Name: トランスジェニック ネッタイシマカ の適応コストの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶ、トランスジェニックAedes aegyptiの適応コスト評価法。産卵数、翅サイズ、寿命などの適応パラメータを定量化し、遺伝子改変蚊の生態学的影響を解析する手法を解説します。

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著者らは、このプロトコルのサポートについて、ミズーリ大学のBill Reid博士とAlexander Franz博士に感謝します。また、著者らは、R解析を支援してくださったNIH/NIAIDのBenjamin Krajacich博士にも感謝します。この研究は、NIH、助成金番号R01 AI130085(KEO)、およびNIH / NIAIDの学内研究プログラムAI001246(EC)部門によって資金提供されました。

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著者は何も開示していません。

Ae. aegyptiの適応度研究は、この原稿で述べられているように、トランスジェニックカーゴ(遺伝子駆動要素など)または遺伝子ノックアウトに関連する適応度コストを評価するために、実験室でよく行われます。しかし、これらの研究は、ボルバキアに感染した30,31、殺虫剤耐性の32,33、アルボウイルスに感染した34など、Ae. aegyptiのグループの健康状態を評価することを目的としたさまざまな目的で実施される可能性があります。したがって、これらの実験は幅広い目的に使用できるため、プロトコルはシンプルで効率的、かつ再現性のあるものを目指していました。
研究者は、実験室で収集されたフィットネスデータを野外蚊に外挿する際には注意を払う必要...

