Name: FACS単離マウスサテライト細胞のCUT and RUN解析のための効率的なプロトコール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶマウス筋肉サテライト細胞のFACS単離とCUT&RUN解析プロトコール。転写調節とアンドロゲン受容体の役割を解明し、筋関連疾患治療への応用を目指す革新的手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

優れた技術支援を提供してくれたAnastasia Bannwarthに感謝します。IGBMCアニマルハウス施設、細胞培養、マウス臨床研究所(ICS、Illkirch、フランス)、イメージング、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、および「France Génomique」コンソーシアムのメンバーであるGenomEastプラットフォーム(ANR-10-INBS-0009)に感謝します。
ストラスブール大学、CNRS、InsermのITI 2021-2028プログラムの一環として、学際的テーマ別研究所IMCBioのこの取り組みは、フランスの未来への投資プログラムの枠組みの下で、IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)とSFRI-STRAT'USプロジェクト(ANR 20-SFRI-0012)およびEUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)の支援を受けました。追加資金は、INSERM、CNRS、Unistra、IGBMC、Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR)、AFM-Téléthon strategic program 24376 (to D.D.)、INSERM young researcher grant (to D.D.)、ANR-10-LABX-0030-INRT、およびフレームプログラムInvestissements d'Avenir(ANR-10-IDEX-0002-02)の下でANRが管理するフランスの国家基金によって提供されました。J.R.は、Université franco-allemandeおよびMinistère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'InnovationのプログラムCDFA-07-22、およびAssociation pour la Recherche à l'IGBMC(ARI)のK.G.の支援を受けました。

マウス四肢筋からのサテライト細胞単離とフローサイトメトリー解析

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
<li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+human+islet+isolation+utilizing+recombinant+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase.</a> Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).</li>
<li>Nikolic, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+myoblastoma+cell+differentiation+and+proliferation+is+stimulated+by+androgens+and+associated+with+a+modulation+of+myostatin+and+Pax7+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).</li>
<li>Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+modulation+of+the+nuclear+receptor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).</li>
<li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li>
<li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li>
<li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield%2C+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

本研究は、マウスサテライト細胞の単離と培養、ならびにCUT&RUN法による転写制御の評価のための標準化された信頼性と実施が容易な方法を報告する。
このプロトコルには、いくつかの重要なステップが含まれます。1つ目は、筋肉の破壊と繊維の消化で、多くの細胞を確実に集めることです。酵素濃度が上昇したにもかかわらず、プロトコル1を使用した場合よりも多くの生細胞が得られました。サテライト細胞は、さまざまな膜タンパク質の特定のパターンを発現します。選別の厳密性を高めるために、前述のネガティブ(CD31、TER119、CD45、およびCD11b)とポジティブ(CD34、ITGA7、およびCXCR4)のサテライトセルマーカーの組み合わせを使用しました30,31。この戦略を用いて、生きている推定サテライト細胞の平均1%が得られました。サテライト細胞はマウスの成体期の筋細胞集団の2%〜7%を占めるため、この結果は予想された範囲です32。サテ...

