Name: ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づくハードコーラル試料のターゲットメタボロミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶガスクロマトグラフィー-質量分析によるハードコーラルのターゲットメタボロミクス手法。サンゴホロビオントの宿主組織と共生藻類を分離し、代謝物抽出プロトコルを確立する。サンゴ保全と復元研究への応用可能性を示す。

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J.L.M.は、UTS Chancellor's Research Fellowshipの支援を受けました。

GC-MSを用いた硬質サンゴ試料の代謝物プロファイリング

著者には開示すべき利益相反はありません。

宿主と共生生物の分離は、簡単な遠心分離によって簡単かつ迅速に達成でき、ここでの結果は、フラクションを分離することで、特定のホロビオントメンバーの寄与を示す貴重な情報が得られ、サンゴの健康の機能分析に貢献できることを示しています。成体のサンゴでは、脂質合成は主に常在する藻類共生生物40によって行われ、脂質(例えば、トリアシルグリセロールやリン脂質)41とストレス回復を促進する脂肪酸を供給する11,42。この研究で共生生物と宿主のプロファイルでより豊富に見られた13の代謝産物のうち、9つは生物学的に重要なエイコサノイドであるDHA(C22:6[ω-6])、EPA(C20:5[ω-6])、およびARA(C20:4[ω-6])を含む脂肪酸であり、これらはサンゴと共生虫科の共生における王国間ストレスシグナル伝達に関与しています9,10</sup...

代謝産物は細胞プロセスの最終生成物を表し、メタボロミクス(特定の生物または生態系によって生成される一連の代謝産物の研究)は、生物の機能の直接的な尺度を提供できます1。これは、ほとんどの管理戦略の目標は特定の生態系サービス機能を維持(または回復)することであるため、生態系、共生相互作用、および回復ツールを探求するために特に重要です2。サンゴ礁は、共生相互作用を解明し、サンゴの生理学的応答をコミュニティレベルおよび生態系レベルの影響に結びつけるためのメタボロミクスの潜在的な価値を実証する水生生態系の1つです3。ハイスループットガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)のアプリケーションは、幅広い代謝物クラスを高い選択性と感度で同時に迅速に分析し、スペクトルライブラリが利用可能な場合に迅速な化合物同定を提供し、サンプルあたりのコストが比較的低く、高レベルの再現性と精度を提供する能力があるため、特に高く評価されています。
サンゴは、サンゴ動物、光合成渦鞭毛藻類の内部共生生物(科:共生虫科4)、および複雑なマイクロバイオーム5,6からなるホロビオントです。全体として、ホロビオントの適応度は、主に各メンバーの代謝機能をサポートするための低分子および元素の交換によって維持される7,8,9,10。メタボロミクス的アプローチは、サンゴの共生特異性9,11、熱ストレスに対する白化応答7,8,12,13、疾患応答14、汚染曝露応答15、光順化16、化学シグナル伝達17の代謝基盤を解明し、バイオマーカーの発見18を支援するのに特に強力であることが証明されています、19。さらに、メタボロミクスは、DNAおよびRNAベースの技術から推測される結論の貴重な確認を提供することができます9,20。したがって、ストレスの代謝バイオマーカーの検出など、サンゴ礁の健康状態を評価し、サンゴ礁保全のためのツールを開発するためのメタボロミクスの使用にはかなりの可能性があります18,19栄養補助金21などの積極的な管理戦略の可能性を検討します。
宿主細胞と共生生物細胞を分離し、それらの代謝物プロファイルをホロビオントとして一緒に分析するのではなく、独立して分析することで、パートナーの相互作用、独立した生理学的および代謝状態、および適応のための潜在的な分子メカニズムについてより多くの情報を得ることができます11,12,22,23,24.サンゴと共生藻科を分離しなければ、複雑なゲノム再構成と代謝モデリングを除いて、サンゴおよび/または共生虫科の寄与と代謝を独立して解明することはほとんど不可能である25が、これはサンゴと渦鞭毛藻の共生にはまだ適用されていない。さらに、宿主や藻類の共生生物の個々の代謝に関する情報をホロビオントの代謝物プロファイルから抽出しようとすると、誤解を招く可能性があります。
例えば、サンゴやホロビオント組織からの抽出物中のC18:3n-6、C18:4n-3、およびC16多価不飽和脂肪酸の存在は、サンゴがオメガ3(ω3)脂肪酸の生産に不可欠なωx脱サチュラーゼを持っていないと考えられていたため、最近まで藻類共生生物に由来すると考えられていました。しかし、最近のゲノム証拠は、複数の刺胞動物がω3 PUFA de novoを産生し、さらにω3長鎖PUFAを生合成する能力を持っていることを示唆しています26。GC-MSと安定同位体標識(例:13 C-重炭酸塩、NaH 13CO 3)を組み合わせることで、制御条件下および外部ストレス要因への応答の両方で、サンゴのホロビオント代謝ネットワークを介して光合成的に固定された炭素の運命を追跡することができます27,28。しかし、13Cの運命を追跡する上で重要なステップは、藻類細胞からのサンゴ組織の分離であり、サンゴの宿主画分に13C標識化合物が存在する場合にのみ、サンゴに転座したシンビオディニア科由来の代謝物または転座した標識化合物の下流生成物として明確に割り当てることができます。この技術は、光合成が共生生物から宿主へと移動する主要な形態はグリセロールであるという長年の仮定に異議を唱え29、白化中にパートナー間の栄養フラックスがどのように変化するかを解明することによってその力を実証しました27,28および互換性のないSymbiodiniaceae種11。
組織を分離する決定は、主に研究課題によって左右されますが、このアプローチの実用性、信頼性、および潜在的な代謝への影響を考慮することが重要です。ここでは、ホロビオントから代謝物を抽出するための詳細で実証された方法、および宿主と共生生物の分画を分離します。宿主と共生生物の代謝物プロファイルを独立して比較し、これらのプロファイルをホロビオントの代謝物プロファイルとどのように比較するか。

