSLベーリングからの助成金を受けました。HNおよびBEは、EECM-BMEC様細胞に関連する暫定的な米国特許出願の発明者である(63/084980および63/185815)。

重要なポイントとトラブルシューティング EPC分化を開始する前に、研究者はhiPSC培養で自発的な細胞分化イベントが発生していないことを確認する必要があります。自然分化した細胞がなく、純粋なhiPScコロニーを使用することは、再現性のある結果を得るために重要です。-3日目のhiPS細胞播種密度は、MACS後に高純度のCD31+ EPCを得るために重要です。各hiPSC株および各継代のシード密度は、最適化が必要な場合があります。hiPSC株と継代数に応じて、播種密度は、12ウェルプレート(20-100 x 10 3/cm2)のウェルあたり75 x 10 3〜400 x 10 3 hiPScの範囲です。hiPS細胞の最小密度チェックポイントは、2日目の細胞密度です。hiPS細胞は遅くとも2日目までに100%コンフルエントに達するはずです。2日目までにhiPS細胞がコンフルエントでない場合、MACS後のCD31+ EPCの純度は通常かなり低くなります。この場合、hiPScの播種密度を高めることができる。3日目から5日目頃に多数の分化細胞がプレートから剥離すると、初期のiPS細胞播種密度が低下する可能性があります。私たちの経験では、7〜8 μM CHIR99021は、ここで使用されるhiPS細胞株の最適濃度ですが、阻害剤治療に対して異なる反応を示す可能性のある他のhiPSC株に対して濃度を最適化する必要がある場合があります。CD31+ EPCの純度は、MACSの前後に確認する必要があります。MACSを継続する前に、事前にソートされた細胞混合物は>10%CD31 +細胞である必要があります。CD31+細胞の割合が<6%の場合、通常、MACS後に<80%のEPCが得られます。この状況では、初期播種密度および/またはCHIR99021濃度の最適化が必要です。
選択的継代と純粋なEC単分子膜の生成を成功させるには、CD31+ EPCのMACS後の純度が重要です。MACS後の純度が<90%の場合は、1回または2回の追加洗浄をお勧めします(ステップ1.4.11-1.4.12)。理想的には、MACS後の純度は>95%である必要があります。コラーゲンコーティングプレート上のEPC播種密度は、3〜7日以内に100%のコンフルエンシーを達成するために、hiPSCラインに従って最適化する必要があります。ECが100%コンフルエントになるまで待つと、通常、選択的通過が成功します。ただし、100%コンフルエントECであっても、一部のhiPSCラインのSMLCも早期に分離します。この場合、より低いコンフルエント(例えば、≤80%)での選択的継代が有効であり得る。一部のSMLCがECよりも早くデタッチすると、ECをEC-SMLC混合集団から救出できないことがよくあります。この場合、継代ECおよび反復選択継代における解離試薬の活性化時間を短縮することが有用であり得る。トリプシンはECとSMLCの別々の剥離を可能にしないため、解離試薬としてトリプシンではなく市販の解離試薬を使用することは、選択的継代に有益です。低分子トレーサーを用いた透過性アッセイ、タイトジャンクションおよび接着分子の発現レベルのテストは、EPC、EECM-BMEC様細胞、およびSMLCが液体窒素に少なくとも2年間保存できることを示しています。
この方法の意義と限界 この方法は、化学GSK-3阻害剤を使用してWnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化することにより、CD31+ EPCをhiPS細胞と区別します。MACSによるCD31+ EPCのポジティブセレクションの後、EPCは、混合内皮およびSMLC集団への分化を促進する定義された内皮培地で培養されます。異なる接着特性を有するこれらの混合集団の選択的継代は、SMLCからのECの分離を可能にする。1回または2回の継代後、EECM-BMEC様細胞は、バリア特性および初代ヒトBMECのものを要約する内皮接着分子の発現を示す。SMLCまたはその上清との共培養は、VCAM-1のサイトカイン誘導性発現を誘導します。
生体内では、BBBは、特定のトランスポーターを介した栄養素の輸送とCNSへの免疫細胞輸送の制御を通じて、分子の低い傍細胞および経細胞透過性を確立することにより、CNS恒常性を維持します。BBBの研究には、それぞれの分子や目的とする機能を表示する適切なモデルが不可欠です。定義された試薬および患者または健常者からの試料を用いたEECM−BMEC様細胞の産生は、スケーラブルなヒトBBBモデルを提供する。EECM-BMEC様細胞を用いたモデルが他のBBBモデルよりも優れている点は、1)初代ヒトBMECの形態および内皮トランスクリプトームプロファイル30;2)成熟したタイトジャンクションの存在。3)望ましいバリア特性。4)ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、E-およびP-セレクチン、CD99、黒色腫細胞接着分子(MCAM)、および活性化白血球細胞接着分子(ALCAM)を含む内皮接着分子の堅牢な発現22。したがって、このモデルは、免疫細胞とBMECとの間の相互作用を研究するのに特に有用である。EECM-BMEC様細胞の低分子トレーサーの透過性は、iPS細胞由来のBMEC様細胞について以前に報告されたものよりも高いが14,15、バリア特性は初代ヒトBMECについて記載されたものと非常によく比較される。この類似性は、EECM−BMEC様細胞がBBBの良好なインビトロモデルである可能性が高いことを示している。生理学的条件下でのEECM-BMEC様細胞でのE-セレクチン発現は、このモデルを使用して、in vivoで構成的なE-セレクチン発現を欠く非炎症性BBBを研究する場合、考慮に入れる必要があります31。以前の研究では、EECM-BMEC様細胞が、破壊されたタイトジャンクションに関してMS患者の脳で観察されるように、BBBを表現コピーできることを示しました。これは、小分子のより高い透過性および機能的接着分子の発現の増加をもたらし、BMEC様細胞32を横切る免疫細胞の接着および遊走の増加を媒介する。さらに、Wnt/β-カテニンシグナル伝達の活性化が、MS由来のEECM-BMEC様細胞におけるタイトジャンクションの破壊およびVCAM-1発現の増加を改善できることを示した32。これらの結果は、このモデルがMSなどの神経免疫疾患におけるBBBの役割を研究するのに実際に有用であることを示しています。
まとめると、EECM-BMEC様細胞は、BBBレベルでの病態生理学的メカニズムを深く理解し、BBB安定化のための新しい治療標的を開発するためのツールとして有望なツールです。将来的には、このモデルは、より広範な疾患におけるBBB機能障害の研究に適用でき、新しい治療アプローチへの道を開く可能性があります。