骨格横紋筋は、平均して人体全体の重量の40%を占めています1。筋線維は、新たに形成された筋細胞の融合と、損傷した筋線維を置き換える新しい筋線維の生成によって説明される、損傷時に驚くべき再生能力を示す2。1961年、アレクサンダー・マウロは単核細胞の集団を報告し、これをサテライト細胞3と名付けた。これらの幹細胞は、転写因子ペアボックス7(PAX7)を発現し、筋線維4の基底層と筋膜の間に位置する。分化クラスター34(CD34;造血、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞マーカー)、インテグリンα7(ITGA7;平滑心筋マーカー、骨格筋マーカー)、C-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR4;リンパ球、造血、サテライト細胞マーカー)5を発現していることが報告されています。基底状態では、サテライト細胞は静止状態を維持する特定の微小環境に存在します6。筋肉が損傷すると、それらは活性化され、増殖し、筋形成を受けます7。しかし、筋肉細胞の総数のごく一部にしか寄与していないため、ゲノムワイドな解析は、特に生理学的設定(全細胞の<1%)では特に困難です。
サテライト細胞からクロマチンを単離するには、クロマチン免疫沈降とそれに続くマッシブパラレルシーケンシング(ChIP-seq)や、ターゲットおよびタグメンテーション下での切断(CUT&Tag)実験など、さまざまな方法が報告されています。それにもかかわらず、これら 2 つの手法には、未解決のままであるいくつかの重大な制限があります。実際、ChIP-seqは、十分なクロマチンを生成するために大量の出発物質を必要とし、その大部分は超音波処理ステップ中に失われます。CUT&Tagは細胞数が少ない場合に適していますが、Tn5トランスポザーゼ活性により、ChIP-seqよりも多くのオフターゲット切断部位を生成します。さらに、この酵素はオープンクロマチン領域に対する親和性が高いため、ゲノムの活発に転写領域に関連するヒストン修飾や転写因子の解析には、サイレンシングされたヘテロクロマチンではなく、CUT&Tagアプローチが優先的に用いられる可能性があります8,9。
ここでは、FACSによるマウス四肢筋サテライト細胞の単離を可能にし、ヌクレアーゼ(CUT&RUN)10,11分析を用いて、ターゲット下での切断と放出を可能にする詳細なプロトコルを示します。さまざまなステップには、組織の機械的破壊、細胞の選別、および核の分離が含まれます。生細胞懸濁液の調製に関するこの分析法の効率は、共有結合ヒストン修飾および転写因子のCUT&RUN解析を実施することで実証されました。単離された細胞の品質により、記載された方法は、天然のゲノム占有状態を忠実に捕捉するクロマチンを調製するのに特に魅力的であり、特定の遺伝子座(4C-seq)またはゲノムワイドレベル(Hi-C)でのハイスループットシーケンシングと組み合わせて染色体コンフォメーションを捕捉するのに適している可能性があります。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>2 mLマイクロチューブ</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>5 mLチューブ</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mLチューブ</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>抗AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>抗CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>抗CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>抗CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>抗DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>抗H3K27ac</td><td>活性モチーフ</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>抗 H3K4me2</td><td>活性モチーフ</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>抗 ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>抗 PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>抗 TER119</td><td>BD Pharmingen TM553673</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg;プラス コンカナバリン A</td></tr><tr><td>セル ストレーナー 100 & マイクロ;m</td><td>コーニング&reg;&nbsp;</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 40 & micro;m</td><td>コーニング&reg;&nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 70 & マイクロ;m</td><td>コーニング&reg;&nbsp;</td><td>431751</td><td></td></tr>遠<tr><td>心分離機 1</td><td>エッペンドルフ</td><td>521-0011</td><td>遠心分離機 5415 R</td></tr><tr><td>遠心分離機 2</td><td>エッペンドルフ</td><td>5805000010</td><td>遠心分離機 5804 R</td></tr><tr><td>チャンバースライドシステム&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>171080</td><td>システム&egrave;私 Nunc&trade;ラボテック&トレード;チャンバースライド</td></tr><tr><td>洗浄剤</td>シ<td>グマ&nbsp;&nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、タイプ I&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>ディスパーゼ&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>固定可能な生存率染色</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD FACSAria&trade;フュージョンフローサイトメーター</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 付き蛍光マウント G</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>ゲノムブラウザー&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>グリセロール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>ハイドロゲル</td><td>Corning&reg;&nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC認定マトリックス</td></tr>画像<tr><td>処理ソフトウェア</td>Image <td>J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>実験用フィルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg;M</td></tr><tr><td>リベラーゼ LT</td><td>ロシュ</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>没食子酸プロピル</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>シーケンサー&nbsp;</td><td>イルミナ Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>振とう水浴</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

facs単離マウスサテライト細胞のcut&amp;run解析のための効率的なプロトコール

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

小細胞集団を用いたゲノムワイド解析は、特に幹細胞分野における研究にとって大きな制約となります。この研究は、構造タンパク質を多く含む組織である四肢筋からのサテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)分離のための効率的なプロトコルについて説明しています。成体マウスの四肢の筋肉を解剖し、ディスパーゼおよびI型コラゲナーゼを添加した培地でミンチすることにより機械的に破壊した。消化後、ホモジネートをセルストレーナーでろ過し、細胞をFACSバッファーに懸濁しました。生存率は固定可能な生存率染色で決定し、免疫染色したサテライト細胞をFACSで単離しました。細胞をTriton X-100で溶解し、放出した核をコンカナバリンA磁気ビーズに結合させました。核/ビーズ複合体を、目的の転写因子またはヒストン修飾に対する抗体とインキュベートしました。洗浄後、核/ビーズ複合体をプロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼとインキュベートし、CaCl2でクロマチン切断を開始しました。DNA抽出後、ライブラリーを作製・配列決定し、ゲノムワイドな転写因子結合と共有結合ヒストン修飾のプロファイルをバイオインフォマティクス解析により取得しました。さまざまなヒストンマークについて得られたピークは、結合イベントがサテライト細胞に特異的であることを示しています。さらに、既知のモチーフ解析により、転写因子が同族の応答要素 を介して クロマチンに結合していることが明らかになりました。従ってこのプロトコルは大人のマウスの四肢筋肉衛星細胞の遺伝子の規則を調査するために合わせられる。

