Name: スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶ ポリエチレングリコールハイドロゲルによる腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化手法。低コストで専門機器不要のプロトコルにより、スフェロイドとマトリックスの相互作用を解析し、生理学的に妥当なin vitro腫瘍モデルを構築する方法を解説します。

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この研究は、セントルイス大学からSilviya P Zustiak博士に提供されたスタートアップ資金と、セントルイス大学のHenry and Amelia Nasrallah Center for NeuroscienceからSilviya P Zustiak博士に授与されたシード助成金によって資金提供されました。

PEGハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とそれに続く3Dカプセル化

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著者は何も開示していません。

ハイドロゲルベースの多細胞腫瘍スフェロイドモデルは、がん治療の発見を前進させるためにますます開発されています11,13,29。これらは、制御された方法で腫瘍微小環境の主要なパラメータをエミュレートし、その複雑さにもかかわらず、in vivoモデルよりもシンプルで安価に使用でき、多くがハイスループットスクリーニング技術と互換性があるため、有益です。ハイドロゲル生体材料は、腫瘍の細胞外マトリックスをエミュレートし、細胞-マトリックス相互作用を促進するように調整することができ、スフェロイド(解離細胞とは対照的に)は天然腫瘍の細胞間相互作用をエミュレートします。合成ヒドロゲルは、ここで実証されているように、ヒドロゲルが所望の構造支持体および物理的および機械的特性を提供するのに対し、接着性リガンドまたは分解性配列を使用して生化学的材料特性を独立して調整できるため、特に有利です。また、合成ハイドロゲルは、バッチ間のばらつきが小さく、材料特性の範囲が広く、体内のほと...

腫瘍スフェロイドは、がんの病因、病理学、および薬物反応性を研究する上で有用なin vitroツールとして浮上しています1。従来、スフェロイドは、細胞表面の接着よりも細胞間の接着が好まれる低接着プレートやバイオリアクターなどの条件で培養されてきました2。しかし、腫瘍の微小環境をより忠実に再現するために、in vitroスフェロイドモデルは細胞間相互作用と細胞マトリックス相互作用の両方を捉える必要があることが現在認識されています。このため、複数のグループが、スフェロイドをカプセル化できるハイドロゲルなどの足場を設計するようになりました3,4。このようなハイドロゲルベースのスフェロイドモデルは、生存率、増殖、幹細胞性、治療反応性など、さまざまな細胞挙動における細胞間および細胞マトリックス相互作用の解明を可能にします3。
ここでは、ポリエチレングリコール(PEG)ヒドロゲルに神経膠芽腫スフェロイドをカプセル化するためのプロトコルについて説明します。ヒドロゲルへの膠芽腫細胞スフェロイドのカプセル化に関する複数の文献報告があります。例えば、スフェロイドは、U87細胞をRGDS接着性リガンドで装飾したPEGハイドロゲルに封入し、酵素的に切断可能なペプチドで架橋して形成し、ハイドロゲルの硬さが細胞挙動に及ぼす影響を決定しました5。U87細胞は、がん幹細胞集団を拡大したり6、化学療法耐性のマトリックスを介したメカニズムを探求したりするために、他のPEGベースまたはヒアルロン酸ベースのハイドロゲルでも形成されています7,8,9。神経膠芽腫スフェロイドは、ミクログリア細胞とがん細胞の間のクロストークおよび細胞浸潤に対するその影響を研究するために、ゼラチンハイドロゲルにもカプセル化されている10。全体として、このような研究は、膠芽腫の病理学を理解し、治療法を考案する上でのハイドロゲルベースのin vitroモデルの有用性を実証しています。
さらに、腫瘍スフェロイドの作製およびヒドロゲルカプセル化には異なる方法がある11。例えば、分散した細胞をハイドロゲルに播種し、時間をかけてスフェロイドを形成することができる5,12。このような方法の欠点の1つは、形成されたスフェロイドの多分散性であり、細胞応答の違いにつながる可能性があります。均一なスフェロイドを産生するために、細胞をマイクロゲルに封入し、それらがゲルに侵入してリモデリングするまで長期間培養するか13、または細胞を球状の「穴」を有する鋳型ゲルに堆積させ、凝集させることができる14。これらの方法の欠点は、相対的に複雑であること、マイクロゲルまたはゲル内の「穴」を形成するために液滴発生器またはその他の手段が必要であること、およびスフェロイドが成長して成熟するのにかかる時間です。あるいは、スフェロイドは、マイクロウェル9,15,16または吊り下げ式プレート17,18で予め形成され、次いで、ここに記載される技術と同様に、ハイドロゲルにカプセル化されてもよい。これらの方法はより単純で、より高いスループットで実行できます。興味深いことに、スフェロイド形成の方法は、遺伝子発現、細胞増殖、薬物応答性などのスフェロイド細胞の挙動に影響を与える可能性があることが示されています19,20。
ここでは、膠芽腫が固形腫瘍であり、その本来の環境は柔らかいナノ多孔質の脳マトリックス21であり、柔らかいナノ多孔質のハイドロゲルによって模倣することができるため、神経膠芽腫に焦点を当てる。神経膠芽腫は、利用可能な治療法がない最も致命的な脳腫瘍でもあります22。しかし、ここで説明するプロトコルは、あらゆる固形腫瘍を表すスフェロイドのカプセル化に用いることができる。我々は、マイケル型付加反応によって形成されるPEGハイドロゲルを使用することを選択しました23。PEGは、合成された、非分解性で、生体適合性のヒドロゲルであり、不活性であり、足場および物理的な細胞支持体として機能するが、細胞接着は支持しない23。細胞の接着性は、全タンパク質または接着性リガンドのテザリングを介して別個に付加することができ24、分解性は、PEGポリマー鎖の化学修飾または加水分解的または酵素的に分解可能な架橋剤25,26を介して付加することができる。これにより、生化学的特性を機械的または物理的なハイドロゲル特性とは無関係に調整することができ、細胞とマトリックスの相互作用を研究する上で有利になる可能性があります。マイケル型ゲル化化学は選択的であり、生理学的条件で起こります。したがって、スフェロイドをハイドロゲル前駆体溶液と混合するだけで、スフェロイドのカプセル化が可能になります。
全体として、ここで紹介する方法論にはいくつかの注目すべき特徴があります。まず、マルチウェルアセンブリでの腫瘍スフェロイドの作製は効率的で迅速であり、必要な材料のコストは低く抑えられます。第二に、回転楕円体は、多分散性の低いさまざまなサイズで大量に製造されます。最後に、市販の材料のみが必要です。この方法論の有用性は、スフェロイド細胞の生存率、真円度、および細胞幹細胞性に対する基質特性の影響を調べることによって示されています。