中枢神経系(CNS)の神経血管ユニット(NVU)は、高度に特殊化された微小血管内皮細胞(EC)、内皮基底膜に埋め込まれた周皮細胞、実質基底膜、星状細胞末端で構成されています1。NVU内では、脳微小血管内皮細胞(BMEC)が血液脳関門(BBB)を形成する重要な構成要素です。BMECは複雑で連続的なタイトジャンクションを形成し、末梢臓器の微小血管ECと比較して非常に低いpinocytotic活性を有するため、BBBは水溶性分子のCNSへの自由な傍細胞拡散を阻害することができる。BMECによる特定の流入トランスポーターおよび排出ポンプの発現は、CNS2からの栄養素および有害分子のそれぞれ取り込みおよび輸出を確実にする。さらに、BBBは、CNS3への免疫細胞輸送に不可欠な低レベルの内皮接着分子を発現することにより、CNSへの免疫細胞の侵入を厳密に制御します。生理学的条件下では、細胞間接着分子-1(ICAM-1)や血管細胞接着分子-1(VCAM-1)などのBMECの表面上の接着分子の発現レベルは低いですが、これらのレベルは一部の神経障害で増加します2。BBBの形態学的および機能的破壊は、脳卒中4、多発性硬化症(MS)5、およびいくつかの神経変性疾患などの多くの神経疾患で報告されています6、7、8。生理学的および病理学的条件の両方におけるBMECの細胞的および分子的特性の詳細な調査は、BBBを標的とする新しい治療戦略を特定するためのアプローチです。
最近まで、一次または不死化されたヒトおよびげっ歯類のBMECがBBBの研究に使用されていました。しかしながら、BBBの動物モデルに基づく結論がヒトBBBに容易に適用できるかどうかは、接着分子および溶質キャリアタンパク質を含むいくつかの重要な分子の発現がヒトおよびげっ歯類の間で異なるため、不明である9,10。hCMEC/D3のようなヒトBMEC株は適切なレベルの接着分子を発現しますが11、これらの不死化BMECは一般に複雑なタイトジャンクションと堅牢なバリア特性を持っていません12。初代ヒトBMECはバリア機能の研究に有用ですが13、すべての研究者がすぐに利用できるわけではありません。さらに、患者からの一次BMECは、特定の臨床条件下でのみ行われる脳生検または手術によって収集する必要があるため、取得が困難な場合があります。
幹細胞技術の最近の進歩により、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)などの幹細胞源から生じるさまざまなヒト細胞タイプの分化が可能になりました。hiPS細胞由来モデルにより、患者由来サンプルを用いた病態生理学的モデルの構築が可能です。いくつかのhiPS細胞由来の細胞タイプを組み合わせて、生理学的条件をよりよく模倣する自家共培養またはオルガノイドを確立することができます。いくつかの広く使用されているプロトコル14,15,16,17,18,19は、BBB特異的トランスポーターおよび排出ポンプの発現を有する堅牢な拡散障壁特性を有し、低分子の傍細胞拡散、分子輸送機構、および脳への薬物送達を研究するのに有用であるhiPSc由来BMEC様細胞を分化させるために使用され得る20,21。.しかし、以前の研究では、広く使用されているhiPS細胞由来のBMEC様細胞は、免疫細胞とBBB22との間の相互作用を媒介するVCAM-1、セレクチン、ICAM-2などの重要な内皮接着分子の発現を欠いていることが示されている。さらに、以前のhiPS細胞由来のBMECは、転写レベルで内皮および上皮の混合特性を示すことが報告されています23。そこで、形態、バリア特性、内皮接着分子発現に関して、ヒト初代BMECに似たBMEC様細胞にhiPS細胞を分化させる新しいプロトコルである拡張内皮細胞培養法(EECM)を開発しました。このプロトコルでは、hiPS細胞を成熟免疫表現型を示すBMEC様細胞に分化させるための詳細な方法論的手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>0.22 mm シリンジ フィルター</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離管</td><td>ファルコン</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m Falcon 細胞ストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 丸底チューブ</td><td>SPL</td><td>40005</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート、丸底</td><td>SPL</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ml</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>オールインワン蛍光顕微鏡</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (503)、無血清</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)、7.5% in dPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere 希釈バッファー</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-07183</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>チャンバースライド</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td></td></tr><tr><td>ヒト胎盤由来コラーゲンIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Corning 組織培養プレート (12ウェル)</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Corning 組織培養プレート (6 ウェル)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>クライオチューブインナーキャップ 2.0 mL</td><td>Watson</td><td>1396-201S</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)、滅菌済み</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (13)、 [+] 4.5 g/L D-グルコース、[-] L-グルタミン、[-] ピルビン酸</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's (d) PBS(カルシウム、マグネシウム不使用)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」S medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>EasySepFITC Positive Selection Kit II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18558</td><td></td></tr><tr><td>EasySepMagnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸溶液0.02% in DPBS</td><td>Sigma</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified</td><td>Thermoフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿からのフィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17144002</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ソフトウェア (バージョン 2.0.0)</td><td>画像 J、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo バージョン10</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>ヒト内皮血清フリー培地 (hESFM)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>ヒト線維芽細胞増殖因子 2 (FGF2)</td><td>Tocris</td><td>233-FB-500</td><td></td></tr><tr><td>iPS ヒト誘導多能性幹細胞</td><td>理研 RBC</td><td>HPS1006</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩 (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15160-047</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸 セスキマグネシウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM (1003)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル、成長因子低減</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (1003)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus-cGMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-100-0276</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1コンプリートキット(基礎培地プラス53サプリメント)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ミリポア</td><td>104005</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIFN-γタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554603</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト TNF-α タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>210-TA-020</td><td></td></tr><tr><td>ROCK阻害剤 Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>FEATHER</td><td>2975-11</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk</td><td>BD Biosciences</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム(NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムピルビン酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェル、PC メンブレン、0.4 mm、12 mm、TC 処理</td><td>コーニング</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン XF</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>078180</td><td></td></tr><tr><td>水、滅菌、細胞培養</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>W3500</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype

血液脳関門(BBB)機能障害は、中枢神経系(CNS)に影響を与える多くの神経変性疾患および神経炎症性疾患の病理学的特徴です。疾患関連のBBBサンプルへのアクセスが限られているため、BBBの機能不全が疾患の発症の原因なのか、それとも神経炎症性または神経変性プロセスの結果なのかはまだよくわかっていません。したがって、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、健康なドナーと患者から in vitro BBBモデルを確立し、個々の患者からの疾患特異的BBB特性を研究する新しい機会を提供します。hiPS細胞から脳微小血管内皮細胞(BMEC)様細胞を誘導するためのいくつかの分化プロトコルが確立されています。特定の研究課題を考慮することは、それぞれのBMEC分化プロトコルを正しく選択するために必須です。ここでは、hiPS細胞を成熟免疫表現型を持つBMEC様細胞に分化させるために最適化され、免疫細胞とBBBの相互作用の研究を可能にする拡張内皮細胞培養法(EECM)について説明します。このプロトコルでは、hiPS細胞はまずWnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化することにより内皮前駆細胞(EPC)に分化します。得られた培養物は平滑筋様細胞(SMLC)を含み、内皮細胞(EC)の純度を高め、BBB特異的特性を誘導するために順次継代されます。EECM-BMECとこれらのSMLCまたはSMLCからのコンディショニング培地との共培養により、EC接着分子の再現性、構成的、およびサイトカイン調節された発現が可能になります。重要なことに、EECM-BMEC様細胞は初代ヒトBMECに匹敵するバリア特性を確立し、すべてのEC接着分子の発現により、EECM-BMEC様細胞は他のhiPS細胞由来の in vitro BBBモデルとは異なります。したがって、EECM-BMEC様細胞は、BBBのレベルで疾患プロセスの潜在的な影響を調査するための選択モデルであり、免疫細胞の相互作用にパーソナライズされた方法で影響を与えます。

