Name: 力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶ 高速磁気ピンセットを用いた力に敏感なバイオ分子のナノメカニカル測定法。DNAヘアピンやSNARE複合体の動態解析により、メカノバイオロジーイベントの理解と力感受性タンパク質関連疾患の解明に貢献します。

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この研究は、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)の助成金(NRF-2022R1C1C1012176、NRF-2021R1A4A1031754、およびNRF-2021R1A6A1A10042944)の支援を受けました。S.-H.R.はNRF助成金(2021R1C1C2009717)の支援を受けました。

著者には、宣言する利益相反はありません。

本研究では、生体分子の構造変化を高い時空間精度で観察できる1分子力分光装置を導入しました。高速CMOSカメラは、1,280 x 1,024の解像度で1,200フレーム- 1を取得し、1.2kHzのビーズトラッキングを可能にします。ただし、現在、測定速度はビーズトラッキングソフトウェアによって制限されているため、高速測定ではROIは通常、より小さな領域に低下します。SLDの高出力は、最大数kHzの帯域幅までの高速ビーズイメージングに不可欠な明るい照明を提供します。さらに、ビームの空間コヒーレンスは、ビーズの周りに高コントラストの同心円状の回折リングを生成し(図1A、挿入図)、対称性に基づいてビードの位置を正確に決定することができます。
ビーズ−テザー構築物に及ぼされる磁力は、テザービーズ35、37、38のブラウン揺らぎ...

細胞は機械的刺激を積極的に感知し、反応します。そうすることで、多くの生体分子は力に依存する特性を示し、動的な構造変化を可能にします。よく知られている例としては、機械感受性イオンチャネルや細胞骨格要素があり、周囲の環境から細胞に重要な機械的情報を提供します。
また、独特の力を持つ性質を示す分子も、より広い意味で機械感受性と見なすことができます。例えば、核酸二本鎖の局所的な形成と融解、およびG-quadruplexなどの高次構造は、複製、転写、組換え、そして最近ではゲノム編集において重要な役割を果たします。さらに、シナプスコミュニケーションに関与するいくつかのニューロンタンパク質は、典型的な分子間相互作用のレベルを超える物理的な力を生成することによってそれらの機能を果たす。いずれの例を用いても、関与する生体分子のナノメカニクスを高い時空間精度で調べることは、関連するメカノバイオロジカルプロセスの分子メカニズムを明らかにする上で非常に有用であることがわかります1,2,3。
単一分子力分光法は、生体分子の機械的特性を調べるための強力なツールとして役立っています2,4,5,6。核酸やタンパク質の構造変化を力を加えると同時にモニタリングし、力依存性を調べることができます。よく知られている2つのセットアップは、光ピンセットと磁気ピンセット(MT)で、ミクロンサイズのビーズを使用して分子を操作します5,6,7,8。これらのプラットフォームでは、ポリスチレン(光ピンセット用)または磁気ビーズ(MT用)は、通常は二本鎖DNA(dsDNA)の短い断片でできている分子「ハンドル」を介して標的分子(核酸やタンパク質など)につながれています。次に、ビーズを動かして力を加え、画像化して、標的分子の構造変化を報告するビーズの位置を追跡します。光ピンセットと磁気ピンセットは、その用途ではほぼ互換性がありますが、力を制御するためのアプローチには重要な違いがあります。光ピンセットは、ビーズを所定の位置にトラップする本質的に位置クランプ装置であり、ターゲット構造の形状が変化すると、加えられる力が変動します。展開などによる伸展の増加は、テザーを緩めて張力を低下させ、逆もまた同様です。光ピンセットの力を制御するためにアクティブフィードバックを実装することができますが、MTは自然にフォースクランプデバイスとして動作し、永久磁石による安定した遠方界磁力を利用して、環境の摂動にも耐えることができます。
MTは、その長い歴史とシンプルな設計にもかかわらず、主に高速ビードトラッキングの技術的課題のために、高精度測定へのアプリケーションにおいて光ピンセットに遅れをとっています。しかし、最近では、いくつかのグループが共同でMT機器のハードウェアとソフトウェアの両方の多面的な改善を主導しています2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .本研究では、1.2kHzで動作するこのようなセットアップの例を紹介し、それを使用して力に敏感な生体分子のナノメカニカル測定を実行する方法について説明します。モデルシステムとして、DNAヘアピンと神経細胞SNARE複合体を用いて、ピコニュートンレジームにおけるそれらの速い構造変化を調べます。DNAヘアピンは、明確に定義された力範囲20,21で単純な2状態遷移を示すため、ピンセットセットアップの性能を検証するためのおもちゃモデルとして機能します。SNAREタンパク質は、膜融合22を駆動する力に敏感な複合体に集合するため、単一分子力分光法14、23、24、25によっても広く研究されています。データを分析し、熱力学と動力学に関する有用な情報を抽出するための標準的なアプローチが提示されています。この記事が、メカノバイオロジー研究における高精度MTの採用を促進し、読者が関心のある独自の力に敏感なシステムを探求するように動機付けることを願っています。

