Name: ヒト新生児腸管内腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込んだ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル。ヒト新生児由来腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込み、NEC発症メカニズムの解明と新規治療戦略の探索に貢献します。

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この原稿は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校への寄付者の寛大な支援を通じて、米国国立衛生研究所のR01DK118568(MG)、R01DK124614(MG)、およびR01HD105301(MG)、Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749(MG)、Thrasher Research Fund Early Career Award(LCF)、UNC Children's Development Early Career Investigator Grant(LCF)の支援を受けました。 ノースカロライナ大学チャペルヒル校の小児科。

機構研究と創薬のための壊死性腸炎モデル

<ol><li>Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+incidence+of+Necrotizing+Enterocolitis%3A+a+systematic+review+and+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis.</a> BMC Pediatrics. 20 (1), 344(2020).</li>
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<li>Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Necrotizing+Enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis.</a> Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).</li>
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<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+expressed+on+intestinal+stem+cells+and+regulates+their+proliferation+and+apoptosis+via+the+p53+up-regulated+modulator+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).</li>
<li>Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+animal+models+for+the+study+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis.</a> Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).</li>
<li>Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+and+necessity+of+using+animal+models+in+the+study+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+pediatric+surgery%22%5BJournal%5D)">The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).</li>
<li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+necrotizing+enterocolitis%3A+pathophysiology%2C+translational+relevance%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).</li>
<li>Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+induction+of+experimental+necrotizing+enterocolitis+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocol%22%5BJournal%5D)">A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice.</a> STAR Protocol. 2 (4), 100951(2021).</li>
<li>Egan, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4-mediated+lymphocyte+influx+induces+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).</li>
<li>Stanford, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+comparison+of+mouse+and+human+intestinal+development+using+epithelial+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns.</a> Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).</li>
<li>Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Collaborative+Cross%3A+A+Systems+Genetics+Resource+for+Studying+Host-Pathogen+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions.</a> Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).</li>
<li>Ericsson, A. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome+of+laboratory+mice%3A+considerations+and+best+practices+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research.</a> Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).</li>
<li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+Enterocolitis%3A+Overview+on+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2871(2018).</li>
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<li>Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+a+pharmacokinetic-pharmacodynamic+%28PK-PD%29+model+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip.</a> Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).</li>
<li>Sung, J. H., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro+cell+culture+analog+%28microCCA%29+with+3-D+hydrogel+culture+of+multiple+cell+lines+to+assess+metabolism-dependent+cytotoxicity+of+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs.</a> Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Jang, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducing+human+and+cross-species+drug+toxicities+using+a+Liver-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip.</a> Science translational medicine. 11 (517), eaax5516(2019).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature biomedical engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Chou, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+recapitulation+of+clinical+bone+marrow+toxicities+and+patient-specific+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology.</a> Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+radiation+injury-induced+cell+death+and+countermeasure+drug+responses+in+a+human+Gut-on-a-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip.</a> Cell Death & Disease. 9 (2), 223(2018).</li>
<li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+3D+neuromuscular+model+for+drug+screening+and+precision+medicine+in+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease.</a> Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Migration+Chip+for+Chemotaxis-based+Microfluidic+Selection+of+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations.</a> Scientific Reports. 5, 9980(2015).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-chip%3A+Recreating+human+intestine+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro.</a> Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318(2020).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+facilitates+in+vitro+modeling+of+human+neonatal+necrotizing+enterocolitis-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip.</a> JCI Insight. 8 (8), e146496(2023).</li>
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<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+rhamnosus+HN001+decreases+the+severity+of+necrotizing+enterocolitis+in+neonatal+mice+and+preterm+piglets%3A+evidence+in+mice+for+a+role+of+TLR9+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 .</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> JoVE. , (2023).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
</ol>

著者は、この原稿に関連する利益相反がないことを宣言します。

このNEC-on-a-chipシステムは、NECの病態生理学をモデル化するために使用できる強力な新しいツールです。このプラットフォームは、連続的な管腔の流れとストレッチを備えた共培養システムを組み込むことにより、以前のモデルよりも in vivo 腸環境によく似た複雑な微小環境を提供します。これらの条件は、成熟した上皮サブタイプとタイトジャンクションからなる高度に分極された上皮によって裏打ちされた3D絨毛様構造の発達を促進します(図2)36。さらに、頂端上皮表面は、患者由来の微生物叢や新しい治療法などの実験刺激への曝露のために簡単にアクセスできます。最後に、このモデルは、関連する患者集団に由来するエンテロイドを利用して、さまざまな炎症性および非炎症性の腸疾患、および正常な腸上皮発生のメカニズムを研究するためにも使用できます。このモデルでは、新生児の腸サンプルの入手可能性とサイズが限られていることを考えると、単一の患者サンプルからのデータ取得を最大化することができます。
<p class="jove_con...

