クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製
2023年9月8日
ここでは、単分子膜のグラフェンを電子顕微鏡グリッドに塗布するためのプロトコールと、クライオ電子顕微鏡の構造決定に使用するための調製方法について説明します。
現在、生体試料を最適に保存することは、高分解能クライオ電子顕微鏡構造を得る上で大きな課題となっています。サンプル調製プロセス中、試料は疎水性の空気と水の界面にさらされ、サンプルに変性効果をもたらし、安定したサンプルが氷の中で優先的に配向する可能性があり、高分解能の構造決定を妨げる可能性があります。軟質酸化グラフェンのような炭素の薄層でクライオ電子顕微鏡グリッドをコーティングすることは、空気と水の界面との相互作用に関連する問題に対処するために一般的に使用されてきました。
ただし、このレイヤーは画像のバックグラウンドノイズを増加させることが多く、構造の解像度が低下します。グリッドをグラフェンの単層でコーティングすると、大きなバックグラウンドノイズを発生させることなく、同様の保護を実現します。グラフェンでコーティングされたクライオ電子顕微鏡グリッドを使用することで、空気と水の界面との相互作用に関連する問題を克服できますが、市販のグラフェングリッドは高価であり、多くのラボでは、グラフェングリッドは複雑すぎて社内で準備できないと考えています。
クライオ電子顕微鏡分野の研究者は、この段階的なプロトコルを使用して、完全に生産された数十個の高品質グラフェンを1日で再現できるようになりました。
概要
本研究では、高解像度クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）のために生物学的試料を最適に保存するという課題に取り組んでいます。著者らは、バックグラウンドノイズを最小限に抑え、イメージング中の試料の完全性を向上させるために、EMグリッドを単層のグラフェンでコーティングするプロトコルを提示します。
研究の主要構成要素
研究分野
- クライオ電子顕微鏡法
- 生物学的イメージングにおける試料保存
- 顕微鏡法におけるグラフェンの応用
背景
- 生体試料の保存は、高分解能のクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）構造解析において極めて重要です。
- 従来のカーボンコーティングは、イメージングにおける背景ノイズを増大させる可能性があります。
- グラフェンは、画像品質を損なうことなく保護層を提供します。
使用した手法
- EMグリッドへのグラフェン単層の適用
- クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）イメージング技術
- 自作スピンコーターおよび各種洗浄剤の使用
主要な結果
- グラフェンコートグリッドを使用することで、イメージングにおけるバックグラウンドノイズが低減します。
- 本手法により、高品質なグラフェンの大量生産を1日で行うことが可能です。
- EMグリッドは、生物学的試料の効率的な保存および濃縮を可能にします。
結論
- 本プロトコルは、ラボでグラフェンコーティングEMグリッドを作製するための簡便な手法を提供する。
- この進展により、生物学的研究におけるクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）イメージングの向上が期待できる。
よくある質問
業界における実用的意義
高解像度クライオ電子顕微鏡（cryoEM）は、構造生物学および創薬において極めて重要ですが、気液界面におけるサンプルの変性や配向バイアスが、データの質とスループットを制限しています。単層グラフェンコートグリッドは、高分子の完全性を維持し背景ノイズを低減させることでこれらのボトルネックを解消し、初期探索およびターゲットバリデーションに直接的な影響を与えます。グラフェングリッドの拡張可能な院内作製手法は、より広範な導入を可能にし、ポートフォリオ全体での構造研究を支援し、メカニズム解明によるリスク低減を加速させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- ターゲットバリデーションに向けた、高忠実度な高分子複合体の構造解析を可能にします。
- 変性と凝集を抑制し、初期探索におけるメカニズムのデリスク化を支援します。
- 配向の多様性を向上させ、構造モデルにおける予測の信頼性を高めます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 後続のスクリーニングに向けて、再現性の高い低バックグラウンドのcryoEMグリッドの作製を容易にします。
- ノイズや濃度アーティファクトを最小限に抑えることで、定量的なイメージングをサポートします。
- より低いサンプル濃度においても、タンパク質複合体の信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 堅牢な構造データの生成を支援することで、創薬から前臨床バリデーションまでの連続性を向上させます。
- 構造分解能を高めることで、トランスレーショナルバイオマーカーの開発と整合させます。
- 曖昧または不完全な構造データに起因する、開発後期段階での失敗のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
単層グラフェンコートグリッドは、初期の発見からリード化合物の同定、さらには前臨床研究に至るまでのcryoEMワークフローに組み込まれ、仮説に基づいた構造研究を支援し、再現性の高い高品質なイメージングを可能にします。
- 探索生物学： 天然の高分子コンフォーメーションを維持することで、仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 定量的なcryoEMアッセイに適した、標準化され再現性のあるグリッドを提供します。
- 分析： 低ノイズで高解像度の画像を提供し、堅牢な比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 治療候補物質の信頼性の高い構造特性評価を可能にし、前臨床段階の連続性を向上させます。
- エンタープライズ再利用： さまざまなプログラムにわたる反復的な構造研究に向けた、拡張可能で費用対効果の高いプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 構造生物学における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値： グリッド作製を標準化し、再現性を向上させ、バッチ処理によるスケールアップを可能にする。
- 戦略的価値： より高品質なデータを通じて、Go/No-go判断を加速させ、後期段階の生物学的リスクを軽減する。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けと、構造的に検証されたターゲットの推進を支援する。
実施上の検討事項
- cryoEMグリッドの取り扱いおよびグラフェンの操作に関する専門知識が必要です。
- スピンコーター、ドラフトチャンバー、および標準的なEMグリッド作製設備へのアクセスが必要です。
- グリッドの品質とイメージング結果の再現性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- タンパク質のクラスや試料の種類に応じて、最適化が必要になる場合があります。
- 潜在的な制限事項として、操作への感受性や、グラフェン転写工程における初期トレーニングが挙げられます。
