Name: アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶMATLABを用いた生きた神経細胞ミトコンドリアの自動解析手法。機械学習アルゴリズムで画像セグメンテーションと定量化を行い、ミトコンドリア形態の網羅的解析と疾患メカニズムの理解を効率化する。

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画像取得は、PPBI(Portuguese Platform of BioImaging)のノードであるiBiMEDのLiM施設で行われました:POCI-01-0145-FEDER-022122。この研究は、FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276)、Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND) からの DT への助成金、ATG-The Gabba Alumni Association から VP への助成金、およびアヴェイロ大学生物医学研究所 (Institute for Biomedicine-iBiMED) の支援を受けました。

注:このプロトコルには、細胞培養とライブ共焦点顕微鏡検査で生きたミトコンドリア(図1)の画像を得るウェットラボステップと、得られた画像(図2)を分析するインシリコステップの2つの主要なステップがあります。3Dライブ画像化されたミトコンドリアの自動データ解析には、Lefebvreらが提供するMATLABアプリケーションMitometerを使用しました9。ルーチン最適化は MATLAB で記述されます。ソフトウェア、更新バージョン、および処理 ImageJ マクロは、https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB の GitHub からオンラインで無料で入手できます。
1. ライブ顕微鏡
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65452/65452fig01.jpg"> 図1:実験プロトコル。SH-SY5Y細胞を分化させ、レチノイドで処理した。 (A)TMRMを用いて、共焦点顕微鏡を用いて処理細胞内の健康なミトコンドリアをライブイメージングし、5視野のタイムラプスZスタックを撮影した。(B)マイトメーターアプリケーション MATLAB は、ミトコンドリア画像を自動的にセグメント化して解析します。このソフトウェアは、分析に加えて、核の近接性に応じてミトコンドリアを自動的に識別します。青い点はミトコンドリアの初期位置です。赤い点は最終位置です。スケールバー = 30 μm。略語:TMRM =テトラメチルローダミン、メチルエステル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65452/65452fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<ol><li>細胞培養<ol><li>SH-SY5Y細胞を5%CO2 および95%空気の加湿雰囲気中で37°Cでインキュベートし、MEM(Minimal Essential Medium)およびF12(Ham's F12 Nutrient Mix)培地を等量ずつ培養し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加します。</li>
		<li>SH-SY5Y細胞をガラス底の細胞皿に15×104 細胞/mLの密度で播種します。</li>
		<li>1% FBS含有培地中で10 μMの オールトランス レチノイン酸で5日間処理し、続いて10 ƞg/mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)で2日間処理して細胞を分化させます。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞処理<ol><li>細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、10-7 </li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65452/65452fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65452/65452fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><ol><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li></ol></li><li> <ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li><ol><li> </li><li><li> </li></ol></li></ol></li><li> <ol><li></li><li></li><li> </li><li></ol></li><li><ol><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li></ol></li></ol></li></ol>

神経科学におけるミトコンドリアネットワーク解析のためのMATLAB最適化

<ol><li>Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+energy%2C+and+metabolism+in+neuronal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease.</a> FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Clare, D. K., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-driven+molecular+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">ATP-driven molecular chaperone machines.</a> Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).</li>
<li>Tourniaire, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+induces+oxidative+phosphorylation+and+mitochondria+biogenesis+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes.</a> Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).</li>
<li>Psarra, A. M., Sekeris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptors+and+other+nuclear+transcription+factors+in+mitochondria%3A+regulatory+molecules+in+a+new+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+mitochondrial+dynamics+in+neurite+outgrowth+by+retinoic+acid+receptor+beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling.</a> FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).</li>
<li>Sajic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+conduction+increases+mitochondrial+transport+in+adult+mammalian+peripheral+nerves+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001754(2013).</li>
<li>Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+segmentation+and+tracking+of+mitochondria+in+live-cell+time-lapse+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images.</a> Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).</li>
<li>Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+of+the+mitochondrial+network+morphology+with+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research.</a> Frontiers in Physics. 10, 855775(2022).</li>
<li>Creed, S., McKenzie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+with+the+fluorescent+dye+tetramethylrhodamine+methyl+ester+%28TMRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM).</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).</li>
<li>Kovalevich, J., Langford, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+use+of+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).</li>
<li>Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+SH-SY5Y+cell+line+into+neuron-like+cells%3A+Investigation+of+electrophysiological+and+biomechanical+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes.</a> Neuroscience Letters. 745, 135628(2021).</li>
<li>Trigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+dysfunction+and+impaired+response+to+oxidative+stress+promotes+proteostasis+disruption+in+aged+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells.</a> Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).</li>
</ol>

