Name: 腫瘍微小環境の空間免疫細胞ランドスケープのマルチプレックス免疫組織化学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学ぶマルチプレックス免疫組織化学法による腫瘍微小環境の免疫細胞ランドスケープ解析。FFPE組織を用いて免疫細胞の種類と位置を可視化し、抗がん治療への反応を評価する手法を習得できます。

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PhenoImager HTは、ラドバウド大学医療センターとラドバウド顕微鏡技術センターの資金提供により購入されました。CFは、Dutch Cancer Societyの助成金(10673)とERC Advの助成金ARTimmune(834618)によって財政的にサポートされています。JTは、NWO Vidi助成金(VI.Vidi.192.084)によって財政的にサポートされています。著者らは、マルチプレックスIHCデータを保存するワークフローの作成に協力してくれたEric van Dinther氏とAnkur Ankan氏に感謝し、ROI描画のためにQuPathにマルチプレックスIHCデータを実装する方法についての指示を受けたBengt Pung氏に感謝します。

腫瘍免疫ランドスケープのマッピング:詳細なマルチプレックスIHC解析プロトコル

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

TMEの空間解析は、免疫細胞コンパートメントについてさらに学び、特に免疫腫瘍学の分野で新しい予後および予測バイオマーカーを発見するための求められている手法です16。この目的のために、タンパク質、mRNA転写産物、またはこれら2つの組み合わせの検出を含む多くの異なる技術が開発されており、最大100〜1,000のターゲットを推定します。しかし、マルチプレックス化が進むと、ハイスループットな実験、実験コスト、技術的な課題が減り、多くの場合、TMEのごく一部しか解析できません。ここで説明するTSAベースの方法を使用したマルチプレックスIHCは、6つの異なるマーカー+ DAPIを同時に検出し、比較的安価に実行でき、組織切片全体を20分以内にイメージングし、完全に分析する準備ができています。この技術は、染色手順の自動化により、複雑さが軽減されました。2つの追加フィルターの追加を含むマルチスペクトル顕微鏡の改良により、スペクトルのアンミキシングとスキャン時間が大幅に改善されました。最大8つの異なるマーカー+DAPIを同時に検出することが可能です。しかし、マルチプレックスをより多くのマーカーで拡張すると、スペクトルのアンミキシングがより困難になり、スライド全体のスキャン時間が大幅に増加するため、前述の利点はなくなります。診断現場での実施を容易にするために、異なる施設間でマルチプレックスIHCを標準化する取り組みが行われています。このマルチプレックスIHCの標準化のために、6つの異なるマーカー+ DAPIを使用して、よりアクセスしやすいプロトコルに従うことをお勧めします。それにもかかわらず、まだかなりの技術的なノウハウが必要であり、ダウンストリーム分析は困難な場合があり、そのためにこのプロトコルで説明されている方法論を開発しました。
