Name: 11倍膨張顕微鏡によるユニバーサル分子保持 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶ拡張顕微鏡法Magnifyによるナノスケールイメージング手法。様々な生体試料や臨床組織を最大11倍に膨張させ、15ナノメートルの高解像度で複雑な生物学的構造を可視化します。特殊な機器を不要にし、神経科学や臨床病理学の研究を加速させます。

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この研究は、カーネギーメロン大学とD.S.F.慈善財団(Y.Z.およびX.R.)、国立衛生研究所(N.I.H.)の支援を受けました。ディレクターズニューイノベーターアワードDP2 OD025926-01、およびカウフマン財団。

動物を含むすべての実験手順は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って実施され、カーネギーメロン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。ヒト組織サンプルを商業的に入手した。
1.ストック試薬および溶液の調製
注:使用する試薬のリストについては、 材料表 を参照してください。
<ol><li>ゲル化原液を調製します。これらは、ゲル化工程の直前に組み合わされる。<ol><li>モノマーストック溶液(4 g / 100 mL N,N-ジメチルアクリルアミド酸[DMAA]、50 g / 100 mLアクリル酸ナトリウム[SA]、66.7 g / 100 mLアクリルアミド[AA]、0.10 g / 100 mL N、N'-メチレンビスアクリルアミド[ビス]、33 g / 100 mL塩化ナトリウム[NaCl]、1xリン酸緩衝生理食塩水;PBS)を 表1に列挙した成分を用いた。すべての原液を水に溶解または希釈します。モノマーストック溶液は、4°Cで少なくとも3ヶ月間保存することができる。</li>
		<li>以下のストック溶液を水中で別々に調製する:0.5%(w/w)4-ヒドロキシ-TEMPO(4HT)は組織へのモノマー拡散中のゲル化を阻害し、10%(w/w)テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)は過硫酸アンモニウム(APS)によって開始されるラジカル生成を促進し、10%(w/w)で調製される。 注:ストック溶液は1〜2 mLのアリコートに分配し、4°Cで最大3か月間保存できます。しかしながら、APSはゲル化溶液を調製する直前に作られる。</li>
	</ol></li>
	<li>SDS 1 g、尿素48.048 g、EDTA 5 mL (0.5M、pH 8)、10x PBS 20 mL、トリス (2 M)、グリシン 0.75 g を組み合わせて、ホモジナイズバッファー (1% w/v S.D.S., 8 M 尿素, 25 mM EDTA, 25 mMP, pH 8, 室温 [R.T.]) を調製します。総容量100mLになるように水を加える。ソリューションは必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンでき、R.T.に保存できます。</li>
</ol>2.アーカイブおよび新たに調製された臨床組織スライドのための組織調製
注:組織の前処理手順は、標本の調製方法によって異なります。
<ol><li>ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)臨床サンプルについては、以下の手順に従ってください。<ol><li>サンプルを連続した一連の溶液(スライドガラス染色ジャーまたは50 mLコニカルチューブを使用できます):キシレン、95%エタノール、70%エタノール、および50%エタノール、続いて二重脱イオン水に入れます。各溶液を毎回少なくとも3分間2回使用します。.鉗子を使用してスライドを容器に入れ、それぞれの溶液15 mL(サンプルを覆うのに十分)を追加します。キャップ付きの円錐形チューブを室温のシェーカーに水平に置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>染色され、永久スライドにマウントされたサンプルについては、以下の手順に従ってください。<ol><li>スライドをキシレンに短時間置き、かみそりの刃などの適切なツールを使用してカバーガラスを慎重に取り外します。カバーガラスが動かなくなったままの場合は、カバーガラスが緩むまでキシレンのスライドを室温に戻します。</li>
