Name: ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぶヒト末梢血モノ核由来マクロファージを用いたTrichoderma stromaticum分生子の貪食と生存率アッセイ。真菌が免疫細胞内で生存するメカニズムを解明し、真菌感染症治療法開発への応用可能性を示す。

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この活動は、ブラジルの金融機関であるFundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)の助成を受け、2012年RED0011および2014年RED008が助成されました。U.R.S.、J.O.C.、およびMESMは、それぞれCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES)とFAPESBによって付与された奨学金を認めています。

マクロファージの真菌クリアランス効率

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

Aspergillus fumigatus、Cryptococcus、Candida albicansなどのいくつかの真菌病原体にとって、分生子または酵母の食作用は、マクロファージと病原体の相互作用における細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです14,39,40。食作用は、トリコデルマと宿主の相互作用における重要なプロセスです。トリコデルマ属は、デクチン-1およびデクチン-2、Toll様受容体2およびToll様受容体4、MHC、およびNF-κB 25,28,41,42,43を含むいくつかの食作用<...

トリコデルマ属(目:Hypocreales、科:Hypocreaceae)は、他の真菌種の寄生虫であり、商業的に有用な酵素の範囲を生産することができる遍在する腐生菌で構成されています1。これらの真菌種は、異種タンパク質の生産2、セルロース3、エタノール、ビール、ワイン、紙の生産4、繊維産業5、食品産業6、農業の生物的防除剤7,8として使用されています。これらの真菌種に対する産業上の関心に加えて、ヒトにおける感染数の増加により、一部のトリコデルマ種は日和見病原体の地位を得ています9。
Trichoderma spp.は培養で急速に成長し、最初は白と綿のコロニーが緑がかった黄色から濃い緑色に変わります10。それらは広範囲のpHおよび温度条件で生息するように適応しており、日和見種は生理学的pHおよび温度で生き残ることができるため、さまざまなヒト組織にコロニーを形成します11,12,13。重要なことは、トリコデルマ属菌の感染率の上昇は病原性因子と関連している可能性があり、これらは十分に研究されていないことです。さらに、日和見トリコデルマ種に対する免疫応答の理解に焦点を当てた研究はまだまれです。
感染中、好中球とともに、マクロファージは食作用の原因となる防御線を表し、したがって、異なる組織における病原体の増殖およびコロニー形成を防止する。Toll様受容体やC型レクチン受容体などのパターン認識受容体を用いて、マクロファージは貪食菌をファゴリソソームに加工し、呼吸バースト、炎症誘発性サイトカインの放出、および食作用微生物の破壊を促進する14。しかし、食作用のメカニズムは、真菌細胞のサイズや形状など、さまざまな微生物戦略の影響を受け、回避される可能性があります。食作用を妨げるカプセルの存在。食作用誘導受容体の数を減少させる。細胞質におけるアクチン線維の構造のリモデリング。仮足の形成を妨げる。ファゴソームまたはファゴリソソームは、食作用プロセス後に脱出する14。
クリプトコッカス・ネオフォルマンスを含む多くの病原体は、マクロファージをニッチとして利用し、宿主内で生存し、播種し、感染を誘発する15。食作用およびクリアランスアッセイは、病原体に対する免疫応答を評価し、自然免疫系を回避するために採用された微生物戦略を特定するために使用されます15,16,17。この種の手法は、真菌の殺傷を減少させる食作用、ファゴソームの酸性化の遅延、および酸化的バーストの動態の違いを調べるためにも使用できます18。
貪食、真菌の生存、およびファゴソーム成熟過程の回避を評価するために、さまざまな方法を使用することができる。これらには、貪食、細胞位置、および食作用中に生成される分子を観察するために使用される蛍光顕微鏡法が含まれます19。フローサイトメトリーは、食作用に関する定量的データを提供し、プロセスに関与するさまざまなマーカーを評価するために使用されます20,21。生体内顕微鏡検査は、微生物の捕捉とファゴソームの成熟を評価するために使用されます22。病原体の食作用過程の特異性を評価するために使用される抗体媒介性食作用23;その他24,25,26,27。
ここに示されるプロトコルは真菌の分生子の食作用そして殺害を評価するのに光学顕微鏡および版の成長の試金を使用して共通の、安価、および直接方法を採用する。このプロトコルは、T. stromaticumに曝露されたヒト末梢血単核由来マクロファージを使用して食作用およびクリアランスアッセイを行うためのステップバイステップの指示を読者に提供します。PBMCが使用されたのは、トリコデルマ分生子が植物病原体に対する生物防除および植物作物のバイオ肥料として世界中で適用されており、トリコデルモ症と呼ばれるいくつかのヒト感染症を引き起こしているためです。それ以外に、トリコデルマ分生子とヒトの免疫系との相互作用に焦点を当てた先行研究は2つしかなく、マクロファージの好中球28とオートファジー29を調べました。本稿では、まずPBMC由来のマクロファージによるT. stromaticumの分生子の貪食を研究し、次に、巻き込まれた分生子の生存率を簡単な顕微鏡ベースの技術を用いて評価する方法を示します。このプロトコルは、マクロファージ関連の免疫応答または免疫系の調節関連メカニズムの研究をさらに促進する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>15mL遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>CLS431470</td><td>15mL遠心チューブ、ポリプロピレン、蓋付き円錐底、個別に滅菌</td></tr><tr><td>24ウェル平底細胞培養プレート</td><td>Kasvi</td><td>K12-024</td><td>ポリスチレン製、英数字識別付き。Cell Culture Plateは、DNase、RNase、パイロジェンを含まず、細胞毒性物質を含んでいません。ガンマ線で滅菌されています。</td></tr><tr><td>細胞培養用CO2インキュベーター</td><td>三洋電</td><td>機303082</td><td>CO2インキュベーターは、人体と同様の条件を作り出し、制御する役割を果たし、異なる細胞タイプのin vitro成長と増殖を可能にします。</td></tr><tr><td>遠心分離機用マイクロチューブ(エッペンドルフタイプ) 1.5mL</td><td>Capp</td><td>5101500</td><td>ポリプロピレン製で、チューブにキャップが取り付けられており、片手で開閉できます。