適者生存とは、ダーウィンの考えで、自分の環境に最も適した遺伝子を持つ個人は、その遺伝子を次の世代に受け継ぐというものです1。これは、彼らの遺伝子が生き残るかどうかを決定するのはフィットネスであることを意味します。この150年以上の歴史を持つ概念は、おそらく、遺伝子組み換え蚊の遺伝子ドライブを成功させるための最も重要な決定要因です。遺伝子ドライブ、または利己的な遺伝的要素の超メンデル遺伝パターンは、それが集団2を通じて広がるのを可能にし、遺伝的害虫管理3のために探求されています。ベクターコントロールの文脈では、この戦略は、野生型(WT)の節足動物を病原体に耐性のある節足動物に置き換える(集団改変)か、それらをすべて一斉に排除する(集団抑制)かのいずれかを目指しています4。しかし、トランスジェニック蚊は、WT蚊と比較して適応度コスト(遺伝的負荷とも呼ばれる)を示すことが多く、これは、トランスジェニック蚊が彼らを凌駕できる集団で失われることを意味します。したがって、導入遺伝子を遺伝子ドライブシステムと結合させることは、適応度コストを相殺し、導入遺伝子を典型的なメンデル遺伝から予想されるよりも高いレベルで集団全体に押し出すために必要です4。
蚊媒介生物種全体の実験室研究は、導入遺伝子がしばしば適応度を示すことを示しています5,6,7。たとえば、Irvin et al. Drosophila actin 5Cまたは合成3XP3プロモーターの下で増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)またはトランスポゼース遺伝子を発現するように操作されたネッタイシマカ(ae.)の様々な生命パラメータを測定し、それらを野生型のオーランド株(それらが由来したのと同じ遺伝的背景)と比較した5。最も注目すべきは、すべてのトランスジェニック株が生殖適性を有意に低下させたことです5。導入遺伝子に依存して、マラリア原虫の発達を阻害する導入遺伝子を発現する一部のハマダラカ(An.)蚊も適応度コストを示しました6。具体的には、構成的または血粉誘導性プロモーターの下でハチ毒ホスホリパーゼ(PLA2)を発現するAn. stephensiは、対照と比較して産卵数が有意に少なかった6。また、これらの著者らは、異なる導入遺伝子であるSM1ドデカペプチド四量体を発現するトランスジェニックハマダラカが適応度コストを示さなかったことを発見し、導入遺伝子による適応コストは、少なくとも部分的には産生されるトランスジェニックタンパク質の効果に依存していると結論付けた6。実際、適応度コストは、実験室で飼育された系統における導入遺伝子産物、位置効果、オフターゲット効果、挿入突然変異誘発、または近親交配効果に起因する可能性がある7。したがって、遺伝子ドライブは、これらの導入遺伝子による適応コストを相殺するのに十分な堅牢性を備えている必要があり、同時にドライブ自体をブロックする挿入や欠失(インデル)の発生も回避する必要があります。
発達または生殖フィットネスのコストは、実験室またはケージの研究7で測定できますが、フィールドの未知の要因も影響を与える可能性があるという注意点があります。それにもかかわらず、遺伝子ドライブプログラムなどの遺伝子組み換え蚊の放流を計画または評価する際の重要な最初のステップであり、トランスジェニック系統が次の世代にわたって持続するかどうかを判断します。例えば、Hammond et al. 評価 ガンビアのCRISPR/Cas9ベースの遺伝子ドライブは、女性の生殖能力に必要な遺伝子を破壊することを意図しています8。著者たちは、少なくとも25世代にわたって維持されたケージの研究を通じて、蚊がCRISPRを標的とした切断をブロックし、女性の生殖能力を回復させる遺伝子駆動抵抗性対立遺伝子を引き起こしたことを発見しました8。彼らのモデリング努力は、遺伝子ドライブに対してヘテロ接合体である女性の生殖能力が、シミュレートされた条件での遺伝子ドライブの固定に最も劇的な影響を与えたことを示唆しました8。これと同じ方針で、Ae. aegypti(ヒッグス白眼科、HWE)は、異なるプロモーターまたは異なる遺伝子間遺伝子座で自律的な遺伝子ドライブカセットを発現するように操作され、シミュレートされた集団で異なる遺伝子ドライブ固定率を示しました9。著者らは、MGDrivEモデリング10を用いて、測定されたインデル形成率、母体への影響、および実験室で収集された生命パラメータデータを組み合わせて、シミュレートされた条件9において、蚊の適応度が遺伝子ドライブの持続性に最も強く影響することを発見した。遺伝子ドライブ効率を損なう可能性が最も高い適応度コストは、内因性ドライブ自体ではなく、体細胞Cas9(過剰)発現または特にヘテロ接合体において標的とされる遺伝子に起因する11,12,13,14,15,16,17。
その重要性を考えると、適応度はトランスジェニック系統がその後の世代にわたって持続する能力にとって重要な要素であり、導入遺伝子に関連するあらゆる生理学的効果の指標として使用することができます。例えば、オフターゲット効果は、フィットネスコストと関連している可能性がある。この場合、トランスジェニック系統を数世代にわたって戻し交配することが推奨される。さらに、トランスジェニック集団が現実世界でどの程度競争できるかを調査するために、トランスジェニックラインをフィールド集団を反映するラインと交差させることも必要になる場合があります。適応度コストを定量化して比較できるようにするために、この原稿では、Ae. aegypti蚊の一般的な生活史形質を測定するための簡単なプロトコルを提供し、特に導入遺伝子に関連する適応度コストに重点を置いて、そのような研究をより簡単に再現できるようにしています。プロトコルには、繁殖力、生殖能力、性比、生存率、発育時間、男性の貢献、および成人の長寿が含まれます。翼の長さと面積の測定は、胸部の長さ18,19および体の大きさの測定値と相関するため、フィットネス測定値としても選択されました。これは、血液ミールのサイズ、繁殖力、および免疫力20,21に直接関連しています。フィットネスを評価する方法はたくさんありますが、これらのパラメーターが選択されたのは、生殖の成功を反映しており、測定が簡単で、文献で一般的に報告されているためです。