標準化は、マルチプレックスIHCパネルの開発から始まります。特定のタンパク質標的を検出する一次抗体を選択することの重要性は、17以前から強調されてきました。当社のマルチプレックスIHCパネルは、主に一次抗体クローンを使用して開発されており、診断部門でもIHCに使用され、検証されています。しかし、樹状細胞マルチプレックスIHCパネルの場合、ほとんどの抗体は診断現場で使用されていませんでした(van der Hoorn et al.、提出原稿)。特異性を確保し、バッチの違いを最小限に抑えるために、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を使用することを選択し、トランスフェクションした細胞株と初代細胞を使用してほとんどの抗体も検証しています。長年にわたり、Vectra 3システム18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32を使用した多数の研究で、さまざまなバージョンのマルチプレックスIHCパネルが使用されてきました.これらのマルチプレックスIHCパネルをPhenoImager HTシステムに最適に実装するためには、一次抗体と蛍光色素の組み合わせにいくつかの調整を行う必要がありました。全組織切片のより良いスペクトルアンミキシングとスキャン時間の短縮の恩恵を受けるためには、最新のOpal480およびOpal780蛍光色素を実装し、7色のマルチプレックスIHCパネルでOpal540およびOpal650蛍光色素の使用を避ける必要があります。スキャン時間は、組織切片のサイズにもよりますが、3~10倍速くなります。マルチプレックスIHCパネルの調整は非常に簡単に実現できましたが、いくつかの考慮事項を念頭に置く必要があります。Opal480の蛍光スペクトルは、自家蛍光スペクトルと多く重複するため、赤血球や他の自己蛍光構造のスペクトルアンミキシングを妨げます。一次抗体の濃度を上げてOpal480と組み合わせることで、ほとんどの場合、この問題が解決しました。PhenoImager HTに独自のサンプルAFフィルターを実装すると、Opal480と自家蛍光のアンミキシングが容易になります。ただし、Opal480と併用すると明確なシグナルが得られる一次抗体を使用するのが最善であり、そのシグナルは自家蛍光よりも高くなります。
これらのマルチプレックスIHCパネルは確立されていますが、バッチ間のバリエーションを考慮する必要があります。フルマルチプレックスIHC実験を開始する前にモノプレックスIHCコントロールを行うことで、実験ごとに一次抗体の性能が強いか弱いかが観察されることがありました。この原因としては、ピペッティングエラー、試薬の保管条件が最適でない、保存期間などが考えられます。私たちは、経験に基づいて一次抗体溶液を調整することでこれを解決しました。前述の調整を行う必要がなかった場合でも、マルチプレックスIHCバッチ実験のたびに、モノプレックスIHC染色コントロールスライドに基づいて露光時間を設定することが重要です。
私たちの研究は当初、さまざまな種類のがんと黒色腫に焦点を当てていたため、マルチプレックスIHCパネルは、最小限の調整で腫瘍タイプ間で交換可能である必要がありました。したがって、最適化プロセスには常に複数の(腫瘍)組織タイプを含め、免疫細胞マーカーの一次抗体の希釈は、異なる腫瘍タイプ間で同等に保つことができることを観察しました。ただし、がんと黒色腫の間の腫瘍組織検出には、異なる腫瘍マーカーが必要です。したがって、腫瘍マーカーは常に各マルチプレックスIHCパネルの最後に機能するように最適化されており、現在は常にOpal780と組み合わせて使用されています。