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

生細胞イメージングでは、本格的なコンピューティング処理を必要とする大きなファイルが生成されますが、最新のツールでさえ、処理に大量の手動入力が必要です。このルーチン最適化は、マイトメーターでのミトコンドリア分析のプロセスを簡素化することに重点を置いていますが、これは、このツールがユーザー入力とデータ出力のバランスが非常に良いためです。ミトコンドリア画像解析のためのさまざまなツール間の包括的な比較は、以前にレビューされています10。他のパイプラインは、ミトコンドリアネットワークとクラスター質量の解析、または膜電位変動の解析に重点を置いていますが、ここで紹介するこの新しい方法論は、全細胞ミトコンドリアネットワークの迅速かつ検証済みの特性評価を可能にし、神経科学分野に適用するために不可欠な機能である軸索と細胞体ミトコンドリアの区別も可能にします。
MATLAB アプリケーションマイトメーター9 は、画像系列のミトコンドリアを解析します: 拡散背景は、系列のすべての時間枠と z 平面から減算され、...

細胞ミトコンドリアはあらゆる生理状態の中心に位置しており、がんやアルツハイマー病など幅広い疾患の薬理学的治療法を特定するためには、ミトコンドリアの恒常性(ミトスタシス)と挙動を完全に理解することが最も重要です1,2。
ミトコンドリアは、エネルギー恒常性、ATP生成、カルシウム緩衝、ROS調節において重要な細胞の役割を担っており、分子シャペロンはエネルギー依存性であるため、タンパク質の恒常性を維持するためには有糸分裂が不可欠です3。これらには、細胞のニーズを効率的に満たすために、一定かつ動的なネットワークの変調と適応が必要であり、ミトコンドリアの輸送はさまざまなシグナル伝達経路によって制御されています。以前の研究では、そのような経路の1つであるレチノイン酸受容体(RAR)4,5が説明されています。レチノイン酸(RA)は、RAR活性化を介して軸索および神経突起の成長を促進します。マウスの初代皮質ニューロンでは、RAR-βの活性化により、神経突起におけるミトコンドリアの成長、速度、および可動性が促進される6。
ミトコンドリアネットワークの適応性と動態を考慮すると、エネルギー恒常性を調べるだけでなく、プロテオスタシス、細胞の健康、増殖、シグナル伝達を調べるためにも、有糸分裂を「リアルタイム」で評価する可能性が不可欠です。有糸分裂を評価するために一般的に使用される方法は、蛍光色素またはマーカーを使用してミトコンドリアを強調した後の共焦点顕微鏡検査、および温度および/またはCO2調節を可能にする特定の顕微鏡検査セットアップに依存しています7。このタイプの実験セットアップでは、一度に1つの実験の複製を実行する必要があります。さまざまな処理の実験の繰り返しに加えて、ほとんどの実験では、一連の焦点面(zスタック)を一連の時点で記録して、技術的な複製(プレートごとに複数の位置を画像化)を行う必要があることを考慮する必要があります。したがって、1 つのコントロールと 2 つの処理を 3 回繰り返し、プレートごとに 5 つのイメージング位置、15 のタイムポイントを使用する実験計画では、225 スタックが処理されます。古典的には、生きたミトコンドリアのビデオは、キモグラフをプロットして分析され、個別に分析される8が、コンピュータツールに頼る場合でも、大量の手入力を必要とする時間のかかるプロセスであった。
最近、生細胞の2Dおよび3Dタイムラプスファイルにおけるミトコンドリアの自動セグメンテーションと追跡を可能にするアルゴリズムが 記述されました9。他の定量化手法も利用可能であり、すべてに限界があります10。自動化されたオープンソースアプリケーションであるMitometerは、タイムラプスやミトコンドリアダイナミクス分析に特に適しています。このアプリケーションには、他の既存のMATLABベースのツールに比べて、最大13の異なるパラメータを使用して個々のTIFスタックを自動処理できるという一連の利点があり、核周辺ミトコンドリアと遠隔核ミトコンドリアを区別するため、神経科学にとって特に興味深いものです。
ただし、上記のような実験では、これら 13 個のパラメーターを 225 個のスタックに適用すると、2,925 個の個別の出力ファイルが作成されます。これらには4つの個別のコンピューター入力が必要であり、すべての出力ファイルをダウンロードするには合計で10,000を超える手動入力が必要です。大規模な実験計画では、各ファイルの解析とデータ統合に不必要に非常に時間がかかります。ここでは、迅速なファイル分析を可能にし、ドキュメントの読み取りとデータ処理を大幅に削減し、既存のツールからの出力と一貫性のある定義された方法でデータを分析できるルーチン最適化を紹介します。

