ジカウイルス阻害剤をリアルタイムで評価するための細胞ベースの電気インピーダンスプラットフォーム
2023年3月24日
ここでは、ヒト細胞におけるジカウイルスの感染と複製をリアルタイムで研究するための非常に簡単で簡単な方法として、細胞ベースの電気インピーダンス(CEI)の使用を示します。さらに、CEIアッセイは抗ウイルス化合物の評価に有用である。
ウイルス感染は非常に動的であり、ウイルス学における従来のエンドポイントアッセイには、選択されたエンドポイントが情報の欠落につながる可能性があるという制限があります。この技術の主な利点は、細胞ベースの電気インピーダンスにより、ウイルス感染および抗ウイルス化合物の活性をリアルタイムで追跡することが可能であることである。この手順を実演するのは、私たちの研究室の検査技師であるEefMeyenです。
まず、電極ベースの96ウェルプレートを挟んでCEIプレートを準備します。各ウェルに100マイクロリットルの増殖培養培地を加え、ウェル間のスペースをDPBSで満たします。次に、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で4時間インキュベートします。
A549細胞を播種するには、原稿に記載されているように培養フラスコから細胞を剥離し、新鮮な増殖培地に再懸濁します。細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。生細胞をカウントし、新鮮な増殖培地で希釈して、目的の細胞密度を取得します。
インキュベーション後、マルチチャンネルピペットで増殖培養液を96ウェルプレートから取り出します。ウェルあたり100マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。細胞が平衡化されたら、プレートをCEIデバイスに入れて、CEIアッセイをセットアップして実施します。
デバイスのソフトウェアを開き、[データの収集] ウィンドウで [セットアップ] をクリックして新しい実験を設定します。ラップトップを ECIS デバイスに接続します。緑色のウェルのインピーダンスを確認してプレートを構成します。
ウェル構成ペインで、使用する培養器具に応じてアレイタイプを選択し、複数周波数時間モードをクリックします。次に、開始を押して測定を開始します。コンパウンドを氷上に置いてください。
5ミリリットルのポリプロピレンチューブで平衡化したアッセイ培地で10倍濃縮希釈を行い、化合物を加えます。[データ収集のセットアップ] ウィンドウで [一時停止] をクリックし、現在の時点が完了したら、96 ウェル プレートを取り出します。光学顕微鏡下で細胞の接着および単層形成を観察する。
次に、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから20マイクロリットルの培地を吸引し、20マイクロリットルの化合物溶液またはビヒクルを目的のウェルに加えます。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で15分間インキュベートします。ウイルス溶液を調製するには、ウイルスストックのバイアルを解凍します。
15ミリリットルのポリプロピレンチューブのアッセイ培地で目的のMOIで希釈した後、ウイルスストックを追加します。割り当てられたウェルにウイルス希釈液を加えたら、100マイクロリットルのアッセイ培地を細胞コントロールウェルに加えます。次に、使用したウイルスコンテナを除染します。
プレートをCEIデバイスに戻し、[再開]をクリックして6日間連続して測定を続行します。データを分析するには、[完了] をクリックして実験を終了し、[実験の概要を入力] を追加します。データ収集が完了したら、 [OK] を選択します。グラフペインで目的の周波数を選択します。
[ウェル構成]ペインですべてのウェルが選択されていることを確認し、[ファイル]、[データのエクスポート]、[グラフデータ]の順にクリックして、データをスプレッドシート形式でエクスポートします。CEIアッセイは、感染動態が細胞型に大きく依存し、U87細胞が高MOIでのみジカウイルス感染の影響を受けやすいことを示しました。CEIアッセイはまた、高い細胞播種で完全に成長した細胞単層を示し、CEI電極全体にさらに広がることができず、細胞制御とウイルス制御の間にわずかな違いをもたらします。
より大きな細胞タイプであるU87の場合、細胞を高密度に播種しすぎると、細胞単層が完全に剥離した可能性があります。アジア系統PRVABC59におけるアフリカMR766の代表的なジカウイルス株は、同様のCEIパターンを示した。しかしながら、PRVABC59は、細胞変性効果誘導特性がわずかに遅く、CIT50値にも反映されている。
両方のジカウイルス株の3つの異なるMOIのインピーダンスプロファイルは、特定の化合物濃度がジカウイルス感染によって引き起こされるインピーダンス低下を遅らせることを示しました。CEIアッセイは、抗ウイルス活性がIC50値を決定するMOIおよびAUCN計算に依存することを明らかにした。評価されたCIT50値は、細胞増殖および感染の動態における化合物効力を実証した。
CEIは、ジカウイルスの複製に対する化合物をリアルタイムでラベルフリーで非侵襲的に評価および特性評価するための強力な技術です。
概要
本研究では、ジカウイルス感染および複製をリアルタイムで調査するための、細胞ベース電気インピーダンス（CEI）の使用について実演します。また、CEIアッセイは抗ウイルス化合物を評価する方法としても機能します。
研究の主要構成要素
科学分野
- ウイルス学
- 細胞生物学
- 抗ウイルス研究
背景
- ウイルス感染の正確な評価には、多くの場合、リアルタイムでのモニタリングが必要です。
- 従来のエンドポイントアッセイでは、重要な情報が見落とされる可能性があります。
- CEIを用いることで、ウイルス動態の連続的な観察が可能になります。
- この手法により、抗ウイルス効果の評価を向上させることができます。
研究目的
- ジカウイルス感染を研究するためのCEI技術を紹介すること。
- 抗ウイルス化合物の有効性をリアルタイムで評価すること。