<table><tbody><tr><td>100% LC グレード メタノール</td><td>メルク</td><td>439193</td><td>LC グレード必須</td></tr><tr><td>2 mL 微量遠心チューブ、PP</td><td>エッペンドルフ</td><td>30121880</td><td>ポリプロピレンは、化学薬品、機械的ストレス、極端な温度に対する高い耐性を提供します</td></tr><tr><td>2030 島津製作所 ガスクロマトグラフ</td><td>島津</td><td>製作所 GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 & マイクロ;m 酸洗浄ガラスビーズ</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>このサイズは、Symbiodiniaceae細胞を壊すのに最適です</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus 多機能オートサンプラー</td><td>島津</td><td>製作所AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード試薬</td><td>メルク</td><td>B6916</td><td>任意のタンパク質比色試薬が許容されます</td></tr><tr><td>圧縮空気ガン</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>同様のデザインが許容されます。1mLのチップオーバーにフィットするフィッティングを用意することが重要です。</td></tr><tr><td>&nbsp;DB-5カラム、内径0.25mmのカラムと1μ;m 膜厚</td><td>アジレント</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>メルク</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-ソルビトール-6-13C および/または 13C5&ndash;15N バリン</td><td>メルク</td><td>605514/600148</td><td>メタノールに内部標準片のいずれかまたは両方を添加することができます。</td></tr><tr><td>平底 96ウェルプレート</td><td>メルク</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシンチレーションバイアル</td><td>メルク</td><td>V7130</td><td>20 mL、非プラスチックシール付き</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>メルク</td><td>56834</td><td>利用できない場合は、ウシ血清アルブミンは許容されます</td></tr><tr><td>プライマー</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>島津製作所 LabSolutions インサイト ソフトウェア</td><td></td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S5881</td><td>ペレット 1 M 溶液</td></tr><tr><td>整頓</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R パッケージ</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>または類似</td></tr>の <tr><td>TQ8050NX トリプル四重極質量分析計</td><td>島津</td><td>製作所 GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 ウェルプレート</td><td>グライナー</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Whirl-Pakサンプルバッグ</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>サンプル収集バッグ;サイズ:~5cmのサンゴの破片を収納するのに十分な大きさですが、水が広がりすぎるほど大きすぎません</td></tr></tbody></table>