これは、タンパク質の接着に対して、サンプルの視認性のために研磨された内部を持ち、DNase、RNase、パイロジェンを含まない</td></tr><tr><td>円形カバースリップ 15 mm</td><td>Olen</td><td>K5-0015</td><td>円形カバースリップは、細胞培養の顕微鏡技術に使用されます。超透明の半透明ガラス製。厚さ0.13mmの</td></tr><tr><td>クラスIIタイプB2(総排気)バイオセーフティキャビネット</td><td>エスコライフサイエンスグループ</td><td>2010274</td><td>エアストリームクラスIIタイプB2バイオセーフティキャビネット(AB2)は、製品、オペレータ、環境保護を提供し、生物学的安全レベルI、II、またはIIIに割り当てられた微量の有毒化学物質および薬剤を扱う作業に適しています。クラスIIタイプB2キャビネットでは、HEPA/ULPAろ過後、すべての流入空気と下降空気が外部環境に排出され、作業面を再循環することはありません。</td></tr><tr><td>デキストロースポテト寒天培地</td><td>メルク</td><td>145</td><td>ポテトデキストロース寒天は、酵母や菌類の栽培と列挙に使用されます EDTA</td></tr><tr><td>真空採血チューブ</td><td>FirstLab</td><td>FL5-1109L</td><td>EDTAは、細胞形態を保存するための最高の抗凝固剤であるため、血液学ルーチンに推奨される抗凝固剤です。</td></tr><tr><td>エンテラン</td><td>メルク</td><td>1.07961&nbsp;</td><td>固定剤;Entellanは、顕微鏡用の永久埋込用の水なし埋込剤です。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>A2720801</td><td>ウシ胎児血清(FBS)は a&nbsp;細胞および組織培養培地のユニバーサル成長サプリメント。FBSは、細胞の接着、増殖、増殖に必要なほとんどの因子の自然なカクテルであり、ほとんどの種類のヒトおよび動物(昆虫を含む)細胞に効果的です。</td></tr><tr><td>フラットアイコン</td><td></td><td></td><td>&nbsp;画像のデータベース</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>メルク</td><td>24900988</td><td>凍結保護剤グリセロールは、細胞や胞子の凍結に使用されます</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td></td><td></td><td>ポリスクロース溶液</td></tr><tr><td>画像 J</td><td></td><td></td><td>&nbsp;画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Precision</td><td>7105</td><td>顕微鏡用スライド 26 x 76 mm マットラップ 厚さ 1.0 〜 1.2 mm. 特殊な光学ガラス製で、欠陥のない高品質の透明性を持つシルク紙の仕切りでパッケージ化</td></tr>されています <tr><td>ミニ遠心分離</td><td>機 プリズム</td><td>C1801</td><td>プリズムミニ遠心分離機は、非常にコンパクトで、設置面積が非常に小さいように設計されています。最大6000rpmまで回転する交換可能な2つのクイックリリースローターが含まれています。電子ブレーキにより迅速な減速が可能で、自動開閉式の蓋によりサンプルに簡単にアクセスでき、取り扱い時間を短縮できます。</td></tr><tr><td>ノイバウアーチャンバー</td><td>Kasvi</td><td>K5-0011</td><td>ノイバウアーカウンティングチャンバーは、細胞やその他の懸濁粒子のカウントに使用されます。</td></tr><tr><td>パノプティックファスト&nbsp;</td><td>Laborclin</td><td>620529</td><td>Laborclin's&nbsp; パノプティックファストcは、血液学ペ</td></tr><tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン溶液 - 10,000U</td><td>LGC- バイオテクノロジー&nbsp;</td><td>BR3011001</td><td>抗生物質は、層流の外部操作による汚染の可能性を回避するために使用されます。</td></tr><tr><td>ペトリ皿 90 x 15 mm スムース</td><td>Cralplast</td><td>18248</td><td>使い捨てペトリ皿;透明度の高いポリスチレン(PS)製。平底;滑らか;サイズ:90 x 15 mm。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010001</td><td>PBSは、シンプルな配合の水性生理食塩水です。それは等張性であり、ほとんどの細胞に対して無毒です。塩化ナトリウムとリン酸緩衝液を含み、生細胞の水分バランスを維持しながら浸透圧ショックを防ぐように配合されています。</td></tr><tr><td>ピペットパスツール 3mL 滅菌済み</td><td>Accumax</td><td>AP-3-B-S</td><td>滅菌済み Accumax Pasteur 3 mLピペット、容量3 mL、透明低密度ポリエチレン(LDPE)製、個別滅菌</td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-HM16R</td><td>Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R 冷蔵遠心分離機は、ユーザーフレンドリーなコントロールパネルを備えた冷蔵遠心分離機で、速度、RCF値、 上映時間&nbsp;温度、および実行中のプロファイル。Megafuge 16Rは、最大速度に達することができます&nbsp;15,200 RPMと最大RCFは25,830 x g。</td></tr><tr><td>RPMI-1640 中型</td><td>メルク</td><td>MFCD00217820</td><td>HEPES修飾、L-グルタミンと25mM HEPES使用、重炭酸ナトリウムなし、粉末、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>シングルチャンネルマイクロピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>Z683809</td><td>シングルチャンネルマイクロピペットは、非常に少量の液体を正確に移送し、測定するために使用されます。</td></tr><tr><td>マイクロピペッター</td><td>Corning</td><td>4894</td><td>容量 10 & マイクロのヒント;Lと1,000 & マイクロ;L オートクレーブ可能な</td></tr><tr><td>三眼倒立顕微鏡</td><td>LABOMED</td><td>VU-7125500</td><td>チューブやボトル内の細胞を開けずに観察できるため、コンタミネーションの問題を回避できます。</td></tr></tbody></table>