壊死性腸炎(NEC)は早産児に影響を及ぼし、体重が1500g<生まれた乳児の発生率は最大10%です1。NECの病態生理は複雑で、腸管上皮の損傷、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、免疫調節不全、上皮細胞死などが含まれます2,3。NECの発症機序の解明は未だに不完全であり、何十年にもわたる研究にもかかわらず、有効な標的療法は未だに存在しません。
NECの研究を進める上での大きな障壁は、ヒトの乳児から分離された一次腸組織が限られていることとサイズが小さいことです。NECの乳児から切除された腸組織は、しばしば壊死し、重度の損傷を受けるため、疾患発症に先行するメカニズムの研究は複雑です。例えば、NECの乳児の小腸には免疫細胞が氾濫し、腸管幹細胞の減少、上皮細胞の増殖の減少、上皮細胞のアポトーシスの増加も観察されます4,5,6,7。これにより、これらのサンプルから腸管上皮細胞を培養したり、この敵対的な炎症環境で分解される可能性のあるRNAやタンパク質を単離することが困難になります。さらに、外科的NECの乳児ではすでに疾患プロセスが進行しているため、疾患を誘発する要因のメカニズム研究は実行不可能です。これらの制限により、NECのメカニズム研究は動物モデルに依存しています。
NECの動物モデルは、マウス、ラット、子豚、ウサギ、ヒヒについて確立されています5,8,9,11。動物モデルの強みは、細菌叢様マイクロバイオーム、低酸素症の繰り返し、母乳育児の欠如など、ヒトのNEC発症に関連する要因によってNEC様腸疾患が誘発されることである5,8,10,11。さらに、実験中に観察された炎症反応と病理学的変化NECパラレルヒト疾患5,9,12。これらのモデルはヒトNECの特徴の多くを模倣しているが、動物とヒトにおけるNECの病態生理には本質的な違いがある。例えば、正期産のマウスモデルNECは、正期産のマウスに誘導され、腸管の発達は不完全であるが、NECの病態生理は、この臨床の文脈では本質的に異なっている。出生時のマウスの腸内遺伝子発現は、生存前のヒト胎児に類似しており、妊娠22〜24週の早産児の14日目まで近似しない(P14)13。これは、P10以降のマウスでは腸の損傷を一般的に誘発できないため、マウスNECモデルを混乱させます。さらに、近交系マウスはヒト新生児の免疫学的多様性14と微生物学的多様性を欠いており15、これも交絡因子として機能している。したがって、NECの研究への一次ヒトサンプルの組み込みを増やすことで、この分野の研究の臨床的関連性が向上します。
NECのin vitroでのメカニズムの研究は、従来、大腸腺癌(Caco2)細胞やヒト結腸腺癌(HT-29)細胞などの成人腸癌細胞に由来する単型細胞株を利用してきました16。これらのモデルは簡便であるが、成体がん細胞からの増殖、非分極構造、および培養の反復継代に関連する表現型の変化により、生理学的関連性が限られている。腸管内エンテロイドは、腸組織の陰窩から成長し、すべての腸上皮サブタイプに分化し、3次元(3D)の絨毛様構造を形成することができるため、これらのモデルを改良します17,18,19,20。最近、腸管内エンテロイドは、小腸オンチップモデルを開発し、より生理学的に関連性のあるin vitroモデルシステムを提供するために、マイクロ流体技術と組み合わされている21。
最初の臓器チップマイクロ流体デバイスは、2000年代初頭に導入されました22,23,24。最初の臓器チップモデルは、ヒトの呼吸肺チップ25であった。これに続いて、腸21、肝臓26、腎臓27、骨髄28、血液脳関門29、心臓30など、多数の単一臓器モデルが続いた。これらのOrgan-on-a-chipモデルは、急性放射線症候群31、慢性閉塞性肺疾患32、神経変性疾患33などの急性疾患、慢性疾患、希少疾患の研究に用いられている。これらのチップ上の細胞の分極された性質と、多孔質膜で隔てられた2つの細胞区画の存在により、灌流、化学濃度勾配、免疫細胞走化性などの複雑な生理学的プロセスのモデリングが可能になります34,35。したがって、これらのマイクロ流体システムは、ヒト疾患の病態生理学とメカニズムを研究するための新しいツールを提供します。
小腸オンチップモデルは、2018年にKaserdraらによって記述され、小児(10〜14歳)の小腸生検標本をエンテロイドに分化させ、マイクロ流体デバイスで培養しました21。血管内皮細胞、連続培地の流れ、および伸張/弛緩もこのモデルに組み込まれました。彼らは、腸上皮サブタイプの分化、3D絨毛様軸の形成、粘液産生、および小腸の遺伝子発現パターンを観察しました21。このマイクロ流体モデルは、新生児の腸管エンテロイド、内皮細胞、およびNEC36を持つ新生児のマイクロバイオームを組み込んだNEC-on-a-chipシステムの開発により、新生児疾患に適用されました。NEC-on-a-chipは、炎症性遺伝子発現、特殊な上皮細胞の喪失、腸管バリア機能の低下など、ヒトNECの重要な特徴の多くを再現している36。このように、このモデルは、機構研究や創薬など、NECの研究において多くの応用が期待されています。この原稿では、NEC-on-a-chipモデルの性能に関する詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Basic Bio-kit</td><td>Emulate</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy 2 マルチモード マイクロプレート リーダー</td><td>Agilent</td><td>&nbsp;7131000</td><td></td></tr><tr><td>ブランドメタクリレート (PMMA) キュベット、セミマイクロ</td><td>BrandTech</td><td>759085D</td><td></td></tr><tr><td>細胞回収ソリューション</td><td>コーニング</td><td>354270</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus リアルタイム PCR システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>チップ クレードル</td><td>エミュレート</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>チップ-S1 ストレッチャブル チップ</td><td>エミュレート</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Clear TC処理マルチプルウェルプレート、&nbsp; 48ウェル&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン ヒト胎盤由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、I型、粉末</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit&nbsp;</td><td>Cell Biologics</td><td>H-1168</td><td></td></tr><tr><td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 全自動セルカウンター</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, アニオン性, リジン固定性</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;D7132</td><td>透過性染料&nbsp;</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てPESフィルターユニット、0.2um