<table><tbody><tr><td>70%エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカル</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Plate Ultra Low Attachment plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri Dish</td><td>Amazon</td><td>706011</td><td></td></tr><tr><td>4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conicals</td><td>Fisher Scinetific</td><td></td><td></td>3181345107</tr><tr><td>6ウェルAggreWell 400&nbsp;</td><td>StemCell Technologies、バンクーバー、カナダ</td><td>34421</td><td>正方形のピラミッド型マイクロウェル&nbsp;</td></tr><tr><td>抗付着リンス液</td><td>StemCell Technologies、バンクーバー、カナダ</td><td>猫 #: 07010</td><td></td></tr><tr><td>アスパラギン酸-アルギニン-システイン-グリシン-バリン-プロリン-メチオニン-セリン-メチオニン-アルギニン-グリシン-システイン-アルギニン-アスパラギン酸 (DRCG-VPMSMR-GCRD) ペプチド</td><td>ジェニックバイオ、上海、中国</td><td>n/a</td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>ケミカルヒュームフード</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基底膜マトリックス、LDEV Free&nbsp;</td><td>コーニング356234</td><td></td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>洗剤 - Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルピペット (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37% 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>ガラスプレート</td><td>スランピーズ</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>ガラストランスファーピペット</td><td>Fisher Scinetific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>グリシン-アルギニン-システイン-アスパラギン酸-アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン (GRCD-RGDS) ペプチド</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>疎水性溶液 - シランをはじく&nbsp;</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-ジヘキサデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>ライカコンフォーカル SP8</td><td>ライカマイクロシステムズ(株)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光蛍光顕微鏡 (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 mL: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-23927</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルム&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ(1&ndash;200 &micro;L、101&ndash;1000 &マイクロ;L)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック標準使い捨てトランスファーピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック計量ボート (100 mL)</td><td>Amazon&nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)-ジチオール (PEG-diSH; 3.4 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメヒルシロキサン (PDMS) [Slygard 182 エラストマーキット]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td>ポリジメチルシロキサン</td></tr><tr><td>パウダーフリー検査用手袋</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム、1 mg/mL 水性ゾルン。</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ66584AB</tr><tr><td>RPMI-1640 ミディアム (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>シリコンスペーサー - シリコンシート、厚さ0.5 mm/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-365823</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フード</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン、&ge;99.0% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG ヒト膠芽腫細胞</td><td>American Type Culture Collection&nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