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages

マクロファージは重要な防衛線であり、さまざまな組織における病原体の増殖とコロニー形成を防ぐ役割を担っています。分生子食作用は、マクロファージと病原体の相互作用に関与する細胞質および分子イベントの調査、および内在化された分生子の死亡時期の決定を可能にする重要なプロセスです。マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。食作用の回避とファゴソームの脱出は、真菌の病原性のメカニズムです。本稿では、生物防除・バイオ肥料剤として利用され、ヒトへの感染を誘発する真菌である T. stromaticum conidiaの食作用、クリアランス、生存率の解析に用いる手法について報告する。プロトコルは、1) トリコデルマ 培養、2)分生子を得るための洗浄、3)ポリスクロース溶液法を使用した末梢血単核細胞(PBMC)の隔離とマクロファージへのPBMCの微分、4)丸いガラスカバースリップと着色を使用した 生体外 食作用法、および5)分生子食作用後の分生子の生存率を評価するためのクリアランスアッセイで構成されています。要約すると、これらの技術は、マクロファージの真菌クリアランス効率を測定するために使用できます。

マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。貪食の回避とファゴソームの脱出は真菌の病原性のメカニズムであるため、 T. stromaticum 分生子の食作用を用いて、食作用後の分生子の生存率を評価した。研究者は、臨床的に関心のある種を調査する際に、最初のアッセイの1つとしてこれらの手法を実行する必要があります。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65231/65231fig02.jpg"> 図2:ヒト末梢血単核由来マクロファージによるT. stromaticum conidiaの貪食。(A)40倍以下、(B)100倍対物レンズの食作用態の代表...