		<li>次に、サンプルをFFPEサンプルとして処理します(手順2.1.1)。 注:ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色スライドの場合、ヘマトキシリンおよびエオジン染色は拡張プロセス中に失われます。</li>
	</ol></li>
	<li>最適切断温度(OCT)溶液中で未固定の凍結組織スライドの場合は、組織をアセトン中で-20°Cで10分間固定してから、サンプルを1x PBS溶液で室温で毎回10分間3回洗浄します。</li>
	<li>以前に固定した凍結臨床組織スライドについては、スライドを室温で2分間インキュベートしてOCTを溶かし、次に1x PBS溶液で室温で毎回5分間3回洗浄します。</li>
</ol>3. パラホルムアルデヒド固定マウス脳の組織作製
<ol><li>厚さ30〜50μmのマウス脳切片については、このプロトコルに従ってください。 注:より大きなセクションで成功する可能性がありますが、モノマー溶液の拡散と均質化にはより長い時間が必要になる場合があります。</li>
	<li>切片が現在1x PBS溶液(例えば、1x PBS中の30%[v/v]グリセロールおよび30%[v/v]エチレングリコール溶液)に保存されていない場合は、6〜24ウェルプレート中の1x PBSで室温で毎回少なくとも10分間3回洗浄します。</li>
	<li>コーティングされていないガラス顕微鏡スライドを入手します。スライドガラスの片面がコーティングされている場合は、濡れた絵筆を使用してコーティングされていない面を確認します(多くの場合、コーティングされた面のラベルはすりガラスでできており、濡れると不透明になります)。</li>
	<li>ペイントブラシを使用して、コーティングされていないスライドを濡らします。マウスの脳組織を絵筆でウェルプレートから取り出し、ローリングモーションを使用してスライド上に慎重に置き、組織が平らであることを確認します。すべての切片が取り付けられるまで、余分なPBSを組織に残します。 注:単一のスライドガラスを複数の組織切片に使用できますが、一度にさらに多くの組織切片をゲル化する場合は(別々のスライドであっても)、完全に乾かないようにさらに注意する必要があります。</li>
	<li>実験用の紙布を使用して、スライドから余分なPBSの大部分を取り除きます。各組織セクションの周りに小さな液体リングを残しますが、スライドの残りの部分はほとんど乾いたままにします。この残りの液体は、ゲルモノマー溶液が調製されている間、組織を覆います。</li>
</ol>4.ゲル化
注:このプロトコルは、この技術で使用するために準備されたすべての組織タイプに適しています。
<ol><li>組織切片の両側にスペーサーを塗布して(図2A)、組織の圧迫を防ぎます。そのためには、先端が菱形のペンでカバーガラスを薄く切ってスペーサーを作り、少量の水または1x PBSでスライドに固定するか、少量の瞬間接着剤で固定します。次に、スペーサーを組織の両側にそっと置きます。</li>
	<li>最終的なゲル化溶液を調製する。一般に、組織切片あたり~200 μLで十分ですが、容量はスライドあたり800 μLを超えてはなりません。これ以上ゲル化する溶液は、波及効果をもたらします。 注:メタクロレインは、生体分子をゲルに固定するために使用されます。しかしながら、別個の固着工程は必要なく、メタクロレインを最終ゲル化溶液に直接添加してもよい。<ol><li>セクションごとに、以下を順番に組み合わせます:200 μLのモノマー溶液、0.5 μLの0.5%4HTストック溶液(1:400希釈)、0.2〜0.5 μLのメタクロレイン(組織の種類に応じて1:400〜1:1,000希釈;通常、パラホルムアルデヒド[PFA]固定サンプルには1:1,000希釈、FFPE臨床検体には1:400希釈)、2 μLの10%TEMEDストック溶液(1:100希釈)、 5 μLの10%A.P.S.ストック溶液(1:40希釈)。 注意: 使用直前に最終的なゲル化溶液を調製してください。時期尚早のゲル化を防ぐために、APS溶液を最後に追加します。</li>
	</ol></li>
	<li>組織切片から余分な溶液を取り除き、スライドをペトリ皿に入れます。調製したばかりのコールドゲル化溶液をすべてサンプルに加え、組織上で4°Cで30分間インキュベートして、組織への拡散を可能にします。</li>
	<li>2枚目のコーティングされていないスライドガラスを組織とゲル溶液の上に注意深く置きます。気泡は避けてください(図2B)。 注意: 気泡がティッシュの上に閉じ込められた場合は、ガラスの蓋を慎重に持ち上げて元に戻すことができます。さらに、こぼれたモノマー溶液は重合後にトリミングすることができ、組織に問題を引き起こすことはありません。</li>
