Name: クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶ、単層グラフェン被覆格子の作製プロトコルにより、クライオ電子顕微鏡における背景ノイズを低減し、生物試料の高分解能構造解析を可能にする方法です。

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Scripps Researchでこれらの方法を確立する際に有益な議論をしてくれたXiao Fan博士に感謝します。B.B.は、ヒューイット医学研究財団のポスドク研究員の支援を受けました。W.C.は、全米科学財団の博士課程前フェローシップの支援を受けています。D.E.P.は、米国国立衛生研究所(NIH)のG.C.L.への助成金NS095892によってサポートされています。このプロジェクトは、NIHの助成金GM142196、GM143805、およびG.C.L.へのS10OD032467によっても支援されました。

TEMグリッドのグラフェン単層によるコーティング

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
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著者には開示すべき利益相反はありません。

生体試料をガラス質氷の薄層に保存することは、高分解能クライオ電子顕微鏡による構造決定にとって非常に重要なステップです。しかし、研究者はしばしばAWIとの相互作用から生じる問題に遭遇し、好ましい配向、複雑な分解、変性、凝集を引き起こします。さらに、サンプルは、有窓フィルムの穴を横切って吊り下げられた薄い氷を埋めるのに十分な濃度を常に確保できるとは限りません。いくつかの研究グループは、これらの制限24,25,26,27,28,29,30のいくつかを克服するために、EMグリッドをグラフェンの単層でコーティングする方法を開発し、グラフェングリッドは大きな成功を収めています。ここでは、グラフェングリッドのバッチを社内で効果的に準備し、TEMでグラフェングリッドの品質を調べるためのステップバイステップの説明を提供します。私たちは、以下に概説するいくつかの重要なステップにおいて、特別な注意を払う必要があることを強調します。
グラフェンは、空気中の汚染物質を引き寄せる傾向が強い。したがって、グラフェングリッド製造プロセスでは、グラフェン/ Cuシートまたはグリッドと接触するすべてのツールが清潔でほこりがないことを確認することが重要です。グラフェンの転写に使用されるガラスカバーガラスは、エタノールと純脱イオン水ですすぐか、エアダスターを使用して洗浄できます。また、ドラフトの下で作業し、グラフェンシートとグリッドを常にホイルまたは清潔なガラス板で覆っておくことをお勧めします。グリッド上のほこりや汚染物質は、グラフェンがEMグリッドに完全に付着するのを妨げる可能性があります。グラフェンまたはグラフェン被覆グリッドを取り扱う場合、静電気放電によるグラフェン膜の損傷を防ぐために電気的に接地することが重要です。静電気放電は、リスト接地ストラップを使用すること、グラフェンまたはグラフェングリッドが取り扱われるたびに接地された金属物体に触れること、および/またはピンセット24を保持している手に手袋を着用しないことによって回避することができる。
