Name: 霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶ霊長類脳オルガノイドへの標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーションによる遺伝子改変法。コスト効率の良い装置で神経発生過程を研究し、ヒト進化における脳の発達メカニズムを解明する。

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スペースの都合上、研究内容を引用できなかった研究者の皆様にお詫び申し上げます。ペトリ皿電極チャンバーの建設について、DPZの技術サービスのウルリッヒ・ブレイヤーとMPI-CBGのワークショップのハルトムート・ヴォルフに感謝します。ストヤン・ペトコフとリューディガー・ベーアは、ヒト(iLonza2.2)、アカゲザル(iRh33.1)、マーモセット(cj_160419_5)のiPS細胞を提供しました。サブリナ・ハイデ 凍結切開および免疫蛍光染色用;ネリンガ・リウティカイテとセザール・マテオ・バスティダス・ベタンクールは、原稿を批判的に読んでくれました。W.B.H.の研究室での作業は、ERA-NET NEURON(MICROKin)の助成金によってサポートされました。M.H.の研究室での作業は、ERC開始助成金(101039421)によってサポートされました。

霊長類の脳オルガノイドの遺伝子改変

<ol><li>Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).</li>
<li>Zhao, X., Bhattacharyya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+models+are+needed+for+studying+human+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders.</a> The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+microcephaly+with+cerebral+organoids+reveals+a+WDR62%E2%80%93CEP170%E2%80%93KIF2A+pathway+promoting+cilium+disassembly+in+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors.</a> Nature Communications. 10 (1), 2612(2019).</li>
<li>Sasaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+non-human+primates+with+germline+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic non-human primates with germline transmission.</a> Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rhesus+monkeys+produced+by+gene+transfer+into+early-cleavage%E2%80%93stage+embryos+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via+Cas9%2FRNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rhesus+monkeys+carrying+the+human+MCPH1+gene+copies+show+human-like+neoteny+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22National+Science+Review%22%5BJournal%5D)">Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development.</a> National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).</li>
<li>Heide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+increases+size+and+folding+of+primate+neocortex+in+the+fetal+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset.</a> Science. 369 (6503), 546-550 (2020).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell%E2%80%93derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+models+of+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell models of human brain development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li>
<li>Arlotta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+required%21+A+new+path+to+understanding+human+brain+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease.</a> Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).</li>
<li>Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+as+models+to+study+human+neocortex+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution.</a> Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).</li>
<li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids%3A+Advances%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), dev166074(2019).</li>
<li>Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+brain+organoids+in+neurodevelopment+and+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases.</a> Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30(2021).</li>
<li>Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of brain organoids.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558(2019).</li>
<li>Pașca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+consensus+for+nervous+system+organoids+and+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids.</a> Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).</li>
<li>Kyrousi, C., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+brain+organoids+to+study+human+neurodevelopment%2C+evolution+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347(2020).</li>
<li>Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in organoids.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genetic+manipulation+of+cortical+progenitors+in+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+genetic+manipulation+of+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Molecular Brain. 5 (1), 24(2012).</li>
<li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-induced+disruption+of+gene+expression+in+mouse+embryonic+brain+and+single+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo.</a> EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).</li>
<li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+ensures+human-like+basal+progenitor+levels+in+hominid+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids.</a> EMBO Reports. 23 (11), e54728(2022).</li>
<li>Stauske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-human+primate+iPSC+generation%2C+cultivation%2C+and+cardiac+differentiation+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions.</a> Cells. 9 (6), 1349(2020).</li>
<li>Mora-Bermúdez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+and+similarities+between+human+and+chimpanzee+neural+progenitors+during+cerebral+cortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development.</a> eLife. 5, e18683(2016).</li>
<li>Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+switch+from+neurogenesis+to+pluripotency+during+marmoset+monkey+somatic+cell+reprogramming+with+self-replicating+mRNAs+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules.</a> Cells. 9 (11), 2422(2020).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li>
<li>Kanton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+single-cell+genomic+atlas+uncovers+human-specific+features+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development.</a> Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Cakir, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+human+brain+organoids+with+a+functional+vascular-like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system.</a> Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), dev166884(2019).</li>
<li>Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+and+electroporation+of+plasmid+DNA+into+human+cortical+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101129(2022).</li>
<li>Denoth-Lippuner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+individual+cell+division+history+in+complex+tissues+using+iCOUNT%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).</li>
<li>Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+increase+excitatory+neurogenic+potential+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids.</a> Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+self-organization+and+cortical+plate+formation+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+expansion+due+to+increased+proliferation+of+basal+progenitors+is+linked+to+changes+in+their+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology.</a> Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).</li>
</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