aPES膜</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FB12566504</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>ギブコ</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;sミディアム - 高グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 m,&nbsp; pH 8.0</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>ER-1 表面活性化試薬</td><td>エミュレート</td><td>ER-1</td><td>チップ活性化試薬 1</td></tr><tr><td>ER-2 表面活性化試薬&nbsp;</td><td>ER-2</td><td>チップ活性化試薬2</td>フィ<td></td></tr><tr><td>ブロネクチンヒトタンパク質、血漿</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrandをエミュレート&nbsp;透明な蓋付きペトリ皿、100mm</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンベースのコーティング溶液&nbsp;</td><td>Cell Biologics</td><td>6950</td><td></td></tr><tr><td>Genie Temp-Shaker 300</td><td>Scientific Industries, Inc.</td> (英語)<td>SI-G300</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、液体1M溶液(238.3 mg / mL)</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ヒトコラーゲンI型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CC050</td><td></td></tr><tr><td>ヒト初代小腸微小血管内皮細胞</td><td>細胞生物学的製剤</td><td>H-6054</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-013</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ルリアブロス (LB) 寒天、Miller</td><td>Supelco</td><td>L3027</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN 細胞&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子還元基底膜マトリックス、LDEVフリー&nbsp;</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Cell Culture Matrix</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1009005</td><td></td></tr><tr><td>NAILSTAR UV LAMP</td><td>NailStar</td><td>NS-01-US</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC&nbsp;微量UV-Vis分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-274200</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>Orb-HM1 ハブモジュール</td><td>エミュレート</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ThermoFisher</td><td>047392.9L</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite マルチピペット L8-200XLS+</td><td>レイニン</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ TR LTS 1000&micro;L S 768A/8</td><td>レイニン</td><td>17014966</td><td></td></tr><tr><td>ポッド ポータブル モジュール</td><td>エミュレート</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>プレミアム グレード ウシ胎児血清 (FBS)(熱不活性化)&nbsp;</td><td>Avantor Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect 逆転写キット&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス上皮成長因子 (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR&nbsp;グリーン スーパーミックス</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GV 滅菌遠心分離チューブトップフィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞ストレーナー、70um</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ、10mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-955-453</td><td></td></tr><tr><td>ストレート、ファイン、シャープポイントはさみ</td><td>ミルテックス&nbsp;機器</td><td>MH5-300</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75016052</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp;X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>TRIzol 試薬&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>RNA 抽出試薬</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution、0.4% (w/v) in PBS、pH 7.5 &plusmn; 0.5</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッドなし&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>酵素解離試薬</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>VIOS 160i CO2 インキュベーター、165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-998-252</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zo&euml;-CM1 培養モジュール</td><td>エミュレート</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト新生児腸管内腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込んだ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル

Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome

壊死性腸炎(NEC)は、重篤で致命的な可能性のある腸疾患であり、その複雑な病因のために研究が困難であり、完全には理解されていません。NECの病態生理には、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、上皮細胞死、微生物嚥下障害、および調節不全炎症が含まれます。NECを研究するための従来のツールには、動物モデル、細胞株、ヒトまたはマウスの腸管オルガノイドが含まれます。これらのモデルシステムを用いた研究は、疾患の病態生理学に関するこの分野の理解を深めてきましたが、ヒトNECの複雑さを再現する能力は限られています。現在、マイクロ流体技術を用いたNECの改良型in vitro モデル「NEC-on-a-chip」が開発されています。NEC-on-a-chipモデルは、早産児由来の腸管エンテロイドを播種し、ヒト内皮細胞と重症NEC乳児のマイクロバイオームを共培養したマイクロ流体デバイスで構成されています。このモデルは、NECの病態生理機構を研究するための貴重なツールであり、新生児腸疾患の創薬試験のための新しいリソースです。本稿では、NEC-on-a-chipモデルについて詳細に説明する。

エンテロイドをマイクロ流体デバイス(図1)に播種し、上記のように培養した。播種前の細胞培養マトリックスハイドロゲルにおけるエンテロイドの増殖、およびその後の播種後の腸上皮細胞単層の拡張を明視野顕微鏡でモニターしました(図2)。合流した腸管上皮細胞単層が形成され、その後、成熟した3D絨毛様構造に発達しました(図2)。エンテロイド由来の新生児腸上皮とHIMECを播種したこのマイクロ流体デバイスは、新生児腸チップモデル36として知られています。
NEC-on-a-chipモデルは、新生児NEC中に存在する微生物嚥下障害を再現するために開発されました。このモデルには、重度のNECの新生児由来の細菌叢異常微生物叢を新生児腸チップモデルに追加することが含まれます。この細菌叢異常微生物叢を追加することで、腫瘍壊死因子α(TNFα;<strong clas...

このプロトコルは病気の病因に機構の調査に使用することができる壊死性腸炎(NEC)の 生体外の モデルを記述する。ヒト新生児の腸、内皮細胞、および重度のNECの新生児の腸内細菌叢に由来する腸内エンテロイドをシードしたマイクロ流体チップを特徴としています。

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, ...

壊死性腸炎の病態生理は複雑であり、この複雑さは一般的に使用される多くのin vitroモデルに反映されていないため、この分野の研究は困難です。ヒトサンプルを用いた研究は、少量のサンプルと腸手術時に得られたサンプルの希少性によって制限されることがよくあります。早産児におけるNEC発症のメカニズムを解明し、新たな治療戦略を創出することを目標としています。NEC-on-a-Chipシステムは、新生児の腸の生理機能をより正確に反映することで、以前のモデルよりも改善されています。このモデルでは、患者由来の腸管オルガノイド、内皮細胞、および重度のNECを患った新生児のマイクロバイオームをマイクロ流体チップに組み合わせます。

microfluidic-model-necrotizing-enterocolitis-incorporating-human

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオは、リポ多糖類治療によって誘発されるヒト由来の新生児腸内モデルにおける壊死性腸炎疾患の発症を示しています。このモデルは、腸の病態生理学を研究するのに役立ちます。...

ヒト上皮腸質モデルにおける壊死性腸炎の誘発

Enteroids 人間の病気の研究に新たなモデルとして浮上しています。プロトコルでは、新生児の組織から生成された enteroids のリポ多糖 (LPS) 治療を使用して人間の壊死性腸炎の enteroid モデルをシミュレートする方法について説明します。収集した enteroids...

壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

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インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

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新生児大腸 菌 分離株の腸管トランスサイトーシスの評価

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壊死性小腸炎の新生児マウスモデルと免疫細胞プロファイリングのためのLamina Propria分離

大型動物モデルは、新生児仮死の生理学や薬理学の試験で良い並進値を持っています。生まれたばかりの子豚を使用して、我々は全身の血行動態および地域的、生化学的および病理学的経路と相関を持つ酸素の輸送を研究の利点を持っている新生児仮死をシミュレートするための実験プロトコルを開発しています。...

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周産期の窒息後の低酸素性虚血性脳症は、動物モデルを使用して研究することができます。新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデルを確立するために必要な手順を示します。...

新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデル

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新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

学ぶ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル。ヒト新生児由来腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込み、NEC発症メカニズムの解明と新規治療戦略の探索に貢献します。

ヒト新生児腸管内腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込んだ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル

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