<table><tbody><tr><td>AM580</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A8843</td><td></td></tr><tr><td>BDNF&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>RP8642</td><td></td></tr><tr><td>BMS493</td><td>トクリス・バイオサイエンス&nbsp;</td><td>3409</td><td></td></tr><tr><td>CD2314</td><td>トクリス・バイオサイエンス</td><td>3824</td><td></td></tr><tr><td>Ch55</td><td>トクリス・バイオサイエンス&nbsp;</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v4.0</td><td>GraphPad Software, La Jolla</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12 Nutrient Mix</td><td>Thermo-Fisher</td><td>21765029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2022a&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential</td><td>Medium Thermo-Fisher</td><td>31095</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Glass Bottom Dishes</td><td>Thermo-Fisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer 生理食塩水</td><td>Thermo-Fisher</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;R2625</td><td></td></tr><tr><td>TMRM&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス LSM 510</td><td>カール ツァイス</td><td>n/a</td><td>生細胞イメージング培養チャンバーと 63x 油浸対物レンズを装備&nbsp;</td></tr></tbody></table>

アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors

ミトコンドリアネットワークが複雑なため、生細胞のセグメント化、追跡、解析が非常に困難です。MATLAB ツールを使用すると、タイムラプス ファイル内のミトコンドリアを解析できるため、画像処理のプロセスが大幅に簡素化され、高速化されます。それにもかかわらず、既存のツールは大量の出力を生成するため、個々の手作業による注意が必要であり、基本的な実験セットアップでは数千のファイルが出力され、それぞれが広範で時間のかかる処理を必要とします。 
これらの問題に対処するために、MATLAB コードとライブ スクリプト形式の両方でルーチン最適化が開発され、迅速なファイル解析が可能になり、ドキュメントの読み取りとデータ処理が大幅に削減されました。100ファイル/分の速度で、最適化により全体的に迅速な分析が可能になります。最適化では、個々のミトコンドリアのフレーム固有のデータを時間枠全体で平均化し、既存のツールからの出力と一致する定義された方法でデータを分析することにより、結果出力を達成します。色素テトラメチルローダミンメチルエステルを使用してライブ共焦点イメージングを行い、神経細胞をレチノイン酸受容体(RAR)アゴニストで処理することにより、ルーチンの最適化を検証しました。結果は文献と一致しており、アイソフォーム特異的RAR調節に応答するミトコンドリアネットワークの挙動をさらに特徴付けることができました。 
この新しい方法論により、ニューロン全体のミトコンドリアネットワークの迅速で検証済みの特性評価が可能になりましたが、神経科学分野に適用するために不可欠な機能である軸索と細胞体ミトコンドリアの分化も可能になりました。また、速効性治療を用いた実験にも適用でき、治療前後で同じ細胞のイメージングが可能で、神経科学の分野を超越しています。