ここで説明する手順は、ターゲットを絞ったエレクトロポレーションアプローチを用いて、異なる霊長類種から脳オルガノイドを生成するための統一されたプロトコルを表しています。これにより、霊長類(ヒトを含む)(病的)生理学的新皮質発達をエミュレートするモデルシステムにおけるGOIの異所性発現が可能になります。霊長類大脳オルガノイドの生成のためのこの統一されたプロトコルは、提示された4つの霊長類種すべてについて同じ材料(例えば、媒体)およびプロトコルステップを使用する。これらの種間の発生上の違いは、重要なプロトコルステップ(すなわち、神経誘導および基底膜マトリックスへの埋め込み;上記参照)のタイミングを変更することによって対処される。これは、これらの種間の in vivo 神経発達のタイミングの違いを大まかに反映している可能性があり、さらなる研究のための興味深いトピックを構成します。
このアプローチは、脳オルガノイド10に関する以前の論文に記載されたエレクトロポレーション実験に基づいている。しかし、Lancasterらが指摘した...

大脳皮質の(病的)生理学的発達と進化を調査することは、適切なモデルシステムの欠如によって妨げられている手ごわい仕事です。以前は、このような研究は、二次元細胞培養モデル(初代神経前駆細胞や神経細胞培養など)と進化的に遠い動物モデル(げっ歯類など)に限定されていました1,2。これらのモデルは特定の問題に対処するのに役立ちますが、健康な状態と病気の状態で発達中のヒト新皮質の複雑さ、細胞タイプの組成、細胞構造、および遺伝子発現パターンのモデリングには制限があります。これらの制限は、例えば、小頭症の特定の症例について記載されているように、ヒト疾患のマウスモデルのヒト状況への翻訳可能性の低さにつながる(例えば、Zhangら3)。最近、ヒト新皮質発生の進化的、機能的、形態学的に近いモデルであるトランスジェニック非ヒト霊長類が、細胞培養およびげっ歯類ベースのモデルの多くの制限を克服するにつれて、焦点が当てられています4,5,6,7,8。しかし、研究におけるヒト以外の霊長類の使用は、非常に費用と時間がかかるだけでなく、倫理的な懸念も引き起こします。最近では、脳オルガノイド技術9,10の開発が、以前のモデル11,12,13,14,15,16の制限の多くを解決する有望な代替手段として浮上している。
脳オルガノイドは、3次元(3D)の多細胞構造であり、定義された発生時間ウィンドウ11、12、13、14、17に対する1つまたは複数の脳領域の細胞構造および細胞型組成の主な特徴をエミュレートする。これらの3D構造は、人工多能性幹細胞(iPSC)から、または目的の種で利用可能な場合は胚性幹細胞(ESC)から生成されます。一般に、2種類の脳オルガノイドは、使用される方法論に基づいて区別することができる:ガイドなしおよび局所化(ガイド付き)脳オルガノイド18。後者のタイプのオルガノイドを生成する際には、多能性幹細胞を特定の脳領域のオルガノイド(例えば、前脳オルガノイド)に分化させる小分子または因子が提供される18。対照的に、非誘導オルガノイドでは、分化は低分子の添加によって導かれるのではなく、iPSC/ESCの自然分化にのみ依存します。結果として得られる脳オルガノイドは、異なる脳領域を表す細胞型(例えば、大脳オルガノイド)からなる18。脳オルガノイドは、脳発生の多くの重要な特徴と、iPS細胞またはESCが利用可能なあらゆる対象種からの比較的コスト効率と時間効率の高い生成を兼ね備えています11、12、13、14。これにより、脳オルガノイドは、進化的および発達的問題から疾患モデリングや薬物検査に至るまで、多くの種類の神経生物学的研究の優れたモデルになります15,16。しかし、脳オルガノイドを使用してこのような問題に取り組むことは、遺伝子組み換えのためのさまざまな方法の利用可能性に強く依存します。
新皮質(病)生理学的発達とその進化を研究する上で重要な側面の1つは、遺伝子と遺伝子変異の機能解析です。これは通常、(異所性)発現および/またはそれらの遺伝子のノックダウン(KD)またはノックアウト(KO)によって達成される。このような遺伝子改変は、安定な遺伝子改変と一過性の遺伝子改変、ならびに時間的および空間的に制限されている改変または制限されていない改変に分類することができる。安定した遺伝子組み換えは、その後のすべての細胞世代に受け継がれる宿主ゲノムへの遺伝子改変の導入によって定義されます。遺伝子組み換えの時点に応じて、オルガノイドのすべての細胞に影響を与えるか、特定の細胞集団に制限される可能性があります。ほとんどの場合、レンチウイルス、トランスポゾン様システム、およびCRISPR/Cas9技術を適用することにより、iPSC/ESCレベルで脳オルガノイドで安定した遺伝子改変が達成されます(例えば、Fischer et al.17、Kyrousi et al.19、およびTeriyapirom et al.20によってレビューされています)。これは、脳オルガノイドのすべての細胞が遺伝子組み換えを持ち、時間的または空間的に制限されないという利点があります。しかし、これらの安定なiPSC/ESC株の生成と特性評価は非常に時間がかかり、最初の改変された脳オルガノイドが分析されるまでに数か月かかることがよくあります(例えば、Fischer et al.17、Kyrousi et al.19、またはTeriyapirom et al.20によってレビューされています)。