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

1分子磁気ピンセット(MT)は、核酸やタンパク質などの生体分子を強制的に調べるための強力なツールとして機能しており、メカノバイオロジーの分野で役立つ態勢を整えています。この方法は一般に磁気ビーズの画像ベースの追跡に依存しているため、画像の記録と分析の速度制限、およびビーズの熱変動は、標的分子の小さくて速い構造変化を観察するためのその応用を長い間妨げてきました。本稿では、生体分子とその複合体のナノスケール、ミリ秒のダイナミクスを解析できる高分解能MTセットアップの構築と操作の詳細な方法について説明します。応用例として、DNAヘアピンやSNARE複合体(膜融合機構)を用いた実験を、ピコノートンスケールの力の存在下でそれらの過渡状態や遷移をどのように検出できるかに焦点を当てて説明します。今後も高速MTにより、細胞内の力を感知・伝達・発生する分子の高精度なナノメカニカル計測が可能となり、メカノバイオロジーの分子レベルでの理解が深まることが期待されます。

力のキャリブレーション 2つの力測定方法(ビーズの横方向変位分散とパワースペクトル分析)の結果は、0〜2pN異なりました(図2G)。 図2Fの結果によると、通常のネオジム磁石で最大30pNまで確実に到達できます。
8 bp DNAヘアピンの2状態遷移 まず、短いDNAヘアピンのナノメカニクスを調べました(図5)。DNAヘアピンは、従来の単一分子力分光法によって広範囲に特徴付けられているため、比較するための膨大な参照ソースが利用可能です。短いヘアピンの解凍は通常可逆的であるため、その再圧縮イベントは、解凍が発生するのと同じ力の範囲でも観察されます(図5A)。0 pNと20 pNの間のフォースランプを適用することにより(図5B</...

ここでは、力に敏感な生体分子を最大1.2kHzの速度でナノメカニカル測定を行う高速磁気ピンセットのセットアップについて説明します。モデル系としてDNAヘアピンやSNARE複合体への応用を紹介しますが、メカノバイオイベントに関与する他の分子にも応用できます。

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

生体分子は、しばしば力に応答して小さく急速な構造変化を受けます。高解像度磁気ピンセットは、生理学的に関連する力の下でこれらのダイナミクスを探索することができます。ナノスケールでミリ秒の精度で測定できるため、核酸やタンパク質の微妙な変化をリアルタイムでモニタリングすることが可能です。最初の担持タンパク質および機械感受性タンパク質の機能不全は、心血管障害および筋骨格障害につながる可能性があります。磁気ピンセットは、これらのタンパク質の働きのメカニズムに関する洞察を提供することができます。良好な解像度を得るには、セットを適切に位置合わせおよびキャリブレーションする必要があります。また、測定用の分子構築物の調製および同定中は注意が必要である。まず、防振光学テーブルに倒立顕微鏡を設置します。次に、高速CMOSカメラとフレームグラバーを取り付けます。移動距離が20mmを超える電動リニアステージを手動XYステージに垂直に取り付け、3Dでの磁石操作用の並進ステージを構築します。次に、ロータリーステッピングモーターと磁石回転用のベルトとプーリーシステムを取り付けます。磁石は、同一の平行磁石が1ミリメートル間隔で配置されているアクリルホルダーに取り付けます。磁石の底面が最下段位置のサンプル平面と揃うように、並進ステージの垂直位置を調整します。低倍率の対物レンズを使用して、磁石を視野の中心に合わせます。磁石の回転をチェックして、磁石ペアの中心の変位が制限されていることを確認します。ビーズ照明用のスーパールミネッセントダイオードを取り付けます。ビームを磁石のギャップに通し、ビームがギャップに収まるように適切にコリメートされ、照明が磁石によって影にならないようにします。次に、ノーズピースにピエゾレンズスキャナーを取り付け、ビーズトラッキング用の1.5開口数を備えた100倍油浸対物レンズを取り付けます。ビーズトラッキングの潜在的なアーチファクトを回避するために、照明が磁石の動きで均一であることを確認してください。最後に、ピクセルの飽和なしで光を最大の明るさに調整します。セルの上部と下部に2つのガラスカバースリップを取ることから始めます。カバーガラスを1モル水酸化カリウムで30分間超音波処理して清掃します。次に、カバーガラスを蒸留水ですすぎ、水に浸したままにします。底のカバーガラスをペギレートし、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保管します。実験当日、ペグ状のカバーガラスを窒素ガンでブロードライします。単純なチャネルを作成するには、幅約2ミリメートルの両面テープを用意し、下部カバースリップに5ミリメートル間隔で4つのストリップを平行に置きます。次に、下部カバースリップの中央に上部カバースリップを置き、チャネルの入口と出口の短いエッジに約5ミリメートルのスペースを残します。ピンセットを

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

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ピコニュートンとミリ秒の分解能で基板への軸索の接着性を評価するために、レーザー誘起軸索病変の間にテンションリリースの測定

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G quadruplexes を操作する単一分子磁気ピンセット プラットフォームによって報告されます、G4 の安定性と制御の研究によって、様々...

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。...

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ナノスケールの磁区を可視化するための磁気力顕微鏡の分解能と感度の最適化

このプロトコルは、テロメアDNA結合タンパク質(テロメア反復結合因子1...

1分子磁気ピンセットを用いたテロメアタンパク質-DNA相互作用の解析

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

ここで急速に線虫成長メディア寒天、ウェルあたりCaenorhhabditis 線虫の一貫性のある数 96...

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

ここで全細胞外膜シトクロムシェワネラ oneidensis氏-1 複合体を介して細胞外の電子輸送の速度へのプロトン輸送の貢献を研究する電気化学実験のプロトコルを提案する.

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学ぶ 高速磁気ピンセットを用いた力に敏感なバイオ分子のナノメカニカル測定法。DNAヘアピンやSNARE複合体の動態解析により、メカノバイオロジーイベントの理解と力感受性タンパク質関連疾患の解明に貢献します。

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

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