ガスクロマトグラフィー-質量分析に基づくハードコーラル試料のターゲットメタボロミクス

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)ベースのアプローチは、刺胞動物と渦鞭毛藻の共生の代謝基盤と、サンゴがストレス(つまり、温度による白化)にどのように応答するかを解明するのに強力であることが証明されています。刺胞動物の宿主とそれに関連する微生物(Symbiodiniaceaeと他の原生生物、細菌、古細菌、真菌、ウイルス)で構成されるサンゴのホロビオントの定常状態代謝物プロファイリングは、サンゴの全体的な代謝状態を特徴付けるために、環境条件およびストレス条件下でうまく適用されています。
しかし、共生相互作用をめぐる疑問に答えるためには、サンゴの宿主とその藻類共生生物の代謝物プロファイルを独立して解析する必要があり、これは組織の物理的な分離と単離、それに続く独立した抽出と分析によってのみ達成できます。メタボロミクスの応用はサンゴ分野では比較的新しいものですが、研究グループの継続的な努力により、サンゴの宿主組織と藻類共生生物の分離など、サンゴの代謝物を分析するための堅牢な方法が開発されました。
このホワイトペーパーでは、GC-MS 分析のためのホロビオント分離と代謝物の抽出について、検討すべき重要な最適化ステップを含め、ステップバイステップで説明します。2つの分画(サンゴとシンビオディニア科)の複合代謝物プロファイルが全体(ホロビオント)のプロファイルと類似していることを、独立して分析すると、組織を分離することで、全体だけでは得られない2つのパートナーの代謝と相互作用に関する重要な情報も得ることができることを実証します。

この作業中に生成されたすべてのデータは、補足情報で入手できます。
宿主と共生生物の分離
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> 図1:サンゴの宿主組織と共生痊科細胞の分離のセットアップと検証。 (A)サンゴの骨格からサンゴ組織を除去するためのエアガンのセットアップ。ピペットチップは電気テープでエアガンに取り付けられ、チップから小さな(~5mm)セクションが切断され、チップから外れることなくより多くの空気を逃がすことができます。(B)ホロビオントと分離した宿主組織(上清)と共生虫科細胞(ペレット)の例。この値は、遠心分離ステ...

ここでは、ガスクロマトグラフィー質量分析のために、サンゴのホロビオントからの極性および半極性代謝産物の抽出と調製、ならびに分離されたサンゴの宿主組織とSymbiodiniaceae細胞分画を紹介します。

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

すべての生物と同様に、サンゴは免疫と繁殖のためにサンゴ礁を成長させ、構築し、変化する環境条件に耐えるために、最高の栄養に依存しています。しかし、通常の条件下または変化する条件下でのサンゴの最適な栄養と、サンゴのホロビオントの各メンバーがこの栄養状態にどのように貢献しているかについては、ほとんどわかっていません。サンゴは、宿主とさまざまな共生微生物で構成されるホロビオントです。これらには、Symbiodiniaceae、原生生物、細菌、ウイルス、真菌が含まれます。ホロビオントの適応度は、これらのメンバー間の代謝相互作用に依存します。例えば、Symbiodiniaceaeは、宿主の代謝をサポートし、変化する条件に適応するのを助けるために光合成を提供します。この重要なパートナーシップを理解するには、各パートナーの化学組成と代謝組成を個別に研究する必要があります。これらの知見は、代謝解析のために宿主と共生生物の画分を分離することで、より多くの情報が得られることを実証しました。ただし、ホロビオントに対して別々のフラクションを分析するという決定は、最終的には研究課題によって支配されます。そこで、ホロビオントの分析が望ましい場合には、ホロビオントの代謝物抽出の方法論と、分析中にできるだけ多くの情報を得るための提案を行いました。この研究で使用された方法は、研究のための新しい道を開きます。これらには、潜在的なバイオマーカーの発見、特定のライフステージやストレス状態における主要な代謝物の特定、特定の種との関連の利点の理解、ホロビオント内の相互作用の調査が含まれます。今後の研究では、サンゴ礁の保全と回復に応用するバイオマーカーの検出など、ここで確立されたプロトコルをいくつかの研究分野に適用することに焦点を当てます。この方法論は、フラクションの分離が他の生理学的測定では不可能な場合にも適用できます。たとえば、サンゴのコロニーからの揮発性代謝物の排出量を分析する場合などです。

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生物学

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