グラフェンの単層は非常に薄い(炭素原子の幅)ため、グラフェンをグリッドに転写する際には、MMAやポリMMA(PMMA)などの有機層でグラフェンを支持することが重要です。PMMAは、グラフェンの転写に最も広く使用されている材料です。しかし、PMMAはグラフェンと強い親和性を持ち、多くの場合、グラフェンフィルムにポリマー汚染を引き起こす可能性があります。MMAは、残留汚染が少ないため、このプロトコルで使用されます25。しかし、PMMAとMMAの両方に、グラフェン膜の一部の領域に見られるしわや亀裂が形成されるという欠点があります(図3B)。これらのしわは、CVD法31によるグラフェン成長中に一般的に発生するため、回避することは困難な場合がある。最近では、銅箔をCu(111)/サファイアウェーハに置き換えて成長基板とする、シワのない超平坦グラフェンを成長させる方法が開発された32。
これまでの経験から、銅エッチング後に脆くなり、後工程での取り扱いが難しいポリマー被覆Cuグラフェンシートをメーカーから購入するよりも、グラフェン/Cuシートを購入し、MMAでグラフェンを自社でサポートする方が良いとしています。MMAコーティングに使用したスピンコーターは、前述のように、地元のコンピューター/ハードウェアストアの部品を使用して安価に構築できます25。
MMAコーティングの工程では、Cu-グラフェンシート上のグラフェン表面全体をMMAで覆うことが重要です。銅がエッチングされた後、MMAグラフェンは半透明になり、MMAの被覆がない領域は空の穴のように見えます。銅面のMMAコーティングを防ぐためには、コーティング中に吸い取り紙を下に置き、CVDフィルムからスピンアウトする余分なMMAを吸収することが重要です。
エッチングとすすぎの後、MMA/グラフェンシートは、水位を制御するためにシリンジまたは蠕動ポンプを備えた市販または自家製のトラフシステムを使用してEMグリッドに移す準備が整います。転写ステップの前に、クロロホルム、アセトン、IPAの連続した浴でグリッドを完全に予備すすぐことが重要です。グラフェンでコーティングされたグリッドを65°Cで焼成すると、グラフェンの完全性が維持され、グリッドへのグラフェンの吸着が促進されます。最後に、グリッド上のMMA汚染を防ぐためには、アセトン浴でMMAを完全に除去し、IPAでグリッドを洗浄することが重要です。洗浄されていないMMAの残留物はEMグリッドで観察され、画像のS/N比が低下します(図3C)。アセトン-IPA洗浄プロセスを繰り返して、グラフェン表面をさらに洗浄することができます。
グラフェングリッドを親水性にするために、グリッドをUV/オゾンに曝露しました。UV/オゾン洗浄剤のモデルによっては、グラフェンに損傷を与えることなく、クライオ電子顕微鏡サンプル調製用のグラフェン層に十分な酸素を供給するための最適化が必要な場合があります。システムに関係なく、UV/オゾン処理直後のクライオ電子顕微鏡試料塗布には、これらのグリッドを使用することが重要です。グラフェングリッドを親水性にする別の方法は、他の研究33,34で説明されています。

