Name: 蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶヒト偽島システムを用いた蛍光バイオセンサー動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価法。マイクロパーフュージョンシステムで細胞内シグナルとインスリン・グルカゴン分泌をリアルタイムに計測し、糖尿病におけるβ細胞機能異常の解明に貢献します。

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臓器提供者とその家族は、その貴重な寄付に感謝し、国際臓器調達機構、医学振興機構(IIAM)、および国立疾病研究交換(NDRI)は、ヒトの膵臓組織を研究に利用できるようにするためのパートナーシップを認められています。この研究は、Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393)、Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202)、DK106755、DK123716、DK123743、DK120456、DK104211、DK108120、DK112232、DK117147、DK112217、EY032442、DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center)、レオナ・M・アンド・ハリー・B・ヘルムズリー慈善信託、JDRF、米国退役軍人省(BX000666)、 国立衛生研究所(T32GM007347)、F30DK134041、F30DK118830、および国立科学財団大学院研究フェローシップ(1937963)のNIGMS。

ヒト偽島における細胞内シグナル伝達イベントとホルモン分泌

<ol><li>Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+systemic+insulin+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of systemic insulin function.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).</li>
<li>Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+glucagon+secretion+by+directly+modulating+cAMP+in+alpha+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells.</a> Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).</li>
<li>Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+islet+glucagon+secretion%3A+Beyond+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium.</a> Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).</li>
<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes%3A+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li>
<li>Halban, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-cell+failure+in+type+2+diabetes%3A+Postulated+mechanisms+and+prospects+for+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1+cell+function+and+gene+expression+are+compromised+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes.</a> Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).</li>
<li>Walker, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+human+pseudoislet+system+and+microfluidic+platform+demonstrate+differences+in+GPCR+signaling+in+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells.</a> JCI Insight. 5 (10), e06990(2020).</li>
<li>Giannoukakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+intact+human+islets+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Infection of intact human islets by a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).</li>
<li>Curran, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+pancreatic+islets+by+feline+immunodeficiency+virus+vectors1%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1.</a> Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).</li>
<li>Kayton, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+preparations+distributed+for+research+exhibit+a+variety+of+insulin-secretory+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).</li>
<li>Lenguito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resealable%2C+optically+accessible%2C+PDMS-free+fluidic+platform+for+ex+vivo+interrogation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets.</a> Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).</li>
<li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DAG+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).</li>
<li>Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+dynamics+in+the+pancreatic+%CE%B2-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Upsala+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).</li>
<li>Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triggering+pathway+to+insulin+secretion%3A+Functional+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+%CE%B2+cells+and+their+translational+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance.</a> Islets. 9 (6), 109-139 (2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

微小周融合システム、バイオセンサー発現偽島、レーザー走査型共焦点顕微鏡の統合により、細胞内シグナル伝達イベントと動的ホルモン分泌プロファイルの同期評価が可能になります。動的微小周輸システムは、一連の明確に定義された刺激を偽膵島に送達することができ、市販のELISAによってインスリンおよびグルカゴン濃度を測定できる廃液の収集を可能にする。同時に、共焦点顕微鏡プラットフォームによるバイオセンサー発現偽島体の生細胞イメージングは、細胞内シグナル伝達イベントに関する情報を提供するリアルタイムのバイオセンサー蛍光活性をキャプチャします。バイオセンサーシグナルとホルモン分泌プロファイルを経時的に同時に測定することで、膵島ホルモン分泌に対する細胞内シグナル伝達イベントの影響を直接比較することができます。
提示されたプロトコルの成功には、複数の考慮事項が鍵となります。これらには、バイオセンサーを発現する疑似膵島を生成することや、疑似膵島を動かさずに各実験中に一定の流量を使用することが含まれます。流速が 100 μL/分で、フラクション回収が 2 分の場合、各フラクションのペリフューセート容量は 2...