マクロファージによる真菌分生子の食作用を含む技術は、真菌に対する免疫応答の調節を評価する研究に広く使用されています。この原稿の目的は、 Trichoderma stromaticum conidiaで刺激されたヒト末梢血単核由来マクロファージの食作用とクリアランス能力を評価する方法を提示することです。

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial ...

私たちの研究は、トリコデルマ菌と哺乳類の免疫系との相互作用を理解することに焦点を当てています。一部のトリコデルマ種はどのようにして病気を引き起こし、どのように免疫系を調節し、この調節が病気の発症にどのように影響するのでしょうか?この疑問に答えるために、in vitro 無作為化モデルを使用します。我々は、トリコデルマ種が食作用過程に関与する受容体を標的とすることにより、マクロファージと好中球を調節することを示しています。これらの受容体には、Toll様受容体およびレクチン受容体が含まれる。免疫細胞の食細胞能力が低下すると、病原体、特に細胞内病原体に対する感受性が高まります。現在進行形で、宿主で生き残るために多くの侵入メカニズムを持っています。これには、食作用の回避とマクロファージ内での生存が含まれます。病原体はマクロファージをトロイの木馬として利用し、宿主への播種を生き延びます。ここでは、トリコデルマがマクロファージ内で生存できるかどうか、およびそれらがどのくらいの期間生存するかを知るために、それを提案します。

viability-assay-trichoderma-stromaticum-conidia-inside-human

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JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila 外膜小胞: マクロファージにおける炎症誘発性の分離と分析。J. Vis.

外膜小胞で前処理されたマクロファージにおけるレジオネラニューモフィラ複製のアッセイ

このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用してアポトーシス細胞のクリアランスを研究するエフェロサイトーシスアッセイを実演します。エフェロサイトーシスは、アポトーシス細胞が食細胞に飲み込まれ、エフェロソームと呼ばれる小胞内で分解される多段階のプロセスです。このプロトコルは、個々のアポトーシス細胞の内在化部分と非内在化部分を視覚化し、エフェロサイトーシスを定量化する方法を提供します。...

Fixed Cell Efferocytosis Assay:蛍光顕微鏡を用いたマクロファージによるアポトーシス細胞のエフェロサイトーシス取り込みを研究する方法

このビデオは、蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してヒト好中球の抗真菌活性を分析するためのライブセルイメージングを示しています。最初に、好中球内では赤色とマゼンタの両方の蛍光が検出されますが、赤色の蛍光は時間とともに減少し、分生子の劣化を示し、好中球の抗真菌活性を確認します。...

初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します...

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

ここでは、イメージサイトメトリー、培養中の宿主細胞に対応付けて病原性真菌の定量に使用することができる方法を示す。この技術は、CFU列挙の代替として使用することができる。...

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

現在の記事は、真菌の病原性のメカニズムの知識を進めるために有用なツールとなり、人間のマクロファージとの通性細胞内のヒトの真菌病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を研究するためのin vitroでの細胞培養モデル系を確立するためのプロトコルの概要を説明します。...

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。...

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

この記事では、マクロファージをCryptococcus neoformansに感染させるためのプロトコルについて説明します。また、マクロファージからのステロールの枯渇方法についても説明します。これらのプロトコルは、in...

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)分化ヒト単球由来マクロファージの細胞培養のためのプロトコールが提示されます。このプロトコルは、単球の凍結保存とマクロファージへのバルク分化を組み合わせて利用します。その後、回収したマクロファージを、実験に必要な細胞密度の培養ウェルに播種することができます。...

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

ここでは、生細胞ビデオ顕微鏡と一緒に蛍光アスペルギルスレポーター分生子を使用してリアルタイムに初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性を評価し、フローサイトメトリーするプロトコルを記述します。生成されたデータは、殺菌活性、食作用、細胞遊走および真菌の成長の阻害のような宿主細胞- アスペルギルス相互作用への洞察を提供します。...

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em&gt; A。フミガーツス</em

ここでは、3次元(3D)コラーゲンIマトリックス中の初代ヒト単球由来マクロファージと腫瘍スフェロイドとの相互作用を調査するためのプロトコルを提示し、微小環境の可溶性および物理的特性が細胞浸潤に与える影響を比較する可能性を示します。...

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

学ぶヒト末梢血モノ核由来マクロファージを用いたTrichoderma stromaticum分生子の貪食と生存率アッセイ。真菌が免疫細胞内で生存するメカニズムを解明し、真菌感染症治療法開発への応用可能性を示す。

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内のトリコデルマ・ストロマティカム分生子の生存率アッセイ

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