Opal780は、偶然にもマルチプレックスIHC染色手順の最後の蛍光色素分子になければなりません。したがって、マルチプレックスIHCの最後に腫瘍マーカーを使用することにより、これらのマルチプレックスIHCパネルは、神経膠芽腫(すなわち、GFAP)およびホジキンリンパ腫(すなわち、CD30)などの他の腫瘍タイプと容易に交換することができる。血管肉腫に対しては、赤芽球形質転換特異的遺伝子(ERG)を用いたこのリンパ球マルチプレックスIHCパネルを腫瘍マーカーとして用い、最適化実験は25回のみであった。最適化には、ERG一次抗体の滴定と、最後にERGを使用したマルチプレックスIHCパネルの試験が含まれていました。
これらのマルチプレックスIHCパネルに対する他の調整は、特定の免疫細胞マーカーを別の免疫マーカーまたは機能マーカーと交換することによっても行うことができます。すべての変更には最適化が必要です。最適化のためのプロトコルは、前に説明した17に従うことができる。提案されたマルチプレックスIHCパネルへの特定の変更は、私たちが作成したImmuNetアルゴリズムに干渉します。十分なデータを生成する必要があり、これらの変更をアルゴリズムに実装するために時間を費やす必要があります(新しいマーカーや細胞表現型ごとに少なくとも750のアノテーション、および以前にトレーニングされたマーカーの検証に150のアノテーション)。本パネルには機能マーカーは含まれていませんが、PD-1やPD-L1などの免疫チェックポイントマーカーのマルチプレックスIHCパネルへの実装は当研究室で行っています。しかし、負のシグナルとポジティブのシグナルでバイナリーが少ないマーカーの解析はより困難であることが証明されており、私たちのグループでは活発な研究が行われています。
マルチプレックスIHCで同時に評価できるマーカーの数は、他の新しい技術と比較して限られています。これは、FFPE ブロックの連続するスライス上の異なるパネルを分析することで回避できますが、これらのスライスを空間的に比較することは困難です。スライドの準備後、向きと折りたたまれたアーティファクトは同じではない可能性があります。それにもかかわらず、マルチプレックスIHCは非常にアクセスしやすいため、より多くの機関や研究者にとって魅力的なツールとなり、したがって、診断環境での将来の実装により適しています。複数の腫瘍タイプと下流の分析パイプラインに対するマルチプレックスIHC免疫細胞パネルの標準化により、患者と腫瘍タイプ間のTMEの違いについてより多くの知識を得ることができます。これにより、例えば、特定の治療に対する抗腫瘍反応におけるTMEの役割について、より深い洞察を得ることができます。これにより、治療への反応や予想生存率などの要因を予測するための新しいバイオマーカーが生まれる可能性さえあります。全体として、これにより、マルチプレックスIHCは、個別化医療アプローチにおいて、臨床上の意思決定を支援する臨床ツールになることができます。確かに、分析手順のより多くのステップは、日常の診断設定で使用できるようにするために自動化および標準化されるべきであり、現時点では、それは主に未来的な視点です。
1つのサンプルスライド上の複数のマーカーの分析は、技術的な課題にもかかわらず、非常に強力なツールになる可能性があります。標準化された実験プロトコルと堅牢な分析方法により、ここでImmuNetを使用して説明したように、複数のマーカーの定量化により、従来のIHCよりも情報量が多くなり、マルチプレックスIHCは新しい高プレックス実験法と比較して比較的ハイスループットのままです。