ランゲルハンス島は、膵臓全体に散らばる小さな器官であり、その機能はグルコースの恒常性の維持に不可欠です。インスリンは、グルコースの代謝、ATP/ADP比の増加、ATP感受性カリウムチャネルの閉鎖、原形質膜の脱分極、および細胞外カルシウムの流入に続いてベータ細胞から分泌されます1。アルファ細胞からのグルカゴン分泌はあまり理解されていませんが、細胞内およびパラクリン経路がグルカゴン顆粒エキソサイトーシスに寄与すると仮定されています2,3,4。1型糖尿病と2型糖尿病はどちらも膵島細胞機能障害と関連しています5,6,7。したがって、膵島ホルモン分泌を媒介する細胞内シグナル伝達経路の解明は、膵島における生理的・病態学的メカニズムの理解に不可欠です。
小島の球状構造は、実験に一定の障害をもたらします。これらの課題には、膵島サイズのばらつきや、膵島コア内のウイルス形質導入を減少させる膵島の3D特性が含まれる8,9。これらの課題を克服するために、初代ヒト膵島を単一細胞に分散させ、目的の標的をコードするコンストラクトでアデノウイルス形質導入し、再凝集して偽島と呼ばれるサイズ制御された膵島様構造を形成する偽膵島系が開発されました7。並行して培養された同じドナー由来の天然膵島と比較すると、これらの偽膵島は形態、内分泌細胞組成、およびホルモン分泌において類似している7。この方法は、偽膵島全体に構築物を発現させることを可能にし、初代ヒト膵島の均一な遺伝子操作に対する以前の障壁を克服することを意味する7,8,9。
このプロトコルでは、pseudoisletシステムはmicrofluidic装置と第一次人間の膵島のセルのbiosensorsを表現し、動的perifusion10,11,12の間にpseudoisletホルモンの分泌の一時的な決断を得るために統合される。偽膵島はマイクロチップ内に配置され、蠕動ポンプ12を介して異なる分泌促進物質の安定した流れに曝露される。マイクロチップは透明なガラス底を持ち、共焦点顕微鏡に取り付けられ、バイオセンサーの蛍光強度の変化を介して細胞内シグナル伝達の動態を記録します。バイオセンサーイメージングは、インスリンおよびグルカゴン分泌のその後の分析のために、微小周融合廃液の収集と同期されます7。大半融合と比較して、この微小半周融合アプローチは、大周輸チャンバー7と比較してマイクロ流体デバイスの体積が小さいため、使用する偽膵島が少なくて済む。
このシステムの有用性を活用するために、環状アデノシン一リン酸(cAMP)差分検出器 in situ (cADDis)バイオセンサーをヒト偽島で発現させ、cAMPの動態とホルモン分泌を評価しました。cADDisバイオセンサーは、cAMP 2(EPAC2)によって活性化された交換タンパク質のヒンジ領域に配置され、その調節領域と触媒領域をつなぐ円形に順列された緑色蛍光タンパク質(cpGFP)で構成されています。cAMPがEPAC2の調節領域に結合すると、ヒンジ領域の立体構造変化が誘発され、cpGFPからの蛍光が増加します13。cAMPなどの細胞内メッセンジャーは、Gタンパク質共役受容体の上流活性化後にインスリンおよびグルカゴン分泌を誘発する14。生細胞イメージングと微小ペリフュージョンを組み合わせることで、細胞内のcAMP動態と膵島ホルモン分泌を結びつけることができます。具体的には、このプロトコルでは、cADDis表現のpseudoisletsはさまざまな刺激にアルファおよびベータセルのcAMPの応答を監視するために生成される: 低いブドウ糖(2 mMブドウ糖;G 2)、高グルコースとイソブチルメチルキサンチン(IBMX;20 mMグルコース + 100 μM IBMX;G 20 + IBMX)、および低グルコースとエピネフリン(Epi;2 mMグルコース + 1 μM Epi;G 2 + エピ)。この処理ワークフローにより 、1) IBMXを介したホスホジエステラーゼ阻害により、細胞内のcAMPレベルの分解を防ぐこと、および2)βアドレナリン受容体の活性化によって媒介されるアルファ細胞グルカゴン分泌の既知のcAMP依存性刺激剤であるエピネフリンを介して、細胞内のcAMP動態を直接評価できます。生細胞イメージング実験用のマイクロペリフュージョン装置のセットアップ、マイクロチップへの偽膵島の装填、同期生細胞イメージングおよびマイクロペリフュージョン、およびマイクロプレートベースのホルモンアッセイによるバイオセンサーの痕跡およびホルモン分泌の分析のステップを以下に詳述する。