.txtフォーマットの出力ファイルの分析を強化および高速化するために、マイトメータ.txt出力ファイルと一致するデータを読み取るルーチン最適化がコード化され、列はフレームを表し、線は識別されたミトコンドリアを表します。ルーチン最適化では、識別された各ミトコンドリアのフレームを平均化し、視野ごとにすべてのミトコンドリアの結果を平均化することにより、パラメーターごとに単一の値でデータを生成します。開発されたルーチンは、1 から番号が付けられたフォルダーからファイルを読み取ります。ライブ スクリプト ルーチンの最適化は、1 つのスプレッドシート ファイルを表形式で出力します。この出力では、列は分析されたパラメータを表します(例:「 長軸の長さ」;"Intensity")と線は分析変数の視野を表します(例 :「コントロール」)。
以前に発表された結果では、RARβ 活性化後に初代ニューロン培養の細胞体内のミトコンドリア膜電位が低下し、軸索ミトコンドリアの動きが増加することが説明されています6</s...

ミトコンドリアネットワークは非常に複雑で、解析が非常に困難です。新しいMATLABツールは、タイムラプス画像でライブ共焦点画像化されたミトコンドリアを解析しますが、出力量が大きく、個別の手動操作が必要です。この問題に対処するために、ルーチン最適化が開発され、迅速なファイル分析が可能になりました。

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in ...

私の研究は神経科学の分野に焦点をあてており、特に疾患の分子基盤を理解したいと考えています。これにより、細胞、その構造、およびさまざまな細胞機能を果たす細胞小器官に注目するようになりました。ますます、ミトコンドリア、それらはますます注目を集めています。ミトコンドリアレベルでの異常は、疾患プロセスを理解する上で絶対的な基礎となりつつあり、新薬や治療戦略の興味深い標的となる可能性さえあります。ここアヴェイロ大学では、ミトコンドリアを研究するための興味深いツールを開発することができました。顕微鏡法や従来のアプローチだけでなく、自動分析ツールとバイオインフォマティクス戦略を組み合わせて最適化し、ミトコンドリア機能を扱う際に定量化してより詳細な分析を提供できるようにしました。最近の進歩には、画像のセグメンテーションとミトコンドリアパラメータの定量化のための機械学習アルゴリズムが含まれます。また、ミトコンドリアの特性評価の精度と効率を向上させるためのハイスループットイメージングプラットフォームとディープラーニングアルゴリズムも備えています。現在、ミトコンドリア解析の分野を進歩させるために使用されている技術には、高解像度顕微鏡、ライブイメージングシステム、機械学習プロトコルと組み合わせた計算解析ツール、ミトコンドリアの形態および生物学解析のためのCRISPR-Cas9ゲノム編集などがあります。ミトコンドリアの分野における現在の実験上の課題には、ミトコンドリアパラメータの信頼性が高く正確な測定の開発、ミトコンドリア集団の不均一性の考慮、ミトコンドリアと細胞生物学の相互作用の分析、およびミトコンドリアをin vivoで研究するための非侵襲的ツールの開発が含まれます。当社のツールは効率と信頼性を高め、ミトコンドリアの堅牢な自動分析を可能にします。さらに、ミトコンドリアの個別化医療におけるヒアルロン酸受容体調節の可能性を探ることができます。

optimized-automated-analysis-live-neuronal-mitochondria-homeostasis

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神経科学

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出典: Katsalifis, A., et al.レシオメトリック指標を用いた初代ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオン酸化還元状態のライブイメージングJ. Vis.

レシオメトリックインジケーターを使用した初代ニューロンのミトコンドリア酸化還元状態のイメージング

ここで説明する、商業バイオアナライザを用いた ex vivo...

Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

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本稿では、共焦点ライブ顕微鏡を用いた一次海馬および皮質ニューロンにおける急性摂動に対する基底レドックス状態と酸化還元反応の違いを判断するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、他の細胞タイプや顕微鏡に最小限の変更で適用できます。...

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アルツハイマー病(AD)の神経モデルにおけるミトコンドリア関連小胞体膜(MAM)安定化の定量的解析 

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高分化型および分極した網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング

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ジトニン透過化されたBE(2)-C神経芽細胞における酸化リン酸化結合のコリン作動位子依存性調節

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複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

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