	<li>重合が完了していることを確認します。この重合は2つの方法で行うことができ、それぞれが同様の結果をもたらす。まず、加湿環境(湿らせたペーパータオルで閉じたペトリ皿など)で37°Cでサンプルを一晩インキュベートします。あるいは、より迅速に重合するには、加湿雰囲気中でサンプルを37°Cで2時間インキュベートした後、60°Cで1時間インキュベートします。</li>
</ol>5. サンプルの消化と組織拡張
注:このプロトコルは、すべての組織タイプに適しています。
<ol><li>目の保護具を着用し、ゲル化チャンバーの2つのスライドガラスの間にかみそりの刃をスライドさせて分離します。 注意: スライドガラスは非常に簡単に分離するはずです。ゲルの異なる部分が両方のスライドに付着している場合は、絵筆を使用してゲルを一方または他方に導くことができます。重合中にゲルが特に乾燥している場合は、1x PBSをゲルチャンバーの外側に塗布できますが、組織が均質化される前にゲルが膨張し、ひび割れが発生するため、ゲルを完全に沈めないでください。</li>
	<li>ボリュームを最小限に抑えるために、組織の周りのブランクジェルをトリミングします。ゲルを非対称に切断すると、サンプルが完全に透明になるため、均質化後のゲルの配向を追跡できます。</li>
	<li>組織を含むゲルをかみそりの刃でスライドからそっと持ち上げ、絵筆で2 mLの遠沈管にそっと移します。</li>
	<li>80°Cに予熱したホモジナイズバッファー(表2)でチューブの上部を満たします。</li>
	<li>サンプルを振とうしながら80°Cで8時間(PFA固定マウス脳の場合)または60時間(ほとんどのFFPE臨床サンプル; 表3を参照)インキュベートします。 注:均質化時間は、組織の種類と固定方法によって異なります。これらの条件の多くはすでに検証されていますが、他の条件については最適化が必要な場合があります。</li>
	<li>遠心チューブの内容物を6ウェルプラスチック細胞培養プレートのシングルウェルに注ぎます。</li>
	<li>トランスファーピペットで変性バッファーを除去します。</li>
	<li>ヒドロゲルから残りのSDSを完全に除去するには、以下のように1%非イオン性界面活性剤(C12E10)溶液でサンプルを洗浄します:室温で毎回10分間少なくとも3回;60°Cで60分間;その後、室温で毎回10分間さらに3回洗浄します。</li>
	<li>サンプルを1x PBS + 0.02%アジ化ナトリウムに4°Cで保存し、膨張後の染色とイメージングを行う必要があります。 注:この時点で、サンプルは組織の種類に応じて、各次元で~3-4.5倍大きくする必要があります。</li>
</ol>6. 拡張後の生体分子プロファイリング
<ol><li>抗体染色 注:これは、一般的な免疫蛍光(IF)/免疫組織化学(I.H.C.)染色プロトコルに従います。使用される一次抗体および二次抗体の量は、製造業者が提案する濃度、または特定の実験のための最適化によって異なります。個々のバッファーは、ユーザーの裁量で置き換えることができます。<ol><li>サンプルを6ウェル細胞培養プレートの単一ウェルに入れ、膨張したサンプルをR.T.の1x PBSで毎回10分間3回洗浄し、液体をピペットで移す。</li>
		<li>オプションのブロッキングステップ(例えば、1x PBS中の3%ウシ血清アルブミン/0.1%Triton-X100)を室温で少なくとも1時間、または4°Cで一晩実行します。</li>
		<li>一次抗体を染色バッファー(例えば、0.1% Triton-X100 1x PBS または 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L ヘパリン)中で、37 °Cで一晩インキュベートします。 サンプルサイズに応じて、0.5〜2 mLがゲルを適切に覆う必要があります。</li>
		<li>サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。</li>
		<li>対応する二次抗体を、選択した染色バッファー中で37°Cで3時間インキュベートします。</li>
		<li>サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>NHSエステル汎タンパク質染色<ol><li>サンプルを6ウェルプレートに入れて、1〜2 mLのポリエチレングリコール(PEG 200)をサンプルに注ぎます(完全に覆うのに十分です)。 注意: 組織は収縮し、元の拡張前のサイズ(またはそれに近いサイズ)に戻る必要があります。</li>
		<li>13.3-80 μg/mLに希釈した蛍光色素結合NHSエステルで、1-2 mLの染色バッファー(例えば、1x PBS、2x S.S.C.、または100 mM重炭酸ナトリウム溶液)中でR.T.で3時間染色します。</li>