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-cADDis</td><td>Welgen</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>&nbsp;0.01インチFEPチューブ</td><td>IDEX</td><td>1527L</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Enriched-CMRL メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>1.5 mL およびコニカルチューブ</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;m PTFEフィルター</td><td>コールパーマー</td><td>SK-21940-41</td><td>8-10 RUごとに交換</td></tr><tr><td>100 mM ピルビン酸ナトリウム</td><td>Thermo Scientific</td><td>11360070</td><td>Enriched-CMRL Media Component</td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td>Decon labs</td><td>2816</td><td>酸性エタノール Component</td></tr><tr><td>200 mM GlutaMAX-I Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Enriched-CMRL Media Component</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td>DMEM Perifusion Buffer Component</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7888</td><td>DMEM Perifusion Buffer Component</td></tr><tr><td>Bubble trap&nbsp;</td><td>オムニフィット</td><td>006BT</td><td></td></tr><tr><td>セルキャリア ULA&nbsp;96ウェルマイクロプレート</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055330</td><td></td></tr><tr><td>cellSens解析ソフトウェア</td><td>Olympus</td><td>v3.1</td><td>データ解析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>CMRL 1066</td><td>MediaTech&nbsp;</td><td>15-110-CV</td><td>Enriched-CMRL Media Component</td></tr><tr><td>Conical adapter (IDEX, P-794)</td><td>IDEX</td><td>P-794</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>Glucose Buffer Component</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>D5030</td><td>DMEMペリフュージョンバッファーコンポーネント環境</td></tr><tr><td></td><td>チャンバーokolab</td><td>IX83</td><td></td></tr>エ<tr><td>ピネフェリン(エピ)</td><td>シグマ</td><td>E4250</td><td>刺激バッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)、熱不活性化</td><td>シグマ</td><td>12306C</td><td>濃縮CMRLメディアコンポーネント</td></tr><tr><td>グルカゴンELISA</td><td>メルコディア</td><td>10-1281-01</td><td></td></tr><tr><td>グルカゴンキット HTRF</td><td>Cisbio</td><td>62CGLPEH</td><td></td></tr><tr><td>HCl (12N)</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Acid エタノール 成分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7523</td><td>DMEM Perifusion Buffer Component</td></tr><tr><td>iCell 内皮細胞 培地サプリメント</td><td>細胞ダイナミクス</td><td>M1019</td><td>iEC 培地 部品</td></tr><tr><td>Idex ダーリンナット&フェルール 1/4-24</td><td>コールパーマー</td><td>EW-00414-LW</td><td></td></tr><tr><td>インスリン ELISA</td><td>メルコディア</td><td>10-1113-01</td><td></td></tr><tr><td>イソブチルメチロニン (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>刺激緩衝液成分</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Σ</td><td>G8540</td><td>DMEM ペリフュージョンバッファー成分</td></tr><tr><td>マイクロチップ (マイアミ大学、FP-3W)</td><td>マイアミ</td><td>大学FP-3W</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチップホルダー&nbsp;</td><td>Micronit Microfluidics</td><td>FC_PRO_CH4525</td><td></td></tr><tr><td>Model 2110 フラクションコレクター</td><td>Biorad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>P10, P200, and P1000 ピペットとヒント</td><td>Any</td><td>Any Penicillin</td><td></td></tr><tr><td>/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Enriched-CMRL Media Component</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ&nbsp;</td><td>Instech</td><td>P720</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>ウォッシュ島</td></tr><tr><td>Sarstedt皿 Sarstedtは</td><td></td><td>皿の直径</td><td></td>に依存します</tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S6014</td><td>DMEM Perifusion Buffer Component</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>P2256</td><td>&nbsp;DMEM Perifusion Buffer Component</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Filter (0.22 &mu;m)</td><td>ミリポア</td><td>SCGP00525</td><td>すべてのバッファーを2回ろ過</td></tr><tr><td>VascuLife VEGFミディアムコンプリートキット</td><td>LifeLine Cell Technology</td><td>LL-0003</td><td>iECメディアコンポーネント</td></tr></tbody></table>