透過性アッセイ フルオレセインナトリウムの透過性は、15、30、45、および60分で下部チャンバーから採取した培地の蛍光強度を測定することによって計算した。各時点で合計150 μLの培地をサンプリングし、不足している容量の150 μLをhECSR培地に置き換えます。蛍光プレートリーダー(485 nm励起/530 nm発光)を使用して蛍光強度を読み取り、前述の式18 を使用して正しいシグナル、クリアランス体積、および透過性を計算します(表2)。フルオレセインナトリウムの蛍光強度が時間の経過とともに増加するかどうかを確認することをお勧めします。再現性を確保するために、1回のアッセイに複数のフィルター(少なくとも3倍)を使用する必要があります。健康な対照由来のEECM-BMEC様細胞の場合、フルオレセインナトリウム(376 Da)の透過性は0.3 x 10-3 cm / min未満である必要があります。コンフルエントなEECM-BMEC様細胞単層の形成を確認するには、透過性アッセイで使用される各フィルターのEECM-BMEC様細胞の接合タンパク質に対する免疫蛍光染色をこのアッセイに続いて実行する必要があります。
免疫蛍光染色 クローディン-5、オクルージン、VE-カドヘリン1などのEECM-BMEC様細胞接合分子の免疫蛍光染色を使用して、細胞形態と連続および成熟接合の存在を評価しました(図4)。フィルターインサートのメンブレン上のEECM-BMEC様細胞の単層を冷メタノール(-20°C)で20秒間固定し、ブロッキングバッファーでブロックし(表1)、一次抗体と二次抗体とともにインキュベートしました。EECM-BMEC様細胞は、BMECs27の特徴である紡錘体状形状およびジグザグ形状接合部を示した。SMLC由来のコンディショニング培地で希釈した腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターフェロンγ(INF-γ)(0.1 ng/mL TNF-α + 2 IU/mL IFN-γ)などの炎症誘発性サイトカインでチャンバースライドに播種したEECM-BMEC様細胞を刺激すると、ICAM-1やVCAM-1などの接着分子の発現がアップレギュレートされました28 (図5)。α平滑筋アクチン(SMA)、カルポニン、平滑筋タンパク質22-アルファ(SM22a)29を含む平滑筋細胞マーカーの代表的な画像を 図6に示します。チャンバースライドに播種したSMLCを4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、ブロッキングバッファーでブロッキングした後、一次抗体と二次抗体でインキュベートしました。
EECM-BMEC様細胞による細胞表面接着分子発現のフローサイトメトリー解析 EECM-BMEC様細胞における内皮接着分子の細胞表面発現についての代表的な結果を 図7に示す。TNF-αやINF-γなどの炎症誘発性サイトカインによる刺激は、ICAM-1、VCAM-1、P-セレクチンなどのいくつかの接着分子の細胞表面発現をアップレギュレートしました。内皮VCAM-1細胞表面発現を増強したSMLC馴化培地を用いてEECM-BMEC様細胞を培養する。VCAM-1細胞表面発現の誘導の効果は、SMLC馴化培地のバッチ間で異なり得る。どのバッチがVCAM-1の適切な発現を誘導するかを検証するために、SMLCを区別する際には、同じhiPS細胞源に由来するSMLCから採取したコンディショニング培地の複数のバッチを保存することをお勧めします。
静置条件下での免疫細胞接着アッセイ 付着した免疫細胞の数は、EECM-BMEC様細胞の表面上の機能的接着分子の発現量と相関した。炎症性サイトカインによる刺激は、内皮接着分子の発現をアップレギュレートし、EECM-BMEC様細胞単層に接着する免疫細胞数の増加を促進しました(図8)。今回の実験では、EECM-BMEC様細胞上の接着分子の機能性が実証され、免疫細胞とECの相互作用の研究に適したモデルとなっています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig02.jpg"> 図2:CD31+ ECの精製。 MACSの前(ステップ1.4.7)および後(ステップ1.4.14)の細胞集団のECおよびFITC標識CD31染色の散乱ゲーティングからの代表的なフローサイトメトリーデータのドットプロット。MACSは、集団中のCD31+ EPCの純度を向上させます。略語: SSC = 側方散乱;FSC = 前方散乱;FITC=フルオレセインイソチオシアネート;MACS = 磁気活性化細胞ソーティング。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig03.jpg"> 図3:フルオレセインナトリウムの生の蛍光強度から計算されたEECM-BMEC単層透過性(10-3 cm / min)。クリアランス体積の線形勾配は、各フィルタの線形回帰を使用して計算されます(図3A)。フルオレセインナトリウムの透過性は、2つの式を使用して計算されます(図3B)。(A)クリアランス体積対時間の線形勾配は、フィルタ1(mc1)とブランクフィルタ(mf)の線形回帰を用いて計算した。なお、mc1およびmfは、それぞれXc1およびXfの係数である。(b)mcおよびmfを用いたフルオレセイン透過性(Pe)の算出式(化学式1)。