		<li>サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>脂質染色 注:拡張後脂質染色は、固定プロセス中に脂質が失われるため、FFPE臨床サンプルには有効ではありません。<ol><li>サンプルを室温の1x PBSで毎回少なくとも10分間3回洗浄します。</li>
		<li>2 mLの0.1%TritonX-100/1x PBSで200倍に希釈した従来の親油性色素(DiO、DiI、またはDiD)を室温で72〜96時間塗布します。</li>
		<li>1x PBSで少なくとも3回洗ってください</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)<ol><li>ホモジナイズしたゲルサンプルを、60°Cに30分間予熱したハイブリダイゼーションバッファーに入れます。</li>
		<li>FISH用のハイブリダイゼーションバッファーを調製します:2x S.S.C. (300 mM NaCl、30 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.0)、10%(v/v)デキストラン硫酸塩、20%(v/v)エチレンカーボネート、および0.1%(v/v)Tween20を組み合わせます。</li>
		<li>ゲルサンプルを、標的遺伝子に対する10 pM(オリゴあたり)のFISHプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー(10 kbあたり少なくとも20プローブ)で45°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>ストリンジェンシーウォッシュバッファー(2x S.S.C.および0.1%Tween20)で2回、45°Cで毎回15分間洗浄します。</li>
		<li>ストリンジェンシーウォッシュバッファーでさらに2回、37°Cで毎回10分間洗浄します。</li>
		<li>最後に、1x PBSで少なくとも3回、室温で毎回10分間洗浄します。</li>
		<li>サンプルは、1x PBS + 0.02%アジ化ナトリウム(4°C)でイメージングまたは保存する準備ができています。</li>
	</ol></li>
	<li>完全な組織拡張と蛍光イメージング 注:Magnifyで達成可能な拡張係数は、組織の種類と拡張方法によって異なります(完全な要約は 表3にあります)。ただし、一般的な推定値として、Magnifyサンプルは、1x PBSで3〜4.5倍、ddH2Oで1:50に希釈されたPBSで5〜7倍、ddH2Oで8〜11倍に拡大します。イメージングに最適な拡張係数は、各実験のニーズによって異なります。膨張係数は非常に調整可能であり、さまざまなスケールでのイメージングのために、単一のサンプルを何度も拡大および縮小できます。<ol><li>PBSで4倍に拡大したサンプルを、ペイントブラシを使用してガラス底の6ウェルイメージングプレートに移動します。さらに拡大したサンプルを細かく切るか、柔軟なプラスチックの薄い部分で大きなガラス底のイメージングプレートにそっと入れて移動します。</li>
		<li>従来の広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、または選択した別のイメージングシステムを使用して蛍光イメージングを実行します。紙の実験布でゲルの周りの余分な液体を取り除くと、イメージング中のゲルの動きを防ぐことができます。ゲルは、イメージング前にガラス表面に0.1%ポリ-L-リジンを塗布することによって固定化することもできます。 注:ポリ-L-リジンを適用すると、接触時にゲルが完全に動かなくなります。このため、ゲルを折りたたんだり伸ばしたりせずにガラスに塗布するように注意する必要があります。さらに、ポリ-L-リジンでコーティングされたガラス上でゲルを完全に乾燥させると、除去が困難になる可能性があるため、ゲルを完全に乾燥させたり、ポリ-L-リジンでガラスに付着したままゲルをPBSで収縮させたりしないでください。</li>
		<li>イメージング後、蛍光シグナルの劣化によりサンプルをddH2Oに長期間保存することは推奨されないため、毎回少なくとも3回の洗浄で1x PBSでサンプルを収縮させます。特に、親油性色素で染色された完全に膨張したサンプルは、水中での色素の解離を防ぐために、できるだけ膨張時間の近くに画像化する必要があります。</li>
		<li>サンプルを1x PBS + 0.02%アジ化ナトリウム中、4°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>