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

ランゲルハンス膵島は、膵臓全体に点在する特殊な内分泌細胞と支持細胞の小さな3Dコレクションであり、血糖値を下げるベータ細胞によるインスリンの分泌と、血糖値を上昇させるアルファ細胞によるグルカゴンの分泌を介して、グルコースホメオスタシスの制御に中心的な役割を果たしています。cAMPによって媒介されるものを含む細胞内シグナル伝達経路は、アルファ細胞およびベータ細胞ホルモンの分泌調節に重要です。3D膵島構造は、協調的な膵島機能に不可欠ですが、初代ヒト膵島細胞における細胞内シグナル伝達経路の機構研究には実験上の課題があります。これらの課題と制限を克服するために、このプロトコルでは、形態、組成、および機能において天然の膵島に類似している糖尿病のないドナーから生成された一次ヒト偽膵島を使用して、統合された生細胞イメージングおよびマイクロ流体プラットフォームについて説明します。これらの偽膵島は、初代ヒト膵島細胞の分散および再凝集プロセスを通じてサイズ制御されます。分散状態では、膵島細胞の遺伝子発現を操作し得る。例えば、遺伝子コードされたcAMPバイオセンサ、cADDisなどのバイオセンサを導入することができる。いったん形成されると、遺伝子にコードされたバイオセンサーを発現する偽膵島は、共焦点顕微鏡および微小周融合プラットフォームと組み合わせることで、蛍光バイオセンサーの動態とアルファ細胞およびベータ細胞ホルモン分泌プロファイルの同期評価を可能にし、細胞のプロセスと機能に関するより多くの洞察を提供します。

バイオセンサーを発現するヒト偽膵島は、cAMPバイオセンサーcADDisをコードするコンストラクトのアデノウイルス送達によって作製されました(図1A)。図1Bは、形質導入したヒト膵島細胞の経時的な再凝集を示しており、6日間の培養後に完全に形成された偽膵島が観察されています。細胞は48時間以内に可視的なcADDis蛍光を示し始め、培養期間の終わりまでに形質導入細胞で高いバイオセンサー発現が見られました。このプロトコルを用いて、偽膵島はアルファ細胞で60%、ベータ細胞で95%の平均形質導入効率を示しました(図1C-D)。
図2は、マイクロ流体と生細胞のイメージングプラットフォームを統合したものです。cADDisを発現する偽膵島を回収し、新鮮な培地で一晩インキュベートさせた後、偽膵島をマイクロチップ上...

このプロトコルは循環アデノシンの一リン酸塩(cAMP)の生物センサー、 その場 (cADDis)のcAMPの相違の探知器のアデノウイルス配達を使用して細胞内シグナリングでき事およびインシュリンおよびグルカゴンの分泌およびmicroperifusionシステムの同時獲得そしてco登録のための方法を記述する。