<table><tbody><tr><td>1オンス 半透明のプラスチックスフレカップ</td><td>WebstaurantStore</td><td>301100PC</td><td></td></tr><tr><td>2オンス 半透明のポリスチレンスフレカップ</td><td>WebstaurantStore</td><td>760P200N</td><td></td></tr><tr><td>3 mL プラスチックピペット&nbsp;</td><td>コーニン</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>50mLコニカルチューブ任意の</td><td>ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>64オンスホワイトダブルポリコート紙フードカップ</td><td>WebstaurantStore</td><td>999SOUP64WB</td><td>蚊の囲い</td></tr><tr><td>65mmレンズ用&nbsp;</td><td>Canon</td><td>MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo</td><td>Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; 翼や卵の紙の撮影には、他のカメラでも十分でしょう</td></tr><tr><td>Aedes aegypti&nbsp;蚊BEI</td>卵<td></td><td>として複数の株が利用できる</td><td></td></tr><tr><td>人工膜フィーダー</td><td>https://lillieglassblowers.com/</td> <td>Meduim膜フィーダー、カスタムメイド、33ミリメートル</td><td>ケムグラスも提供していますが、サイズは私たちにとって間違っています。うちのものは約3cm?</td></tr><tr><td>ATP</td><td>MP バイオメディカル</td><td>ICN15026605</td><td>任意の良質の ATP、10mM フィルター滅菌アリコート -20 オート</td></tr><tr><td>クレーブ</td><td></td><td></td> Canon EOS 7D カメラ<td>を孵化するための滅菌水</td></tr><tr><td>用&nbsp;</td>翼や卵の紙を撮影するための<td>キヤノン</td><td>3814B004</td><td>、ただし、他のカメラはおそらく十分な</td></tr><tr><td>除細動羊の血液&nbsp;</td><td>コロラド血清株式会社</td><td>60 ml、2週間ごとに</td><td>https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated</td></tr><tr><td>デュアルグースネック顕微鏡イルミネーター</td><td>ドラン・ジェンナー ファイバーライト 180</td><td>181-1 システム</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>デュモン</td><td>5SF</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td></td><td>omnisorb ii</td><td>4インチ 不織布スポンジ</td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>ガラスペトリ皿、100 &times; 15 mm</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td>氷の上の蚊を麻酔/操作するための</td></tr>豚<tr><td>の腸</td>任意の<td>デリ</td><td></td>は<td>、我々は大量に購入し、分割し、洗浄し、50ミリリットルの円錐</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>氷<tr><td>の氷のバケツ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipeで-20で~4X12 "の小さなアリコートで保存します</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Leica GZ4 StereoZoom microscope</td><td></td><td></td><td>for screening transgenic mosquitos (if applicable)</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>AIT 合成ブラシ&nbsp;</td><td>サイズ10-0</td><td>幼虫/蛹を操作するための(アマゾン)</td></tr><tr><td>パンティストッキング</td><td>ウォルマート</td><td>L'eggs Everyday</td><td>&nbsp;女性用 ナイロン <ストロング>プラス </ストロング> ニーハイ シアートゥ、16ペア(プラスカートンに適合)</td></tr><tr><td>鉛筆</td> 任意の<td>ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&deg; カートンの保管</td><td>ウォルマート</td><td></td><td>Sterilite 58 Qt 収納ボックス クリアベース 白い蓋 8 個セット</td></tr><tr><td>幼虫を育てるためのプラスチック容器</td><td>ウォルマート</td><td></td><td>Sterilite 28 Qt. 収納ボックス プラスチック、 ホワイト、</td></tr><tr><td>孵化幼虫用プラスチック容器</td>10個セット <td>ウォルマート</td><td></td><td>ステリライト 6 Qt. 収納ボックス プラスチック、ホワイト</td></tr><tr><td>ポリプロピレンクリアデリコンテナ&nbsp;</td><td>ウェブスタウラントストア</td><td>&nbsp;127DM12BULK</td><td>12オンス、または必要に応じて16オンス より大きな(127RD16BULK)</td></tr><tr><td>輪ゴム</td><td>オフィスマックス</td><td>&nbsp;#100736/#909606 /#3777415</td><td>12"、#64および#10</td></tr><tr><td>ゴムスト</td><td>ッパーVWR</td><td>217-0515</td><td>蚊の囲い込み用</td></tr><tr><td>角砂糖やレーズン</td><td></td><td></td><td></td>などの砂糖源</tr><tr><td>テトラミンフレーク食品</td><td>テトラミン</td><td>16106</td><td></td></tr><tr><td>tpsDig</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td> https://www.sbmorphometrics.org/ tpsUtil<td>でオンライン配布される無料の形態測定画像処理ソフトウェア</td></tr> <tr><td></td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td> オンラインで<td>配布される無料の形態測定画像処理ソフトウェア</td></tr> <tr><td>https://www.sbmorphometrics.org/ White organza fabric 8" &times; 8"</td> で入手可能です。<td>FabricWholesale.com&nbsp;</td><td>4491676</td><td>Joann Casa Collection Organza ファブリック by Casa Collection&nbsp;</td></tr><tr><td>ホイットマングレード1定性的濾紙&nbsp;</td><td>ホイットマン</td><td>1001-824</td><td>卵紙用。白い色は黒い卵を見やすくします。</td></tr></tbody></table>