単粒子極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、生体高分子の3D構造を研究するために使用される技術として、ますます応用が進んでいます。過去 10 年間の電子顕微鏡光学系、直接電子検出1、およびコンピューターアルゴリズム 2,3,4 の技術的進歩により、クライオ電子顕微鏡ユーザーは、生化学的に安定な高分子複合体の構造を原子に近い分解能で決定できるようになりました 5,6,7,8.これらの進歩にもかかわらず、クライオ電子顕微鏡イメージング用のサンプルの保存には顕著な障壁が残っており、生体試料の大部分をこのような高解像度に分離するのを妨げています。

この方法は、さまざまな生体試料の構造決定に使用されてきましたが、一般的に使用されているクライオ電子顕微鏡試料作製法はすべて、試料を疎水性の気水界面(AWI)にさらすため、高分解能の構造決定を制限する問題がしばしば発生します。生体試料はAWIに曝露されると変性する傾向が高く、複雑な凝集と分解につながる可能性があることが確立されています11、12、13、14。さらに、生体試料の表面上の疎水性パッチは、粒子を氷12中で好ましい配向をとらせる。多くのシナリオでは、サンプルの単一の疎水性領域により、すべての粒子が氷の中で単一の配向をとることを余儀なくされ、それによって信頼性の高い再構成を生成する能力が失われます。AWIの問題に加えて、試料は、フィルムの有窓層の表面に対する親和性を示し、穴15内の氷中に浮遊する粒子の数を制限する可能性がある。
AWIや映画との相互作用から生じるこれらの問題を軽減するために、いくつかの方法論的および技術的解決策が開発されました16,17。一般的なアプローチの1つは、EMグリッドの有窓フィルムをアモルファスカーボンの薄い層(数十ナノメートル)でコーティングすることです。このコーティングは、粒子が吸着できる穴全体に連続した表面を提供し、AWI15、18、19、20との相互作用からサンプルを部分的に遮蔽するという利点があります。しかし、炭素層が追加されると、イメージング領域のバックグラウンドシグナルの量が増加し、特に小さな(<150 kDa)試料では、達成可能な分解能を損なう可能性のあるノイズが発生します。近年、酸化グラフェン(GO)フレークを使用してクライオ電子顕微鏡グリッド上に支持膜を生成することは、従来のアモルファスカーボンよりも優れていることが示されています。GOフレークは、グラファイト層の酸化によって生成され、表面とエッジにカルボキシル、ヒドロキシル、およびエポキシ基の形で実質的な酸素含有量があるため、親水性の単層グラファイトの疑似結晶シートが得られます。水性懸濁液中の市販のGOフレークは安価であり、GOフレークをEMグリッドに適用するための多数の公開方法があります18,21。ただし、これらの方法では、多くの場合、グリッドが GO フレークで部分的にしか覆われず、領域に GO フレークの複数の層が含まれることになります。さらに、GOフレークは、薄いアモルファスカーボンで観察されたものに近いクライオ電子顕微鏡画像に顕著なバックグラウンドシグナルを寄与する22,23。
炭素原子の単一の2次元結晶アレイからなる原始的な単層グラフェンは、電子顕微鏡で位相差を生じないという点でGOとは異なります。したがって、単層グラフェンは、生体試料をイメージングするための目に見えない支持層を生成するために使用できます。また、単層グラフェンはGOよりも強度が高く、EMグリッド上に単層として適用することができ、近年のグラフェン被覆EMグリッドの作製技術の進歩により、高被覆単層グラフェングリッドを自社で作製することが可能になりました24,25,26,27,28,29,30.しかし、クライオ電子顕微鏡の構造決定にグラフェン被覆グリッドを使用する利点があるにもかかわらず、商業的な選択肢には法外な費用がかかり、社内生産が複雑なため、広くは使用されていません。ここでは、生体試料のクライオ電子顕微鏡構造決定のために、単層グラフェンで覆われたEMグリッドを効果的に製造するためのステップバイステップガイドについて説明します(図1)。この詳細なプロトコルに従うことで、クライオ電子顕微鏡の研究者は、1日で数十個の高品質グラフェン支持グリッドを再現性よく準備することができます。グラフェンでコーティングされたグリッドの品質は、LaB6フィラメントを備えたローエンドの透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して簡単に調べることができます。

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>危険; 細心の注意を払ってください</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>クランプ TEM グリッド ホルダー ブロック 45 グリッド用</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータファン</td><td>アマゾン(Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>ベルコガラス</td><td>1203J71</td><td>標準カバースリップ</td></tr><tr><td>結晶化皿</td><td>パイレックス</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>電子機器ダスター</td><td>ファルコン安全製品</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンダストオフエアダスター</td><td>ステープルズ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>ファインチップピン</td>セット <td>デュモン</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ</td><td>パイレックス</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>フォーク</td><td>スーパーマーケット</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>グラフェン/Cu</td><td>グラフェン</td><td>N/A</td><td>CVD単層グラフェン CU</td></tr><tr><td>グリッド コーティング トラフ</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10840</td>壊れ<td>やすい</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>カプトンテープアマゾン</td><td>(MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>ポリイミドテープ</td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-666</td><td></td></tr>ロング<tr><td>twzeer</td><td>コールパーマーエッセンシャルUX-07387-15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタルグリッドホルダー</td><td>テッドペラ</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Advanced Materials</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>モデル 10 ラボオーブン</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>シャー</td>レ <td>パイレックス</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー(ソララス950)</td><td>ガタン株式会社</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>標準アナログオービタルシェーカーVWR</td><td></td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2 / 1.3 - Au300</td>ク<td>ォンティフォイル</td><td>N / A</td><td>ホーリーゴールドグリッド</td></tr><tr><td>紫外線オゾンクリーニングシステムUVOCS</td><td></td><td>モデルT10X10 / OES</td><td></td></tr></tbody></table>

クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、高分子複合体の原子構造を調べるための強力な技術として登場しました。クライオ電子顕微鏡の試料調製では、通常、有窓支持フィルムの穴内に懸濁したガラス質氷の薄層に試料を保存する必要があります。しかし、クライオ電子顕微鏡研究で一般的に使用されるすべてのサンプル前処理アプローチは、試料を空気と水の界面に曝露するため、試料に強い疎水性効果をもたらし、多くの場合、変性、凝集、および複雑な解離を引き起こします。さらに、試料の領域と空気-水界面の間の好ましい疎水性相互作用は、高分子が採用する配向に影響を与え、異方性指向性分解能で3D再構成を行います。 
グラフェンの単層へのクライオ電子顕微鏡試料の吸着は、バックグラウンドノイズの導入を最小限に抑えながら、空気と水の界面との相互作用を緩和するのに役立つことが示されています。グラフェン担体は、クライオ電子顕微鏡イメージングに必要なタンパク質の濃度を大幅に低減するという利点もあります。これらの支持体の利点にもかかわらず、グラフェンでコーティングされたグリッドは、商業的なオプションには法外な費用がかかり、大規模な社内生産に関連する課題があるため、クライオ電子顕微鏡コミュニティでは広く使用されていません。この論文では、単層グラフェンをほぼ完全にカバーするクライオ電子顕微鏡グリッドのバッチを調製するための効率的な方法について説明します。

ここで説明するグラフェングリッド製造プロトコルの実行に成功すると、グラフェンの単層で完全にコーティングされたEMグリッドが得られます。グリッドのグラフェンカバレッジは、任意のTEMを使用して確認できます。TEMではクリーンなグラフェンの単分子膜はほとんど見えないため、顕微鏡の回折モードで調べ、グラフェンを構成する炭素原子の六方晶組織に対応するブラッグスポットを観察する必要があります(図3A)。MMAコーティング中に導入される単層グラフェンのしわが時折観察されるのは正常です(図3B)。また、グラフェンで覆われた穴の1つの中央で高倍率の画像を取得することで、グラフェンに存在する汚染レベルを確認することもできます(図3C)。高分解能検出器で取得した場合、この画像のフーリエ変換には、2.14 Å の炭素-炭素間隔に対応するブラッグスポットが含まれているはずです(図4C)。炭素原子の単分子膜は位相差を生成するのに十分な電子散乱を生じさせないため、クリーンなグラフェンの画像は、画像のフーリエ変換においてコントラスト伝達関数に関連するトーン環を示さない。しかし、製造後のグラフェングリッドの汚染を防ぐことは非常に困難であり、EMグリッドの洗浄やグラフェンコーティング後のMMAの除去が不十分な場合、グリッドに顕著な汚染物質が実空間画像で見えるようになります(図3C)。図 4 に示すように、0.5 mg/mL のアポフェリチンを穴あき金グリッドに適用した場合(図 4A)、グラフェン担体を使用しない場合(図 4B)を比較すると、グラフェングリッドはサンプルに濃縮効果を発揮します。アポフェリチンなどのタンパク質のクライオ電子顕微鏡構造を高分解能で解析するために、同様のグラフェン製造プロトコルが以前に報告されている25,27。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> 図1:グラフェンでコーティングされたクライオ電子顕微鏡グリッドを作製するための概略図。 グラフェングリッド製造プロセスにおける主要なステップを図示する。略語:クライオEM = cryogenic electron microscopy;MMA =メタクリル酸メチル;APS = 過硫酸アンモニウム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> 図2:グラフェングリッドを作るために必要な材料 。 (A)クライオ電子顕微鏡グリッドのコーティングに必要な材料は、それに応じてラベル付けされています。(B)スライドガラス上のあぶらとり紙にグラフェン/銅シートをテープで貼り付けたコーターの拡大図。スピンコーターは、地元のコンピューター/金物店から部品を購入して組み立てることができます。(C)水位制御に使用できるシリンジに取り付けられたグリッドコーティングトラフの拡大図。グリッドは、ステンレス鋼メッシュ上の吸い取り紙の上に配置されます。あぶらとり紙は、グラフェンシートをグリッドに合わせることができるように、グリッドの位置を操作するのに役立ちます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> 図3:しわやMMA汚染を示すグラフェングリッドの代表的な回折パターン画像と明視野画像 。 (A)グラフェンの単層で覆われたEMグリッドは、回折モードのTEMでイメージングすると、グラフェンの六方格子に対応するブラッグピークを示します。2.14 Å の炭素-炭素間隔に対応するブラッグピークは丸で囲まれ、矢印で示されています。(B)単分子膜の皺(矢印で示す)がある単層グラフェングリッドの明視野画像。(C)MMA汚染のある単層グラフェンの明視野画像(矢印で表示)。スケールバー = 100 nm (B,C)。略語:EM =電子顕微鏡法;MMA = メタクリル酸メチル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> 図4:グラフェンで覆われた金グリッド上のアポフェリチン:(A)グラフェンで覆われた金グリッド上の0.5 mg/mLアポフェリチンのクライオ電子顕微鏡写真。(B)同じ濃度で画像化されたアポフェリチンは、グラフェンを含まない穴の開いた金グリッドを使用して調製した場合、実質的に低い濃度で見ることができます。(C)グラフェンで覆われた金グリッド上の0.5 mg/mLアポフェリチンのクライオ電子顕微鏡写真のFFT(ブラッグピークは六方形グラフェン格子に相当)。スケールバー = 100 nm (A,B)。略語:クライオEM = cryogenic electron microscopy;FFT = 高速フーリエ変換。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、単分子膜のグラフェンを電子顕微鏡グリッドに塗布するためのプロトコールと、クライオ電子顕微鏡の構造決定に使用するための調製方法について説明します。