マウス骨格筋からのサテライト細胞は、Gunther et al.(以下、プロトコル1)12 およびLiuら23 (以下、プロトコル2)のプロトコルを組み合わせて単離した。プロトコル1で提案された濃度のコラゲナーゼとディスパーゼを使用すると、消化後に未消化の筋線維が観察されたため、ステップ1.2.1および1.2.3に記載されているように、酵素の量を増やして筋線維の解離を改善しました。プロトコル2に示されているように、サンプルは、細胞の生存率を維持するために、水浴中で穏やかに攪拌されました。プロトコル1で述べたように、細胞ストレーナーによるろ過、および赤血球溶解バッファーによるインキュベーションを実施しました(ステップ1.2.7〜1.2.10を参照)。プロトコル 1 では、細胞を 30%/70% のパーコール密度勾配にロードして、中間期に単核細胞を単離したため、目的の細胞が失われた可能性があります。したがって、このステップは、議定書2で提案されているように、省略されました。
FSC-Aゲーテ...

ここでは、マウス四肢筋サテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)単離のための効率的なプロトコルを、標的下での切断とヌクレアーゼを用いた放出による筋線維の転写制御の研究に適合させます(CUT&RUN)。

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&amp;RUN解析のための効率的なプロトコール

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

私たちの研究室では、20年以上前から核内受容体の病態生理学的役割に関心を持っています。in vivoの機能を解読するために、その発現を空間的・時間的に制御できるマウスモデルを作製しました。並行して、マウス組織における分子機能を調べるための最先端の技術を開発しました。私たちの科学的関心は、最近、骨格筋を含むさまざまな組織におけるセコステロイドおよびステロイド受容体のシグナル伝達を決定することにつながりました。我々は最近、骨格筋の細胞を分化させる筋線維のアンドロゲン受容体が、骨格筋の収縮機能や代謝機能に関与していることを実証しました。私たちの最近の発見は、筋肉関連疾患の効果的な治療法を開発するために不可欠な骨格筋の病態生理学的ダイナミクスのより深い理解を提供します。このプロトコールは、in vivoで筋幹細胞のシストロム解析を行えるように開発されました。以前のすべてのプロトコルは、in vitroモーダルを使用しており、調査を生物全体のコンテキストから完全に切り離します。低コストで時間効率が良いことに加えて、このプロトコルは骨格筋前駆細胞のトランスクリプション因子の募集そしてクロマチンの景色を調査する有効な実験設定を提供する。このプロトコルによって調製されたクロマチンは、サテライトセルにおけるARシストロムのゲノムワイドな分析を初めて提供し、遺伝子制御に関する将来の研究を促進します。私たちの将来の目標は、これらの研究を他のオキソステロイド受容体に拡張し、骨格筋の再生プロセスに関与するさまざまな細胞タイプにおけるそれらの特定の共調節因子を探索することです。

an-efficient-protocol-for-cut-run-analysis-facs-isolated-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。...

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。...

マウス心筋細胞の単離と生理解析

線維芽細胞の振る舞いは、さまざまな臨床実体の根底にありますが、それらは主にその固有の不均一性のために、特徴付けられていないままです。従来の線維芽細胞研究は、in vivoでの線維芽細胞の挙動をマスキングするin...

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。...

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

CUT&amp;RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&amp;RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。...

標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。...

FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

エピジェネティックな分野に不慣れな研究者は、CUT&amp;TagがChIPアッセイの非常に簡単な代替手段であることに気づくでしょう。CUT&amp;Tagは、希少細胞集団と初代細胞集団のエピジェネティック研究に多大な恩恵をもたらし、非常に少数の細胞から高品質のデータを生成しました。このプロトコールでは、マウス後肢筋から単離したマウス筋芽細胞に対するH3K4me1...

Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

このプロトコルは、HEK-293T細胞におけるNHEJおよびHRの効率を定量化するための染色体外非相同末端結合(NHEJ)アッセイおよび相同組換え(HR)アッセイについて説明しています。...

GFPベースのレポーターシステムを用いたHEK-293T細胞の非相同末端結合および相同組換え効率の解析

マウス脳皮質ペリサイトがscRNA-seqの要求を満たすために、CD13⁺/CD31⁻選択に基づく極めて最適化されたFACSプロトコルを提示します。私たちの主要な改良により、細胞の生存率とRNAの完全性が大幅に向上し、信頼性の高いトランスクリプトムプロファイリングが可能になります。...

FACSを用いたマウス皮質組織からのペリサイト分離

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶマウス筋肉サテライト細胞のFACS単離とCUT&RUN解析プロトコール。転写調節とアンドロゲン受容体の役割を解明し、筋関連疾患治療への応用を目指す革新的手法です。

FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

さらに動画を探す