対照的に、一過性の遺伝子改変は、宿主ゲノムに組み込まれない遺伝的貨物(例えば、遺伝子発現プラスミド)の送達によって定義される。この修飾は、原則として、次の細胞世代に受け継がれる可能性がありますが、送達された遺伝子貨物は、細胞分裂ごとに徐々に希釈されます。したがって、このタイプの遺伝子組み換えは通常、時間的および空間的に制限されています。一過性の遺伝子改変は、アデノ随伴ウイルスまたはエレクトロポレーション(例えば、Fischer et al.17、Kyrousi et al.19、およびTeriyapirom et al.20によってレビューされている)によって脳オルガノイドで実行することができ、後者はこの記事で詳細に説明されています。安定した遺伝子組み換えとは対照的に、このアプローチは非常に高速で費用効果が高いです。実際、エレクトロポレーションは数分以内に実行でき、標的細胞集団によっては、エレクトロポレーションされたオルガノイドは数日以内に分析の準備が整います(Fischer et al.17およびKyrousi et al.19などによってレビューされています)。しかし、大きさの違いなどの脳オルガノイドの全体的な形態学的変化は、この種の遺伝子組み換えが時間的および空間的に制限されているため、この方法では検出できません。この制限は、例えば、オルガノイド内の個々の細胞集団または特定の発生時点における脳オルガノイドへの影響を研究する場合にも利点となり得る(例えば、Fischer et al.17およびKyrousi et al.19によってレビューされた)。
脳の発生と進化の間の遺伝子機能を研究するための古典的なアプローチは、子宮エレクトロポレーションです。子宮内エレクトロポレーションは、げっ歯類21、22、23およびフェレット24、25脳への遺伝子発現構築物の送達のための周知かつ有用な技術である。まず、目的の発現コンストラクトを含む溶液を、標的とする領域に応じて、子宮壁を介して胚性脳の特定の心室にマイクロインジェクションします。第2ステップでは、電気パルスを適用して、標的心室を直接裏打ちする細胞をトランスフェクトします。このアプローチは、異所性発現または遺伝子の過剰発現に限定されるものではなく、それぞれショートヘアピン(shRNA)またはCRISPR/Cas9(発現プラスミドまたはリボ核タンパク質[RNP]の形態)をマイクロインジェクションすることにより、KDまたはKO研究にも適用できます26,27。しかしながら、マウス、ラット、およびフェレット胚の子宮内エレクトロポレーションには、これらの動物モデルについて上述したのと同じ制限がある。
理想的には、霊長類で直接 子宮内 エレクトロポレーションを行いたいと考えています。これは原則として技術的に可能ですが、 子宮内 エレクトロポレーションは、倫理的懸念、高い動物維持費、および小さな産仔サイズのために霊長類では行われません。類人猿(人間を含む)などの特定の霊長類では、これはまったく不可能です。しかし、これらの霊長類は、ヒト(病的)生理学的新皮質の発達とその進化の研究に最も大きな可能性を秘めています。このジレンマに対する1つの解決策は、霊長類の脳オルガノイドにエレクトロポレーション技術を適用することである28。
この論文は、霊長類の脳オルガノイドのサブタイプである霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションのためのプロトコルを提示します。このアプローチにより、オルガノイドの心室様構造内の細胞集団の迅速かつ費用効果の高い遺伝子改変が可能になります。具体的には、ヒト(ホモサピエンス)、チンパンジー(パントログロダイト)、アカゲザル(マカカムラッタ)、およびコモンマーモセット(Callithrix jacchus)iPS細胞から霊長類の大脳オルガノイドを生成するための統一プロトコルについて説明します。さらに、マイクロインジェクションとエレクトロポレーションの手法について詳しく説明し、霊長類の脳オルガノイドエレクトロポレーションを行うための「go」と「no-go」の基準を提供します。このアプローチは、特に人間の状況に近いモデルで(病的)生理学的新皮質の発達とその進化を研究するための効果的なツールです。