トランスジェニック ネッタイシマカ の適応コストの定量化

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

トランスジェニック蚊は、野生型の蚊と比較して、しばしば適応度を示します。この点で、フィットネスコスト研究では、遺伝子組み換え蚊から生命パラメータデータを収集し、それらを同じ遺伝的背景からの導入遺伝子を欠く蚊と比較することが含まれます。この原稿は、ネ ッタイシマカの一般的な生活史形質(繁殖力、翼のサイズと形状、繁殖力、性比、生存率、発育時間、男性の寄与、成虫の寿命など)を測定する方法を示しています。これらのパラメータは、生殖の成功を反映し、測定が容易で、文献で一般的に報告されているために選択されました。代表的な結果は、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子駆動要素の単一挿入のいずれかに関連する適応コストを定量化します。生命パラメータデータの収集方法を標準化することは重要です。なぜなら、このようなデータは、研究間で生成されたトランスジェニック蚊の健康状態を比較したり、シミュレートされた野生型蚊の集団における導入遺伝子固定率をモデル化したりするために使用できるからです。このプロトコルはトランスジェニック ネッタイシマカに特異的ですが、このプロトコルは他の蚊の種や他の実験的治療条件にも使用できますが、特定の生物学的状況では特別な適応が必要になる可能性があることに注意してください。

上記のプロトコルに従って、2つの蚊系統の適応度を評価しました:(1)Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424)唾液タンパク質からのCRISPR/Cas9媒介ノックアウト、および(2)自律的なCRISPR/Cas9媒介遺伝子ドライブ9を発現するAe. aegypti系統。前者の場合、非相同末端結合経路(NHEJ)を利用して、D7L1遺伝子に特異的なsgRNAを胚にマイクロインジェクションした後に破壊を生成することにより、ホモ接合型のD7L1ノックアウトラインが確立されました。ヘテロ接合性のD7L1-KO蚊は、WTに4世代にわたって戻し交配した後、安定したホモ接合系統を生成して潜在的なオフターゲット効果を除去しました。後者の場合、ナノス(AAEL012107)またはインネキシン-4(AAEL006726)プロモーター(このプロトコルではそれぞれGD1およびGD2)のいずれかの下でCas9リボ核タンパク質を発現する遺伝子ドライブカセットを、前述のようにCRISPR/Cas9注入ミックスで胚を...

本プロトコルでは、 ネッタイシマカ の一般的な生活パラメータデータ(繁殖力、翅の大きさ、繁殖力、性比、生存率、発育時間、男性の寄与度、成体の寿命など)を測定する方法を説明しています。これらの測定値は、トランスジェニック蚊の適応度を評価するために使用できます。

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...