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

当研究室では、1型糖尿病、2型糖尿病におけるβ細胞機能障害などの眼瞼異常の解明、予防、回復に取り組んでいます。ヒトの膵臓とまぶたの生物学と健康と病気の研究を統合して、ヒト糖尿病の病態に着目した研究を行っています。ヒトのアイレットは3Dの球状構造であり、アイレット全体の細胞にアクセスするには、実験上の課題があります。例えば、アイレット細胞のシグナル伝達を理解するためにバイオセンサーを導入しようとする場合、私たちの疑似まぶたプロトコルは、単一細胞状態で遺伝子操作を行い、これらの形質導入されたヒトアイレット細胞を偽まぶたに集約して下流の研究を行うことで、この課題を克服します。私たちの疑似まぶたシステムは、まぶたの表面だけでなく、アイレット全体にバイオセンサーを発現させることができます。当社のライブセルイメージングおよびマイクロ灌流システムと組み合わせることで、下流のホルモン分泌を伴う動的な細胞内プロセスを測定し、共登録することができます。このプロトコルは、さまざまな重要な科学的質問に答えるために適用できます。例えば、遺伝子サイレンシング戦略をこのアプローチと組み合わせることで、眼瞼機能および関連するシグナル伝達経路に対する目的遺伝子の影響を、全体的または自己特異的な方法で理解することができます。

human-pseudoislet-system-for-synchronous-assessment-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マイクロ流体膵島perifusionデバイスは、複数の島とカルシウム流入とミトコンドリアの潜在的な変化の同時蛍光イメージングの動的なインスリン分泌の評価のために開発されました。...

マイクロ流体Perifusionデバイス内のマルチパラメトリック膵島Perifusionシステム

ここでは、ヒト膵島細胞と初代筋管の概日生物発光と分泌活性を並行して監視するための設定について説明します。このために、ルシフェラーゼコアクロックレポーターのレンチウイルス遺伝子導入を採用し、続いてin...

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

PHluorin、pH に敏感な緑色蛍光タンパク質を用いたそのまま膵ランゲルハンス島のインスリン分泌の可視化のためのプロトコルについて述べる。膵島は、小胞貨物ニューロペプチド Y に結合された pHluorin をエンコード アデノ...

共焦点イメージングの神経ペプチド Y-pHluorin: そのままのマウスと人間のランゲルハンス島におけるインスリン開口分泌の可視化技術

ここでは、提案する均質な時分割フレット (HTRF)...

均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

このプロトコルは、β細胞からのインスリン分泌のプロキシとしてインスリン連結ガウシアルシフェラーゼを使用して中程度のスループットで迅速な低コストルシフェラーゼアッセイを行う方法について説明する。アッセイは、ほとんどの発光プレートリーダーおよびマルチチャンネルピペットで行うことができる。...

共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

このプロトコルは、死亡した臓器提供者からヒトの膵臓スライスを生成して、生理学的に近い条件下で細胞機能を研究する方法を説明しています。この革新的なアプローチにより、正常および構造的に損傷した膵島と、内分泌コンパートメントと外分泌コンパートメント間の複雑な相互作用の調査が可能になります。...

内分泌および外分泌膵臓生理学を研究するためのヒト膵臓組織スライスの生成

選択、マイクロインジェクション、および蛍光を経由して蛍光標識F...

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

説明は簡単で、密度に依存しない濃縮のためのビオチンリンカーを転送するために、クリックケミストリー、続いて5-HMCにアジド-グルコースを転送するために、β-グルコシルトランスフェラーゼ（β-GT）を用いた二段階ラベリングプロセスである。この効率的で特異的標識法は、次世代シーケンシングを介して非常に低いバックグラウンドと高いスループットepigenomicマッピングで5-HMCの濃縮を可能にします。...

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

私たちは、勉強のための堅牢な生化学的および顕微鏡的手法を提示...

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

学ぶヒト偽島システムを用いた蛍光バイオセンサー動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価法。マイクロパーフュージョンシステムで細胞内シグナルとインスリン・グルカゴン分泌をリアルタイムに計測し、糖尿病におけるβ細胞機能異常の解明に貢献します。

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

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