免疫細胞は、ウイルスや細菌などの病原体に対する防御だけでなく、がん細胞に対する防御にも重要な役割を果たします1。したがって、腫瘍微小環境(TME)内の免疫系は、予後および予測バイオマーカーの発見に多くの期待を寄せています2。免疫細胞の浸潤は、さまざまな種類のがんの予後と相関していますが、これはまだ臨床ケアで実施されていません3,4。ほとんどの腫瘍タイプでは、細胞傷害性T細胞およびヘルパーT細胞の数が多い、および/または制御性T細胞の数が少ないことが良好な予後に関連しています。結腸直腸癌のTNM病期分類にいわゆる「免疫スコア」を組み込み、TNM-I病期分類に変える努力が進行中です5,6。イムノスコアは、腫瘍のコアと腫瘍の浸潤性断端(IM)の2つの異なる腫瘍領域におけるT細胞(CD3で検出)と細胞傷害性T細胞(CD8で検出)の総数から導き出されます。イムノスコアは、黒色腫、肺がん、乳がんなど、他の種類のがんでも予後的価値があることが提案されています6,7,8,9。さらに、免疫細胞浸潤は、チェックポイント遮断免疫療法10に対する応答にも相関し得る。ただし、これらの予測バイオマーカーは、臨床診療で日常的に実施する前に、前向き研究で検証する必要があります。さらに、単一のバイオマーカーでは意味のある予測には不十分であることも提案されています11。したがって、異なるバイオマーカーを組み合わせて患者サンプルの完全なマップを作成することは、いわゆる「がん免疫図」12のより包括的な予測バイオマーカーとして提案されています。
TME内の免疫細胞を研究する方法の中で、最も古く、最もよく知られている技術は免疫組織化学(IHC)であり、いくつかの疾患、特に癌13の診断検査に日常的に使用されています。この技術は、1つまたは少数のマーカー14 を長期間使用することに限られていたため、研究環境では、フローサイトメトリーや遺伝子発現プロファイリング(GEP)などの他の技術に負けていた。しかし、日常的な診断や研究で一般的に使用されるホルマリン固定およびパラフィン包埋(FFPE)腫瘍組織は、フローサイトメトリーやGEPには(最適に)適していません。さらに、GEPとフローサイトメトリーは、細胞の表現型と機能について多くの洞察を提供しますが、空間情報の欠如は大きな欠点です。したがって、腫瘍の免疫細胞浸潤領域と免疫細胞排除領域の違いなど、サンプル内の不均一性が検出されない可能性がある15。マルチプレックスIHC、イメージングマスサイトメトリー、CO-Detection by indEXing(CODEX)など、FFPE組織のマルチプレックス解析のための新しいプラットフォームが開発されており、組織切片16内で複数のマーカーを同時に検出するために使用できます。TMEの免疫細胞は、免疫療法に最適なバイオマーカーを見つけるために広く研究されています。しかし、マルチプレックス技術や自動画像解析には、それぞれにハードルがあります。
当研究室では、オパール/チラミドシグナル増幅法(TSA)法を用いたマルチプレックスIHC染色に豊富な経験を有しており、これをIHCプラットホーム上で自動化しています(材料表参照)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29、30、31。私たちは、リンパ球、骨髄細胞、樹状細胞(DC)のさまざまなサブセットを検出するために、免疫細胞パネルを最適化しました。リンパ球や複雑な細胞形態(骨髄細胞やDC)など、免疫細胞の領域が密集している組織は、特に解析が難しく、存在する免疫細胞の数を過大評価または過小評価するリスクがあります。この問題を解決するために、私たちのグループ32によってImmuNet分析ソフトウェアが開発され、この機械学習パイプラインにより、これらのさまざまな種類の免疫細胞の検出品質が大幅に向上しました。ここでは、FFPE材料の取得から、さまざまな組織コンパートメントの免疫細胞密度および免疫細胞タイプ間の距離の分析までの詳細なプロトコルについて説明します。
このプロトコルは、2022年にデジタルパソロジーイメージャーが導入されて以来、ラドバウド大学医療センターでマルチプレックスIHCパネルがどのように行われているかを概説しています。記載されたマルチプレックスIHCパネルは、腫瘍マーカーとして汎サイトケラチン抗体を使用することにより、または腫瘍マーカーとしてメラノサイト関連抗体を使用することにより、異なる癌腫(例えば、肺、前立腺、結腸直腸、膀胱、乳房)に使用することができる。これらのマルチプレックスIHCプロトコールは、一次抗体の濃度、蛍光色素の組み合わせ、および染色手順の順序に関して慎重に最適化されています。私たちや他の人々は、以前にマルチプレックスIHCパネルの最適化について説明しました17,33,34,35。マルチプレックスIHCパネルは適応させることができますが、説明されている分析パイプラインを評価し、それに応じて調整または再トレーニングする必要があります。記載されている7色のマルチプレックスIHCプロトコルは、オパールの蛍光色素Opal480、Opal520、Opal570、Opal620、Opal690、Opal780、および4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を使用しているため、「マルチスペクトルワンタッチ免疫蛍光」(MOTiF)により、イメージャーでの簡単なアンミキシングと高速スキャンが可能になります。9色染色とスキャンは、実験セットアップのさらに微調整と、液晶チューナブルフィルターを使用するイメージャーでのスキャンの別のモードが必要になるため、このプロトコルでは説明されていません。