- 異なる細胞種における感染キネティクスを解析すること。
使用方法
- 櫛形電極を用いたCEIプレートの準備。
- A549細胞の播種および接着状態のモニタリング。
- ウイルスおよび抗ウイルス化合物の投与。
- CEIソフトウェアを用いたデータ収集および解析。
主な結果
- 感染キネティクスは、細胞種およびMOIによって大きく異なりました。
- CEIアッセイにより、抗ウイルス活性が化合物の濃度に依存することが示されました。
- さまざまな化合物についてIC50値を決定しました。
- CEIは、ジカウイルス複製の評価のための非侵襲的な手法を提供しました。
結論
- CEIは、ウイルス感染をリアルタイムで分析するための強力なツールです。
- この手法により、抗ウイルス化合物を効果的に評価することができます。
- さらなる研究により、ジカウイルスのダイナミクスに対する理解が深まる可能性があります。
よくある質問
業界における重要性
細胞ベース電気インピーダンス（CEI）プラットフォームにより、ウイルスの細胞病原性と化合物の有効性をリアルタイムかつラベルフリーでモニタリングすることが可能となり、抗ウイルス薬探索における従来のエンドポイントアッセイの限界を解消できます。このアプローチは、動的な感染キネティクスと化合物への反応を捉えることで、初期段階の阻害剤評価における予測の信頼性を向上させます。CEIを探索パイプラインに統合することで、ジカウイルスや同様の病原体を標的とする抗ウイルス候補薬のリスク調整後の推進およびポートフォリオの選別を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 生細胞単層におけるウイルスの細胞変性効果および化合物の作用を直接観察することが可能になります。
- 感染キネティクスと阻害剤の効力をリアルタイムで定量化することにより、機能的なターゲット検証をサポートします。
- 細胞株およびMOI依存的な感染プロファイルを区別することで、メカニズム面でのリスク低減を促進します。
- 定量的で時間分解能の高いデータに基づき、抗ウイルスリード化合物を推進するための予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ハイスループットな抗ウイルススクリーニングのための、標準化され再現性のあるアッセイフォーマットを提供します。
- 化合物のランキング付けに必要なIC50やCIT50などの定量的出力を算出します。
- ラベルフリーで非侵襲的なモニタリングを可能にし、アッセイの複雑さとばらつきを低減します。
- 異なる細胞種やウイルス株への迅速なアッセイ適応をサポートします。
翻訳および前臨床研究
- in vitro感染モデルを疾患に関連するウイルスキネティクスに適合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 複数の感染パラメータにわたる化合物の有効性のダイナミックな評価を可能にします。
- 堅牢で定量的な有効性データを提供することで、リスク調整済みの前臨床段階への進展をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
CEIプラットフォームは、初期探索からリード化合物同定に至る一連の流れの中に位置付けられており、抗ウイルスプログラムにおける仮説駆動型のターゲットバリデーションと定量的スクリーニングを橋渡しします。
- 探索生物学： 感染キネティクスおよび化合物の効果を定量化し、仮説検証と生物学的リスク低減を支援します。
- スクリーニング： 化合物の評価および優先順位付けのために、再現性のある定量的なリードアウト（IC50、CIT50）を提供します。
- 分析： 比較分析のために、時間分解インピーダンスプロファイルおよび統計的出力を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの知見を、疾患に関連するウイルスダイナミクスと整合させることが可能です。
- エンタープライズでの再利用： 継続的な抗ウイルス研究および細胞病原性研究に向けた、拡張可能で適応性のあるプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： リアルタイムの感染および抑制動態を捉えることで、予測の信頼性とターゲット検証を向上させます。
- 運用の価値： 抗ウイルス剤スクリーニングのワークフローにおける標準化、再現性、および拡張性を高めます。
- 戦略的価値： 情報に基づいた Go/No-go 判断と、資本効率の高いポートフォリオ管理を支援します。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整に基づいた抗ウイルス候補物質の優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の検討事項
- 細胞培養、ウイルス学、およびインピーダンスベースのアッセイ操作に関する専門知識が必要です。
- CEI装置および互換性のある解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- 細胞株、MOI、およびアッセイ条件について、チーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、さまざまな細胞種やウイルス株に適応可能です。
- データ品質を確保するため、播種密度および感染パラメータの厳密な制御が不可欠です。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Cell‐Based Electrical Impedance (CEI) Plate Preparation, Cell Seeding, and CEI Assay
2:12
Antiviral Compound Preparation and Virus Infection
3:28
Data Analysis
3:57
Results: Effect of Antiviral Compound and Zika Virus Replication on CEI Profiles
5:22
Conclusion