スフェロイドの3次元(3D)カプセル化は、最適な細胞増殖のために腫瘍微小環境を適切に再現するために重要です。 ここでは、腫瘍の細胞外微小環境を模倣するために、スフェロイドカプセル化用の in vitro 3D神経膠芽腫モデルを設計しました。 まず、ポリジメチルシロキサンを用いて四角錐型のマイクロウェルモールドを作製した。次に、これらのマイクロウェルモールドを使用して、50〜500μmのサイズを厳密に制御した腫瘍スフェロイドを製造しました。 スフェロイドが形成されると、スフェロイドを回収し、ポリエチレングリコール(PEG)ベースのハイドロゲルにカプセル化しました。PEGハイドロゲルは、硬さ、分解性、細胞接着性などのハイドロゲル特性を独立して調整できるため、スフェロイドカプセル化のための汎用性の高いプラットフォームです。 ここでは、代表的な軟質(~8 kPa)ハイドロゲルを使用して、膠芽腫スフェロイドをカプセル化しました。 最後に、共焦点顕微鏡で高品質の画像を得るために、スフェロイドを染色して画像化する方法が開発されました。 スフェロイドコアが緻密で周辺が比較的まばらなため、イメージングが困難な場合がありますが、透明化溶液と共焦点光学セクショニングを使用することで、これらのイメージングの困難さを軽減することができます。 要約すると、均一なスフェロイドを作製し、それらをPEGハイドロゲルにカプセル化し、カプセル化されたスフェロイドに対して共焦点顕微鏡法を実行して、スフェロイドの成長とさまざまな細胞とマトリックスの相互作用を研究する方法を示します。

化学療法効果を研究するためのスフェロイドベースの薬物スクリーニングプラットフォームは、天然組織を複製する生体材料にスフェロイドをカプセル化する際に腫瘍微小環境を調節することに重点が置かれているため、ますます求められています。ここでは、多細胞腫瘍スフェロイドの調製と、その後の3Dハイドロゲルへのカプセル化とイメージングの方法を開発しました。スフェロイドはマイクロウェルモールド(図3A、B)で調製され、球形と厳密に制御された多分散性を持つスフェロイドが得られます。例えば、マイクロウェルあたり 3,300 個の細胞を持つスフェロイドの場合、平均スフェロイドサイズは ~250 μm で、真円度は &gt;0.8 で、1 は完全な球体です(図 3C、D)。回転楕円体直径の分散係数(%CV)は 19.3%、真円度の %CV は 4.5% でした。スフェロイドの直径は、 表 1 に示すように、マイクロウェルあたりの細胞数に依存してい...

ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

私たちの研究室では、腫瘍の細胞外微小環境を模倣するために、神経膠芽腫ステロイドカプセル化のためのin vitroハイドロゲルモデルの設計に焦点を当てています。ステロイド細胞の生存率、循環性、幹細胞性、および拡散に対する有効な基質、機械的および生化学的特性は、そのようなモデルで調査されます。腫瘍モジュール開発における現在の実験上の課題は、生理学的関連性のために腫瘍微小環境のあらゆる側面を模倣するための複雑さへの欲求と、モデルにアクセスしやすく、堅牢で、低コストで、使いやすく、マルチプレックススクリーニングアプローチと互換性を持たせるための単純さへの欲求を中心に展開しています。本稿では、腫瘍ステロイドの迅速、堅牢、低コストの作製と、腫瘍微小環境を模倣したハイドロゲルへのカプセル化を可能にするプロトコルを提示する。このモデルは特別な機器を必要としません。これは、in vitro組織生理学または病理学モデルの構築におけるステロイドマトリックス相互作用の探索に特に有用です。神経膠芽腫がん細胞とその微小環境との相互作用を理解することで、このがんをより適切に治療するための新しい治療法の開発を促進することができます。さらに、膠芽腫がんのin vitroモデルの開発は、他のがん疾患に対するこのモデルの開発を強化することができます。

tumor-spheroid-fabrication-encapsulation-polyethylene-glycol

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典:Guyon, J., et al.膠芽腫の3Dスフェロイドモデル. J. Vis. Exp.

腫瘍細胞浸潤の3次元スフェロイドモデルの生成

粒子追跡マイクロレオロジーは、3D腫瘍モデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の変化を非破壊的に定量化し、空間的にマッピングするために使用できます。...

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

ここでは、細胞凝集を通じて3D細胞スフェロイドを形成するための迅速で柔軟なプロトコルについて説明します。これは、複数の細胞タイプに容易に適応でき、細胞遊走、浸潤、アノイキスアッセイなどのさまざまなアプリケーションでの使用や、細胞-マトリックス相互作用のイメージングと定量化に適しています。...

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro...

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。...

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

関連するヒト疾患を忠実に再現する包括的な インビトロ モデルが欠けている。現在の研究は、ヒト肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を研究するための信頼性の高い インビトロ...

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

本研究では、スフェロイドおよびオルガノイド全体を多目的デバイス内のヒドロゲルにそのまま残したまま、さまざまな顕微鏡で培養、凍結、解凍、処理、染色、標識、および検査するための方法論について説明します。...

ヒドロゲル中でのオルガノイドおよびスフェロイド全体の培養、凍結、加工、イメージング

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。...

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

がんの転移を研究するためには、ヘテロセルのクロストークを捉える3Dがんモデルが急務となっています。私たちの研究は、侵入と細胞空間分布の研究に使用できる足場および足場のない環境でのヘテロ多細胞間質-上皮の生成を示しています。...

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

学ぶ ポリエチレングリコールハイドロゲルによる腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化手法。低コストで専門機器不要のプロトコルにより、スフェロイドとマトリックスの相互作用を解析し、生理学的に妥当なin vitro腫瘍モデルを構築する方法を解説します。

スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

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