<table><tbody><tr><td>抗CD14</td><td>細胞マーカー&nbsp;</td><td>114R-16</td><td>セクション3、クローンEPR3653</td></tr><tr><td>抗CD163</td><td>細胞マーカー&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>セクション 3、クローン MRQ-26</td></tr><tr><td>抗 CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>セクション 3、クローン EPR5906</td></tr><tr><td>抗 CD1c (BDCA1)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>セクション 3、クローン OTI2F4</td></tr><tr><td>抗 CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>セクション 3、クローン L26</td></tr><tr><td>抗 CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>セクション 3、クローン sp7</td></tr><tr><td>抗 CD303/Enzo</td><td>Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>セクション 3、クローン 124B3.13</td>抗 CD56 細胞マーカーによる BDCA2 樹状突起</tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>セクション 3、クローン MRQ-42</td></tr><tr><td>抗 CD66b</td><td>BD</td><td>バイオサイエンス 555723</td><td>セクション 3、クローン G10F5</td></tr><tr><td>抗 CD68</td><td>ダコ アジレント</td><td>M087601</td><td>セクション 3、クローン PG-M1</td></tr><tr><td>抗 CD8</td> ダ<td>コ アジレント</td><td>M7103</td><td>セクション 3、クローン C8/144B</td></tr><tr><td>抗 Foxp3</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>14-4777</td><td>セクション 3、クローン 236A/E7</td></tr><tr><td>抗 Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>section 3, clone HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>section 3, clone CR3/43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>section 3, clone A103</td></tr><tr><td>anti-pan cytokeratin</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>section 3, clone AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>section 3, clone EP268</td></tr><tr><td>抗チロシナーゼ</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>セクション3、Biok&eacuteを介したクローンT311</td></tr><tr><td>抗XCR1</td><td>細胞シグナル伝達技術;</td><td>44665S</td><td>セクション3、クローンD2F8T</td></tr><tr><td>抗体希釈剤</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp;ARD1001EA</td><td>セクション3、オパール7色自動化IHCキット50スライド(オプションで10%BSAのTBSTに置き換えることもできます)</td></tr><tr><td>ボンド吸引プローブライ</td><td>カバイオサイエンス</td><td>S21.0605</td>セクション<td>3</td></tr>ボン<tr><td>ド吸引プローブクリーニング</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>CS9100</td><td>セクション3</td></tr>ボン<tr><td>ド脱ワックス溶液</td>ライ<td>カバイオサイエンス</td><td>AR9222</td>セクション<td>3</td></tr>ボン<tr><td>ドObjectglasラベル+印刷リント</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>S21.4564.A</td><td>セクション3</td></tr>ボン<tr><td>ド研究検出システム2</td>ライ<td>カバイオサイエンス</td><td>DS9777セクション</td><td>3</td></tr>ボン<tr><td>ドRXオートステイナー&nbsp;</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>-</td><td>セクション3、自動プラットフォーム</td></tr><tr><td>ボンドTMエピトープ検索1 - 1 L</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>AR9961</td><td>セクション3</td></tr>ボン<tr><td>ドTMエピトープ検索2 - 1 L</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>AR9640</td><td>セクション3</td></tr>ボン<tr><td>ドTMウォッシュソリューション10x - 1 L</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>AR9590</td><td>セクション3</td></tr><tr><td>BONDユニバーサルカバータイル</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>S21.4611</td><td>セクション3</td></tr>ボン<tr><td>ド(TM)滴定キット</td><td>ライカバイオサイエンス</td><td>OPT9049</td><td>セクション3</td></tr>カバー<tr><td>スリップ24 x 32 mm#1(0.13-0.16 mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック15717592</td><td>セクション2</td></tr>カバー<tr><td>スリップ24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td>セクション<td>2</td></tr><tr><td>DAPIフルオロマウント-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>セクション3、モノプレックススライドが公式の分析ではなく、迅速にチェックされる必要があるときはいつでも、DAPIはより良い結果を得るために別々に染色されます</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>セクション2、自家製</td></tr><tr><td>エタノール99.5%</td><td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>セクション2</td></tr>フル<tr><td>オロマウント-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>セクション3&nbsp;</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td></td><td>-</td><td>セクション2、自家製</td></tr><tr><td>ImmuNet</td><td></td><td>-</td><td>免疫細胞検出および表現型パイプライン</td></tr><tr><td>inFormソフトウェア2.4.10</td>ア<td>コヤバイオサイエンス</td><td>-</td><td>セクション4&6</td></tr>オ<tr><td>パール480試薬パック</td>ア<td>コヤバイオサイエンス</td><td>FP1500001KT</td><td>セクション3</td></tr>オ<tr><td>パール520試薬パック</td><td>アコヤバイオサイエンス</td><td>FP1487001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>OPAL 570 試薬パック</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>OPAL 620 試薬パック</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>OPAL 690 試薬パック</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>OPAL 780 試薬パック</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50スライド</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>section 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-section</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>section 4, スライドビューアとイメージングソフトウェア(旧称Vectra Polaris)を備えたデジタルパソロジーイメージャーQuick-D</td></tr> <tr><td>マウント媒体</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>section 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>全スライド画像解析ソフトウェアプラットフォーム</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドボックス</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>セクション1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific through VWR</td><td>631-9483</td><td>セクション1</td></tr><tr><td>Vectra Polarisソフトウェア1.0.13</td><td>Akoya BioSciences</td><td>-</td><td>セクション4</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>セクション2</td></tr></tbody></table>