堅牢な11倍拡張のための拡張顕微鏡

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</ol>

著者らは、次の競合する金銭的利益を宣言します:Y.Z.、A.K.、Z.C.、およびB.R.G.は、MagnifyとExMに関連するいくつかの発明を発明しました。

ここでは、単一の化学的アンカーで複数の生体分子を保持し、熱変性により困難なFFPE臨床検体を最大11倍まで拡張できるExMバリアントであるMagnifyプロトコル17を紹介します。このプロトコルを他のExMプロトコルと区別する主な変更点には、完全に拡張しても機械的に堅牢なままである再製剤化ゲルの使用、および生体分子アンカーとしてのメタクロレインの使用が含まれます。このプロトコルの最も重要なステップは次のとおりです:1)最終的なゲル溶液の組成。2)ゲル化工程のタイミング;3)ゲル化チャンバーのセットアップ。4)サンプル均質化のパラメータ。5)膨張後染色前のサンプルからのSDSの十分な洗浄。
このプロトコルの最も重要なパラメータは、最終的なゲル化溶液の組成、特に生体分子アンカーメタクロレインの濃度です。異なる組織タイプを拡張するには、異なるメタクロレイン濃度が必要であり(表3)、この値が拡張されるサンプルによく一致するように注意する必要があります。メタクロレインによるオーバーアンカーは、拡張因子の減少と拡...

生物学的システムは、手足や臓器からナノスケールのタンパク質レベルまで、構造的な不均一性を示します。したがって、これらのシステムの動作を完全に理解するには、これらのサイズスケール全体で目視検査が必要です。しかし、光の回折限界は、従来の蛍光顕微鏡で~200-300nmより小さい構造を可視化する際に課題を引き起こす。さらに、誘導放出空乏法(STED)、光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、構造化照明顕微鏡法(SIM)などの光学超解像法1,2,3は強力ですが、高価なハードウェアと試薬を必要とし、取得時間が遅く、大量の画像を3Dで画像化する能力が低いことが多いため、独自の課題があります。
膨張顕微鏡4(ExM)は、生体分子を水膨潤性ポリマーゲルに共有結合で固定し、物理的に引き離して従来の光学顕微鏡で分解できるようにすることで、光の回折限界を回避する代替手段を提供します。10年足らず前にExMが最初に発表されて以来、多数のExMプロトコルバリアントが開発されており、これらのプロトコルにより、タンパク質5、6、7、RNA8、9、10、または脂質11、12、13を直接組み込むことができます単一のステップ14または複数の反復ステップ15、16のいずれかで、化学的アンカーを変更するか、サンプルをさらに拡張する(したがって、有効分離を改善する)ことにより、ゲルネットワークに導入します。最近まで、単一のExMプロトコルは、単一の市販のケミカルアンカーでこれら3つの生体分子クラスを保持しながら、1回の拡張ラウンドで~10倍に拡張できる機械的に頑丈なゲルを提供することはできませんでした。
ここでは、メタクロレインを生体分子アンカーとして使用するExM兵器庫に最近追加されたMagnify17を紹介します。メタクロレインは、パラホルムアルデヒドのような組織と共有結合を形成し、さまざまな特異的またはカスタムのアンカー剤を必要とせずに、複数のクラスの生体分子をゲルネットワーク内に保持できるようにします。さらに、この手法は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床サンプルなどの悪名高い困難なサンプルを含む、幅広い組織のスペクトルを最大11倍に拡張できます。このような機械的に硬いサンプルを増殖させる以前の方法では、過酷なプロテアーゼ消化が必要となり、サンプルが膨張した後は目的のタンパク質の抗体標識が不可能でした。対照的に、この手法では、高温変性溶液を使用してFFPE臨床サンプルの拡張を実現し、ゲル内の全タンパク質エピトープを保存し、拡張後のイメージングのターゲットにすることができます(図1)。