Pe単位は、フィルターの表面積を用いて換算した(式2)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig04.jpg"> 図4:EECM-BMEC様細胞は成熟細胞接合部を示す。 インサートフィルターの膜上で増殖したEECM-BMEC様細胞におけるクローディン-5、オクルージン、またはVE-カドヘリン(赤色)の免疫蛍光染色。核は、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(青色)を用いて染色した。染色は、透過性アッセイに使用したのとまったく同じフィルターインサートで実施しました。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig05.jpg"> 図5:EECM-BMEC様細胞による内皮接着分子の発現。 免疫蛍光染色は、SMLC由来のCMの存在下でフィルターインサートの膜上で増殖したEECM-BMEC様細胞に対して実施されました。 ICAM-1またはVCAM-1(赤)の免疫染色は、非刺激および1 ng/mL TNF-α + 20 IU/mL IFN-γ刺激EECM-BMEC様細胞について示されています。核はDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig06.jpg"> 図6:SMLCの特性評価。 チャンバースライド上で増殖させたSMLCのα平滑筋アクチン(SMA)、カルポニン、または平滑筋タンパク質22-アルファ(SM22a)(赤)の免疫細胞化学を示します。核はDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig07.jpg"> 図7:EECM-BMEC様細胞における接着分子の内皮細胞表面発現。 EECM-BMEC様細胞におけるEC表面接着分子発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。EECM-BMEC様細胞は、SMLC由来の馴化培地を用いて培養した。ヒストグラムオーバーレイの青、赤、および灰色の線は、それぞれ非刺激(NS)条件、1 ng/mL TNF-α + 20 IU/mL IFN-γ刺激条件、およびアイソタイプコントロールを示しています。細胞間接着分子1(ICAM-1)、ICAM-2、血管細胞接着分子1(VCAM-1)、P-セレクチン、E-セレクチン、CD99、および血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM-1)を含む内皮接着分子の細胞表面発現を評価した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig08.jpg"> 図8:EECM-BMEC様細胞への免疫細胞の接着 。 (A)非刺激(NS)および0.1 ng/mL TNF-α + 2 IU/mL IFN-γ刺激(TNF-α + IFN-γ)EECM-BMEC様細胞単層上に蛍光標識された接着免疫細胞の画像。画像は井戸の中心に対応しています。スケールバー = 50 μm。 (B)NSおよびTNF-α+IFN-γ刺激EECM-BMEC様細胞の単層上の蛍光標識免疫細胞の数。接着免疫細胞/視野(FOV)は、FIJIソフトウェアを使用して自動的にカウントされました。ドットは結合したT細胞の数を表す。バーは平均値を示し、エラーバーは8回の試行の標準偏差(SD)を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:アッセイのための特定の試薬の詳細。 各特定の試薬の成分の名前と正確な量が説明されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table1_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:Pe計算用蛍光プレートリーダーの生データの例。太字の数字は、プレートリーダーで測定したフルオレセインナトリウムの生蛍光強度です。データを正確に解析するためには、生の値からバックグラウンド信号を除去し、ボトムチャンバのサンプリングに起因する信号損失を考慮し、その後信号を補正する必要があります。例えば、バックグラウンドを差し引くと、15分サンプルは100相対蛍光単位(RFU)のシグナルを示し、30分サンプルは150RFUのシグナルを示す。30分で補正された信号は(150 RFU + 15分での欠損値[100 RFU x 150 μL/1,500 μL])で、150 RFU + 10 RFU = 160 RFUです。クリアランス体積=(1,500 x [S B,t])/(S T,60分)、ここで、1,500はボトムチャンバの容積(1,500 μL)、S B,tは時刻tにおける補正信号、ST,60分は60分におけるトップチャンバの信号である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table2_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、多能性幹細胞を脳微小血管内皮細胞(BMEC)様細胞に分化させるプロトコルである拡張内皮細胞培養法(EECM)について述べる。これらの細胞は内皮細胞接着分子発現を示すため、in vitroで免疫細胞相互作用を研究するのに適したヒト血液脳関門モデルです。

