2023年6月16日
このプロトコルでは、画像解析、一過性の過剰発現に関する考察、ウェスタンブロットを用いたATG9Aのグリコシル化状態の調査など、免疫蛍光法の検討など、ATG9A生物学の研究に役立つさまざまな方法について説明します。
私たちの研究室では、どの脂質とタンパク質機構がATG9A小胞の輸送に関与しているかを理解することに興味を持っています。ATG9Aは、ファゴフォアの形成と成熟のためのオートファジー経路において重要です。しかし、私たちは最近、細胞小器官の恒常性におけるATG9Aの影響を研究しています。
最大の課題は、タンパク質とタンパク質機構がどのように機能するかについて、分子の詳細を明らかにすることです。現在、AlphaFoldや高分解能in-situクライオ電子顕微鏡をベースとしたタンパク質エンジニアリングなどの技術が、最も進歩しています。私の研究室の研究は、オートファゴソームがどのように形成されるかについての基本的な洞察を確立しました。
これらの知見は、本稿で紹介したような高度な分子細胞生物学技術によって裏付けられています。特定のタンパク質タグを使用することのいくつかの欠点と、タグの局在化に応じてATG9Aの挙動がどのように変化するかを説明します。したがって、N末端またはC末端のいずれかです。
また、これらの欠点を検出する方法とそれらを回避する方法も提案します。これに加えて、ATG9Aの分散を再現性のある方法で定量するワークフローも提供します。ここでは、免疫蛍光法やライブイメージングから画像取得、異なる細胞区画間でのATG9の分散を解析するためのワークフローを提供します。
また、画像解析のパイプラインの標準化は、細胞生物学者が結果の信頼性と再現性を高めるための優先事項であると考えています。
本研究では、ATG9A小胞輸送のメカニズムと、それがオートファジーおよびオルガネラの恒常性に果たす役割について調査します。HEK293A細胞を用い、タンパク質タグがATG9Aの局在と挙動に与える影響を解明するため、さまざまな細胞イメージング技術を採用しました。
ATG9Aトラフィッキングの精密なイメージングと定量化は、オートファジー標的のバリデーションおよび初期創薬ポートフォリオにおけるメカニズム的なリスク軽減という重要な課題を解決します。膜タンパク質局在の標準化されたワークフローにより、オートファジー経路構成因子の再現性のある評価が可能となり、疾患関連システムにおける予測的な信頼性が向上します。これらの機能は、オートファジー調節を標的とするプログラムにおける、堅牢なgo/no-go判断の根拠となります。
このイメージングおよび定量化ワークフローは、ATG9Aの輸送解析を、オートファジー関連プログラムにおける初期探索、ターゲット検証、および前臨床研究の交差点に位置づけるものです。