<table><tbody><tr><td>4-ヒドロキシ-テンポ(4HT)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>176141</td><td>阻害剤</td></tr><tr><td>6ウェルガラス底板(#1.5カバーガラス)</td><td>セルビス</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A8887</td><td>ゲルモノマー成分</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Initiatior</td></tr><tr><td>DAPI(1 mg / mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>デカエチレングリコールモノドデシルエーテル(C12E10)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9769</td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ No. 88 CM</td><td>General Tools</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td></td><td></td>111000200</tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 酸 (EDTA) 0.5 M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td>均質化緩衝液</td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td>均質化緩衝液 ヘ</td></tr><tr><td>パリン</td><td>Σ Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>メタクロレイン</td><td>Σ Aldrich</td><td>133035</td><td>アンカーエージェントマイクロ</td></tr><tr><td>カバーガラス#1(24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス#1.5(24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;- テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>加速器</td></tr><tr><td>N,N&prime;-メチレンビスアクリルアミド(ビス)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td>ゲルモノマー成分</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルアクリルアミド (DMAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>274135</td><td>ゲルモノマー成分</td></tr><tr><td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish</td><td>Thermo Fisher</td><td>167063</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon 6-Well Cell Culture Dish</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc> 15mL&nbsp;円錐</td>形<td>サーモフィッシャー</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&�o; 50mL&nbsp;円錐</td><td>形サーモフィッシャー</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)、10倍溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール&nbsp; 200</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P-3015</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK(分子生物学グレード)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Fischer Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>アクリル酸ナトリウム (SA)</td><td>AK Scientific</td><td>R624</td><td>ゲルモノマー成分</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>均質化緩衝液 成分</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td>均質化緩衝液コンポーネント</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>均質化バッファー コンポーネント</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

11倍膨張顕微鏡によるユニバーサル分子保持

Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy

生体試料のナノスケールイメージングは、疾患の病因の理解を深めることができます。近年、膨張顕微鏡(ExM)は、光学超解像顕微鏡法に代わる効果的で低コストの代替手段であることが実証されています。しかし、ゲル内で異なる生体分子クラスを保持するための特異的でしばしばカスタムのアンカー剤の必要性、および特により大きな拡張因子または保存されたタンパク質エピトープが望まれる場合、ホルマリン固定パラフィン包埋組織などの標準的な臨床サンプルフォーマットを拡張することの難しさによって制限されてきました。ここでは、幅広い組織タイプで最大11倍の堅牢な拡張を実現する新しいExMメソッドであるMagnifyについて説明します。組織とゲルの間の化学アンカーとしてメタクロレインを使用することにより、Magnifyはタンパク質、脂質、核酸などの複数の生体分子をゲル内に保持し、従来の光学顕微鏡で組織の広範なナノスケールイメージングを可能にします。このプロトコルでは、堅牢で亀裂のない組織拡張を確保するためのベストプラクティスと、高度に拡張されたゲルの取り扱いとイメージングのヒントについて説明します。

プロトコルが正常に完了すると(図1)、サンプルは熱変性後に透明で平らに見えます。折り畳みやしわは、均質化が不完全であることを示しています。正常に拡張されたサンプルは、1x PBSで拡張する前よりも3〜4.5倍大きくなり、ddH2Oで完全に拡張すると8〜11倍大きくなります。 図 3 は、このプロトコルを使用して処理され、8倍以上に拡大することに成功した厚さ5μmのFFPEヒト腎臓サンプルの膨張前および膨張後の画像の例を示しています。最初に組織をDAPIとともにACTN4の抗体で染色し、核DNAを視覚化しました。次に、標本をスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して画像化しました(図3A)。組織は、同じ標的の拡大後染色を含む上記のプロトコルに従って処理され、再イメージングの前に水中で完全に拡張されました(図3B)。熱変性後、 図4</stro...

ここでは、最大11倍の拡張に変更された拡張顕微鏡(ExM)の新しいバージョンであるMagnifyは、生体分子クラスの包括的な配列を保存し、幅広い組織タイプと互換性があります。これにより、従来の回折限界顕微鏡を使用して生体分子のナノスケール構造を調べることができます。

The nanoscale imaging of biological specimens can improve the understanding of disease pathogenesis. In recent years, expansion microscopy (ExM) has been ...