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous ...

これは、ヒト誘導多能性幹細胞を、良好なバリア特性、成熟タイトジャンクション、および中枢初心者系への免疫細胞移動を媒介する内皮細胞接着分子の発現を有する脳微小血管内皮細胞に分化させることを可能にする最初のプロトコルである。EECM-BMEC様細胞は、患者に由来する血液脳関門モデルを用いて、血液脳関門を横切る免疫細胞の移動を完全に自家的に研究することを可能にする。MS患者のヒト誘導多能性幹細胞をEECM-BMEC様細胞に分化させることで、MS患者のこれらのin vitroモデルにおける固有のバリア欠陥を特定することができました。したがって、この文化的方法は、将来、これらの障害されたバリア特性の根底にある分子経路を特定することを可能にします。これらの方法は、血清形態およびCNSへの免疫細胞浸潤がこれらの病因、例えば脳卒中または神経感染にとって重要であるより広範な疾患に適用することができる。この手法を初めて試すときは、同じ量のセル材料を使用してください。シード密度はこのプロトコルの成功の鍵であり、使用するクローンに応じて調整する必要があります。手順のデモンストレーションは、私の研究室の助教である松尾欣也さんです。内皮前駆細胞培養の5日目に、ウェルから培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの解離試薬を加える。プレートを摂氏37度で6〜8分間インキュベートします。マイクロピペットを使用して、細胞を解離および単離化します。次に、細胞懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーに通して、10ミリリットルのDMEM / F-12 10培地を含む50ミリリットルのチューブにろ過します。消化反応を止めるには、DM DMEM / F-12 10培地を50ミリリットルマークまで加えます。細胞を数えるために10マイクロリットルを徹底的にピペットで入れて予約する。50ミリリットルのチューブを200gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを10ミリリットルのDMEM/F-12 10培地で再懸濁します。細胞懸濁液を新しい15ミリリットルのチューブに移します。200gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離し、細胞を再びペレット化します。次いで、細胞ペレットをフローバッファー1に再懸濁する。次に、FCRブロッキング試薬を1対100の比率で添加し、5分間インキュベートします。次いで、1対200の比率で希釈したフルオレセインイソチオシアネートまたはFITC標識CD31抗体を添加する。懸濁液を暗所で摂氏20〜25度の温度で30分間インキュベートする。インキュベーションの最後に、10ミリリットルのフローバッファー1をサンプルに加え、フローサイトメトリー分析用に10マイクロリットルの懸濁液を予約して、CD31陽性細胞の画分を測定します。細胞を200gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離します。遠心分離後、1つの溶液をフローバッファーで細胞を再懸濁する。次に、細胞懸濁液100マイクロリットルあたり5マイクロリットルのFITC選択カクテルを追加します。ピペッティングによって溶液を完全に混合し、摂氏20〜25度の温度で15分間暗所でインキュベートします。次に、細胞懸濁液100マイクロリットルあたり5マイクロリットルの磁性ナノ粒子を追加します。混合物をよくピペットで入れ、摂氏20〜25度で10分間暗所でインキュベートします。