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

現在、生体試料を最適に保存することは、高分解能クライオ電子顕微鏡構造を得る上で大きな課題となっています。サンプル調製プロセス中、試料は疎水性の空気と水の界面にさらされ、サンプルに変性効果をもたらし、安定したサンプルが氷の中で優先的に配向する可能性があり、高分解能の構造決定を妨げる可能性があります。軟質酸化グラフェンのような炭素の薄層でクライオ電子顕微鏡グリッドをコーティングすることは、空気と水の界面との相互作用に関連する問題に対処するために一般的に使用されてきました。ただし、このレイヤーは画像のバックグラウンドノイズを増加させることが多く、構造の解像度が低下します。グリッドをグラフェンの単層でコーティングすると、大きなバックグラウンドノイズを発生させることなく、同様の保護を実現します。グラフェンでコーティングされたクライオ電子顕微鏡グリッドを使用することで、空気と水の界面との相互作用に関連する問題を克服できますが、市販のグラフェングリッドは高価であり、多くのラボでは、グラフェングリッドは複雑すぎて社内で準備できないと考えています。クライオ電子顕微鏡分野の研究者は、この段階的なプロトコルを使用して、完全に生産された数十個の高品質グラフェンを1日で再現できるようになりました。

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

極低温電子顕微鏡(クライオEM)グリッドに支持層を適用することで、粒子密度を高め、空気と水の界面との相互作用を制限し、ビーム誘起運動を低減し、粒子配向の分布を改善することができます。この論文では、クライオサンプル調製を改善するために、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの単層でコーティングするための堅牢なプロトコルについて説明します。...

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このビデオでは、プラズマの結合なしニューロンマイクロ流体デバイスを使用する方法を示します。...

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6ウェルプレートでの空間的、時間的な酸素化のコントロールが強化さを提供するアドオンプラットフォームの作製と検証。デバイスは、文化のシステムの数に適応可能であり、創傷治癒に及ぼす酸素の影響を調査するために使用することができます。...

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ここで提示されるプロトコルは、液体クライオゲンのガラス化の前に最低90ミリ秒混合する自己ウィッキング、ナノワイヤーグリッドに関心のある2つのサンプルを提供するために、新しいロボットシステムであるSpotitonを使用することを説明しています。...

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クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製

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