私たちは、特に神経科学と臨床病理学の分野で、研究者が回折限界以下の解像度で生物学的標本を画像化するための簡単で低コストの方法を見つけようとしています。最近の膨張顕微鏡法の開発の多くは、ゲル化学を改変してサンプルをさらに拡大し、アンカー分子を変更してさまざまなターゲットを視覚化し、加熱変化を利用してタンパク質エピトープを保存することを含みます。革新的な拡大により、さまざまな生物学的または臨床標本のナノスケールイメージングを可能にする堅牢な膨張顕微鏡法。最大15ナノメートルの分解能で複雑な生物学的特徴を維持しながら、特殊な機器の必要性を排除することで超解像顕微鏡検査を簡素化し、世界中のラボでのアクセシビリティと有用性を向上させます。以前は、ユーザーは、イメージングしたい組織や生体分子に応じて、さまざまな膨張顕微鏡技術を試す必要がありました。Magnifyは、特定のアンカーステップや特殊な機器を必要とせずに、さまざまな生体分子や組織タイプにわたる高解像度イメージングを可能にし、ナノスケールイメージングの大きなギャップを埋めます。Magnifyは、タンパク質エピトープを維持しながら、より強靭な臨床サンプルを4倍以上に拡大し、キューイング疾患のより正確な調査を可能にします。また、そのケミカルアンカーは幅広い生体分子を保存し、動物モデルの基礎研究に役立ちます Magnifyは、複雑な光学系や特殊な機器なしで、生体分子や無傷の標本のナノスケールイメージングを簡素化します。さまざまなイメージングモダリティや拡張顕微鏡戦略に適応できるため、アクセス可能な費用対効果の高いナノスケールイメージングが可能になり、組織アトラスの生成を変革する可能性のある薬物治療や疾患研究を加速する可能性があります。拡大は研究に無限の可能性を提供します。現在の重点分野には、組織部位の拡大、ナノスケールでの病理学的ヒトサンプルの調査、学習および疾患中の脳の最小スケールの変化の研究が含まれます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

臨床組織サンプルのナノスケールイメージングは、疾患病因の理解を向上させることができる。拡張病理学(ExPath)は、標準的な臨床組織サンプルとの互換性のために改変された拡張顕微鏡(ExM)のバージョンであり、従来の回折制限顕微鏡を用いて生体分子のナノスケール構成を探索する。...

物理的および同方性拡張によるヒト組織切片のナノスコピックイメージング

この提示方法は、従来の顕微鏡で70nmの分解能を導く拡大顕微鏡による蛍光標識された細胞タンパク質の可視化を可能にする。...

拡張顕微鏡によるポドサイクタンパク質のイメージングニーフリン、アクチン、ポドシン

ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)のプロトコルが実証されています。LR-ExMは、以前に導入された膨張顕微鏡と比較して、より優れたラベリング効率を提供する新しい三官能アンカーのセットを使用しています。...

ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)は、超解像イメージングと高効率ラベリングを可能にします

ここでは、ショウ ジョウバエ...

拡大顕微鏡を用いたショウ ジョウバエ の胚全体拡大による超解像イメージング

この研究は、シャーガス病の原因となる病原体であるTrypanosoma cruziの3つのin...

Trypanosoma cruziの3つのIn Vitroライフサイクルステージにおける超微細構造拡大顕微鏡

ここでは、代謝オリゴ糖工学、クリックケミストリー、および増殖顕微鏡法を組み合わせたシンプルなプロトコールを提案し、日常的な顕微鏡装置を使用して細胞内シアル化...

Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

ここでは、クライオ固定と拡張顕微鏡法(Cryo-ExM)を組み合わせた詳細なプロトコルを紹介し、さまざまな生物学的サンプルに適応した構造保存と高解像度イメージングを可能にします。生物サンプルは凍結され、膨張性ポリマーに埋め込まれ、変性・拡張・免疫標識処理され、標準的な光学顕微鏡による超分解能イメージングが可能になります。...

拡張顕微鏡:従来型顕微鏡による高分解能蛍光イメージング

このビデオでは、我々は内部全反射蛍光（全反射）顕微鏡を使用して金魚網膜双極細胞における単一シナプス小胞のエキソサイトーシスと人身売買にラベルを付けたり、視覚化する方法を示しています。...

全反射顕微鏡による網膜双極細胞におけるイメージングのエキソサイトーシス

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。...

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。...

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

学ぶ拡張顕微鏡法Magnifyによるナノスケールイメージング手法。様々な生体試料や臨床組織を最大11倍に膨張させ、15ナノメートルの高解像度で複雑な生物学的構造を可視化します。特殊な機器を不要にし、神経科学や臨床病理学の研究を加速させます。

11倍膨張顕微鏡によるユニバーサル分子保持

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