細胞懸濁液を5ミリリットルのフローサイトメトリーチューブに移し、フローバッファー1を加えて総容量2.5ミリリットルにします。次に、フローサイトメトリーチューブを磁石に5分間入れます。連続運動で、磁石を反転させ、FITC CD31抗体非標識細胞を含む細胞懸濁液をデカントします。磁石とチューブを2〜3秒間逆さに保ち、残りの液体を取り除きます。チューブを直立位置に戻す前に、チューブの端にある液滴を吸引します。磁石からフローサイトメトリーチューブを取り出し、2.5ミリリットルのフローバッファー1を加えて、残りのCD31陽性細胞を洗浄します。細胞を2〜3回ゆっくりと上下にピペットで固定し、再懸濁します。次に、フローチューブを磁石に5分間入れます。洗浄を少なくとも4回繰り返して、チューブからFITCのCD31非標識細胞を除去した。フローチューブを磁石から取り外し、精製したCD31陽性細胞を所望の量の適切な培地で再懸濁します。懸濁液の2つの10マイクロリットルアリコートを予約し、1つは細胞計数用、もう1つはフローサイトメトリー分析を実行して、磁気後活性化細胞選別サンプル中のCD31陽性細胞の純度を評価します。内皮細胞集団および非内皮細胞集団を含む6つのウェルプレートからHECSR培地を除去します。次に、各ウェルに1ミリリットルの解離試薬を加えます。顕微鏡下で細胞の形態を注意深く観察します。内皮細胞が明るく丸く見えたら、通常2〜5分以内に、プレートの端をタップして内皮細胞を切り離します。非内皮細胞はプレートに付着したままである。マイクロピペットを使用して、剥離した内皮細胞を非内皮細胞を乱すことなく慎重に収集し、解離試薬1ミリリットルあたり4ミリリットルのDMEM/F-12 10を含む15ミリリットルまたは50ミリリットルの遠沈管に移します。次に、残りの付着した非内皮細胞を含むウェルに2ミリリットルのHECSR培地を加えて、平滑筋のような細胞またはSMLCを確立し、プレートをインキュベーターに入れます。内皮細胞懸濁液を遠沈管に移します。十分に混合し、細胞計数のために10マイクロリットルの懸濁液を予約します。残りの細胞を200 gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離します。次に、2ミリリットルのHECSR培地を追加します。次に、予め調製したコラーゲンコード化6ウェルプレートからコラーゲン用溶液を取り出し、各ウェルに2ミリリットルの内皮細胞懸濁液を加える。次に、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素中でインキュベートします。クローディン-5、オクルージンおよびVE-カドヘリンを含むEECM-BMEC様細胞接合分子の免疫蛍光染色を使用して、細胞形態および連続および成熟接合の存在を評価しました。SMLC由来の馴化培地で希釈した腫瘍壊死因子αやインターフェロンガンマなどの炎症誘発性サイトカインを用いてチャンバースライド上に播種したEECM-BMEC様細胞を刺激すると、ICAM-1やVCAM-1などの接着分子の発現がアップレギュレートされました。アルファ平滑筋アクチン、カルポニン、平滑筋タンパク質22αを含む平滑筋細胞マーカーの代表的な画像をここに示す。腫瘍壊死因子αやインターフェロンガンマなどの炎症誘発性サイトカインによるEECM-BMEC様細胞の刺激は、ICAM-1、VCAM-1、およびP-セレクチンを含むいくつかの接着分子の細胞表面発現をアップレギュレートしました。また、炎症性サイトカインによる刺激は、内皮接着分子の発現をアップレギュレートし、EECM-BMEC様細胞単層に接着する免疫細胞数の増加を促進しました。 EECM-BMEC様細胞は、血液脳関門レベルでの病態生理学的メカニズムの深い理解や、血液脳関門安定化のための新しい治療標的を開発するための貴重なツールとしても有望です。