<table><tbody><tr><td>20 &micro;L マイクロローダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>メルク</td><td>8.05740.0005</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>ザルシュテット</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-3359</td><td></td></tr><tr><td>アクチビン A</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>SRP3003</td><td></td></tr><tr><td>AOC1</td><td>Selleckchem</td><td>S7217</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 対</td>等蛍光顕微鏡 <td>Zeiss</td><td></td>は<td>同等の蛍光顕微鏡で交換可能</td></tr><tr><td>AZD0530</td><td>Selleckchem&nbsp;</td><td>S1006</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement without Vitamin A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System</td><td>BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>CGP77675</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0314</td><td></td></tr><tr><td>Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra土</td><td></td><td></td><td>井: 10.7554/elife.18683&nbsp;</td></tr><tr><td>一般的なマーモセット誘導多能性幹細胞株 cj_160419_5</td><td></td><td></td><td>doi: 10.3390/cells9112422</td></tr><tr><td>ダルベッコの修飾イーグル培地/栄養混合物 F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>pH 7.0&minus;7.3;使用前に室温まで温め</td></tr>てください <tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Selleckchem</td><td>2449</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Glutamine Substitute Supplement</td></tr><tr><td>ヘパリン (1 mg/mL ストック)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Human Induced pluripotent Stem Cell line iLonza2.2</td><td></td><td></td><td>doi: 10.3390/cells9061349</td></tr><tr><td>Human Neurotrophin-3 (NT-3)</td><td>PeproTech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)</td><td>Leica</td><td>10473849</td><td>replaceable by comparable stereomicroscopes</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277/354234</td><td>基底膜マトリックス; あるいは、Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) は</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>メルク</td><td>818715</td><td>は、癌性</td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U / mL)による因果関係のあるハンドル(10,000 U / mL)</td><td>PanBiotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿電極チャンバー</td><td>自己生産(補足ファイル1を参照)</td><td></td><td>また、商業的に利用可能な</td></tr><tr><td>プレプルドガラスピペットWPI</td><td></td><td>TIP10LT</td><td>長いテーパー付きホウケイ酸ガラスピペット、10 & マイクロ;先端径</td></tr><tr><td>Pro-Survival Compound</td><td>MerckMillipore</td><td>529659</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human/Mouse/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-450-02</td><td></td></tr><tr><td>アカゲザル誘導多能性幹細胞株 iRh33.1</td><td></td><td></td><td>doi: 10.3390/cells9061349</td></tr><tr><td>StemMACS iPS-Brew XF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-368</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 細胞解離試薬</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>タンパク質分解およびコラーゲン溶解酵素混合物</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>組換えトリプシン代替品; 使用前に室温まで温める</td></tr><tr><td>超低アタッチメント 96 ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72305</td><td></td></tr></tbody></table>

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

大脳皮質は最も外側の脳構造であり、感覚入力と運動出力の処理に関与しています。それは哺乳類、特に霊長類の高次認知能力の座と見なされています。霊長類の脳における遺伝子機能の研究は、技術的および倫理的な理由から困難ですが、脳オルガノイド技術の確立により、従来の霊長類モデル(アカゲザルやコモンマーモセットなど)や、以前は実験的にアクセスできなかった霊長類種(大型類人猿など)での脳発生の研究が可能になりました。さらに、ヒトの脳オルガノイドは、神経発達および神経障害の高度な研究を可能にします。
脳オルガノイドは、脳の発達の多くの過程を再現しているため、進化の文脈でさまざまな種の脳の発達の根底にある遺伝的決定要因の違いを特定し、機能的に比較するための強力なツールでもあります。オルガノイドを使用する大きな利点は、遺伝子機能の試験を可能にする遺伝子改変を導入する可能性である。しかしながら、そのような修正の導入は面倒で費用がかかる。この論文では、脳オルガノイドのサブタイプである霊長類大脳オルガノイドの心室様構造内の細胞集団を遺伝子組み換えするための迅速で費用効果の高いアプローチについて説明します。この方法は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、および一般的なマーモセット由来の人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを確実に生成するための修正プロトコルと、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションアプローチを組み合わせたものです。これは、疾患モデリングにも適用できる神経発達および進化過程の研究のための効果的なツールを提供します。