このプロトコルは、ネッタイシマカの適応度を反映した標準的な測定を示しており、これらの適応度パラメータは、繁殖の成功を反映し、測定が容易で、文献で一般的に報告されているために選択されました。まず、卵の紙を滅菌水に一晩置いて、トランスジェニック蚊と野生型の蚊を孵化させます。幼虫が自由に餌をやれるようにするには、魚のすりつらを数滴垂らします。成体が処女であることを確認するには、蛹が出てきたら性別で蛹を分離し、蛹をガラス顕微鏡スライドに移し、ティッシュで余分な水分を取り除いて蛹を固定します。2倍から4倍の倍率のステレオスコープの下で、先端の細かい絵筆を使用して、蛹を上向きに配置します。次に、尾を視覚的に分析して、生殖器葉の形状の違いを確認します。オスとメスの蛹を別々のウォーターカップに入れ、適切に封じ込めます。野生型またはトランスジェニック遺伝子駆動1匹または遺伝子駆動2匹の雄を処女野生型の雌と大量に交配するには、麻酔をかけた蚊を雄5匹対雌1匹の割合で、約150匹の蚊を含む蚊のカートンに加えます。2〜3日後、ケージに血液源を提供して、標準的な飼育方法に従ってメスに栄養を与えます。血液を与えられた女性と栄養を与えられていない女性を選別するには、腹部の充血を視覚的にスクリーニングし、部分的に栄養を与えていない女性、栄養を与えた女性、および男性を捨てます。充血したメスをそれぞれのケージに戻します。2〜3日後、鉛筆で事前にラベル付けされた濾紙で裏打ちされた50ミリリットルの円錐形チューブに個々の女性を入れます。すべてのチューブに5ミリリットルの水道水を入れます。レーズンまたは砂糖に浸したコットンボールの小片を各円錐形のチューブに置きます。女性を1〜2日間インセクターに放置し、産卵させます。次に、各紙の卵の数を数え、各紙で数えた卵の数をスクリーニングした女性の数で割った平均繁殖力を計算します。卵紙を乾燥させるには、チューブから水を排出し、それらをインセクターに戻します。完了した繁殖力研究から血液を与えられた雌を凍結するには、蚊のケージを摂氏マイナス20度に約15分間置きます。各蚊の左翼を解剖し、翼と胸部の関節を切除し、翼全体を取り除きます。鉗子を使用して、翼をスライドガラスの上に平らに置き、次に70%エタノールを含む15ミリリットルのストック溶液を1滴と食器用洗剤1滴をトランスファーピペットを使用してスライド上の翼に加えます。次に、カバースリップに80%グリセロールを1滴加え、エタノール石鹸液の翼の上に置きます。スライドに取り付けられた翼を65mmレンズのカメラで撮影します。TpsDigソフトウェアを使用して、ランドマークの2次元デカルト座標を特定します。原稿に記載されているRスクリプトを使用して、翼の長さと面積を計算します。翼の中心点から各ランドマークの平方距離の合計の平方

quantifying-fitness-costs-in-transgenic-aedes-aegypti-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルでは、とRNAiによる遺伝子サイレンシングを組み合わせる...

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

RIDL®(優勢致死性を持つ昆虫の放出)システムを用いてAedes...

ブラジルにおけるフィールドリリースのための遺伝子組み換え Aedes aegypti の大量生産

脂肪体は昆虫の中央代謝臓器です。様々...

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ボルバキアに感染しているネッタイシマカ蚊はアルボ ウイルスの伝達を抑制する自然集団にリリースされています。我々 は研究所適応と選択範囲を最小限に抑えるための対策を講じて実験およびフィールド ・ リリース、ボルバキア感染症研究室と後部Ae。...

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24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善

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アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

無菌昆虫技術(SIT)は、化学的防除に耐性がある可能性のある特定の医学的に重要な蚊の個体数を制御するために使用されます。ここでは、 ネッタイシマカ...

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ここでは、蛍光色素をマーカーとして用いた雄 のAedes aegypti の交配性を研究するためのプロトコルを提示する。雌の蚊は、交尾のためにマークされた男性と無印の両方の雄にさらされます。交配後、それらの精子は、交配パートナーを決定するために蛍光顕微鏡下で検査される。...

蛍光色素、ローダミンBを用いて、オス のアエデスアエジプティ 蚊の交配競争力を研究する

ここで報告されたプロトコルは、実験室に含まれる小さなケージ試験でベクター制御に向かう遺伝子組み換え蚊の性能を評価する3つの代替方法を示しています。各プロトコルは、蚊株クマ(遺伝子駆動または非遺伝子ドライブ)および測定されたパラメータの種類の特定の改変に合わせて調整されます。...

遺伝子組み換えアノフェリン蚊の小さいケージ実験室の試験

ここでは、CRISPR-Cas9技術を用いた蚊A . aegypti...

CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネ ッタイシマカ のゲノム編集

学ぶ、トランスジェニックAedes aegyptiの適応コスト評価法。産卵数、翅サイズ、寿命などの適応パラメータを定量化し、遺伝子改変蚊の生態学的影響を解析する手法を解説します。

トランスジェニックネッタイシマカの適応コストの定量化

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