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JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオは、人工多能性幹細胞の脳内皮細胞への分化を誘導するプロトコルを示しています。...

人工多能性幹細胞からの脳内皮細胞の作製

このビデオは、ヒト多能性細胞がミクログリア様細胞に分化する手順を示しています。このプロセスには、胚様体を形成し、それらをコーティングされたウェルに移し、特定の成長因子を使用して原始的なマクロファージ前駆体への分化を誘導し、最終的にミクログリア様細胞に分化することが含まれます。...

ヒト人工多能性幹細胞のミクログリア様細胞への分化

このビデオでは、ヒトiPS細胞を脳の微小血管内皮細胞に分化するための多段階のプロセスを示しています。得られた分化細胞は、タイトジャンクションを特徴とする脳の微小血管内皮細胞に密接に類似しているため、脳疾患の研究に最適です。...

ヒト人工多能性幹細胞の脳微小血管内皮細胞への分化

直接の系譜 - 再プログラミングのための脳常駐細胞を標的とすることは、脳の修復のための新たな視点を提供しています。ここでは、成人の大脳皮質から脳常駐周皮細胞について濃縮文化を準備し、転写因子Sox2のとASCL1のレトロウイルス媒介発現によって誘導神経細胞にこれらを変換する方法のプロトコルについて説明します。...

誘導された神経細胞への成人の脳の周皮細胞由来細胞の系統の再プログラミング

ヒトが誘導する多能性幹細胞（hiPSC）は、薬物および化学物質のスクリーニングならびに神経毒性を含む毒性試験のための新しいインビトロモデルの開発のための強力なツールと考えられている。ここでは、hiPSCをニューロンおよびグリアに分化させるための詳細なプロトコールが記載されている。...

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

血液脳関門(BBB)は、多細胞神経血管の単位は、密接に脳の恒常性を調節します。ヒトiPSCと臓器オンチップ技術を組み合わせることで、疾患モデリングやCNS薬物浸透性予測に適したパーソナライズされたBBBチップを生成しました。BBBチップの生成と動作に関する詳細なプロトコルについて説明します。...

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo...

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。...

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro...

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の造血前駆細胞(HPC)をオルガノイド開発に組み込むことにより、常在性ミクログリアを持つヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。...

ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

学ぶ、ヒトiPS細胞を脳微小血管内皮細胞様細胞へ分化させるEECMプロトコル。血脳関門の免疫細胞相互作用を研究するモデルとして活用でき、多発性硬化症などの神経疾患の病態理解に貢献します。

ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

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