ここで説明するプロトコルにより、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、および一般的なマーモセットiPS細胞株から、種間で必要なタイミングの変更を最小限に抑えながら、脳オルガノイドを効率的に生成できます(図1A)。これらのオルガノイドは、心室様構造のアクセス可能性および目的の細胞集団の存在量に応じて、20 dpsから50 dpsの範囲でエレクトロポレーションすることができます。ただし、エレクトロポレーションの前に、脳オルガノイドがエレクトロポレーションに十分な品質であるかどうかを判断することが重要です。
エレクトロポレーションに理想的な大脳オルガノイドは、末梢に顕著な明るい心室様構造を示し、変性の兆候(例えば、細胞の剥離、アポトーシスコアの拡大)、および一般的にコンパクトな健康な形態(例えば、過度の伸長なし)を示す必要があります(図1B、「Go」)。より多くの細胞を標的とするために、大きく、よく組織化された、心室様構造を有する大脳オルガノイドを選択することが好ましい。オル...

霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションは、霊長類(病原)生理学的新皮質の発生に近いモデルシステムにおいて、異なる前駆細胞タイプおよびニューロンに一過性の遺伝子改変を導入するための正確かつ効率的なアプローチを提供します。これにより、神経発達および進化過程の研究が可能になり、疾患モデリングにも適用できます。

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...

私たちの研究分野は、霊長類の脳の発生と進化です。私たちは、霊長類の新皮質拡張の根底にある要因を理解しようとしています。この問いに実用的かつ倫理的に正当な方法で取り組むために、我々は脳オルガノイドを研究モデルとして用いる。最近、現代人、私たち、ネアンデルタール人の脳の発達の違いが浮かび上がってきました。これらの違いは、脳の発達に重要な役割を果たすタンパク質のアミノ酸変化が少ないためです。脳オルガノイドは、これらの研究において重要なモデルシステムとなっています。霊長類の発生を進化の観点から研究し、機能獲得と喪失の研究を行うことは重要です。しかし、ヒトを含む類人猿は当然そのような実験に使用できないため、オルガノイドの遺伝子組み換えはこの分野で重要な役割を果たしています。私の研究室でポスドクとして働いていたとき、マイケル・ハイデは、ヒト特異的遺伝子ARHGAP11Bが人間の進化の間に脳のサイズを大きくする上で重要なプレーヤーであることを示しました。現在、ドイツ霊長類センターのグループリーダーとして、マイケルは人間とチンパンジーの脳オルガノイドを比較することにより、重要な洞察を提供しました。私たちのプロトコルは、市販のエレクトロポレーションキュベットの代わりに、特定のマイクロ注入心室様構造による遺伝子改変のためのターゲットを絞ったアプローチを提供します。このアプローチでは、高価な核エフェクターソリューションの代わりに、方形波エレクトロポレーターとペトリディッシュ電極チャンバーを含むコスト効率の高いセットアップを使用します。遺伝子組み換えによる霊長類の機能と脳の発達を研究することは技術的には可能ですが、方法論的に要求が厳しく、費用がかかり、大型類人猿には許可されていません。霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションは、霊長類の脳の発達に近いモデルに遺伝子組み換えを導入するための迅速かつコスト効率の高いアプローチを提供します。将来的には、異なる霊長類の皮質で発現差のある遺伝子の特性評価に焦点を当てたいと考えています。霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションによりこれらの遺伝子を研究し、大脳皮質前駆細胞に対する潜在的な影響を解析します。

targeted-microinjection-electroporation-primate-cerebral-organoids

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

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神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

小脳外顆粒層は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイトです。ここでは、胚の14日目のニワトリ胚からex vivoでエレクトロポレーションおよび小脳スライスの文化を使用して、増殖のピーク時にこの層に遺伝子改変をターゲットにするプロトコルを提示します。...

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最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

学ぶ霊長類脳オルガノイドへの標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーションによる遺伝子改変法。コスト効率の良い装置で神経発生過程を研究し、ヒト進化における脳の発達メカニズムを解明する。

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

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