腫瘍微小環境の空間免疫細胞ランドスケープのマルチプレックス免疫組織化学的解析

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

腫瘍微小環境の免疫細胞ランドスケープには、予後および予測バイオマーカーの発見のための情報が含まれている可能性があります。マルチプレックス免疫組織化学は、空間情報を保持しながら、腫瘍組織内のさまざまな種類の免疫細胞を視覚化および同定するための貴重なツールです。ここでは、組織切片のリンパ球、骨髄、および樹状細胞集団を分析するための詳細なプロトコルを提供します。ホルマリン固定パラフィン包埋切片の切断から始まり、自動プラットフォームでの自動マルチプレックス染色手順、マルチスペクトルイメージング顕微鏡でのスライドのスキャン、自社開発の機械学習アルゴリズムImmuNetを使用した画像分析まで。これらのプロトコルは、腫瘍マーカーを切り替えるだけで、サンプルの異なるコンパートメント(腫瘍と浸潤性マージン)の免疫細胞を分析し、最近傍分析を適用するだけで、さまざまな腫瘍標本に適用できます。この分析は腫瘍サンプルに限定されず、他の(非)病原性組織にも適用できます。過去数年間の機器とワークフローの改善により、スループット時間が大幅に短縮され、診断現場でのこの手順の将来の適用が容易になります。

このプロトコルは、マルチプレックス免疫組織化学を用いた腫瘍微小環境の免疫細胞特性評価がどのように行われるかを詳細に説明しています。

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

私たちの目的は、腫瘍微小環境内の免疫細胞の量、種類、および位置を特定することです。免疫化学の分野では、近年、技術の進歩が目覚ましい。マルチプレックス免疫化学技術の進歩により、より多くのマーカーを確実に研究できるようになりました。現在の実験的課題は、腫瘍サンプル内の特定の種類の免疫細胞を視覚化することですが、これはマルチプレックス免疫化学法を使用して克服されています。しかし、これらの画像を正確に自動解析することは、まだ私たちが取り組んでいる課題です。原発性腫瘍と転移性腫瘍の免疫細胞の状況の違いは、どのような腫瘍固有の特性がこれらの違いを引き起こしているのか、これらの違いは免疫系を標的とする治療法にとって何を意味するのかなどの疑問を生み出します。探索的研究の次に、腫瘍の免疫細胞の状況がさまざまな種類の抗がん療法によってどのように影響を受けるか、免疫細胞の状況が治療の結果を予測できるかどうかなど、臨床的に関連する問題にも焦点を当てます。

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、腫瘍組織に浸潤するT細胞のさまざまな亜集団を分析するためのin-situ蛍光マルチスペクトルイメージング技術を示しています。腎細胞がん組織凍結切片は、特異的な阻害性受容体を発現し、免疫療法抵抗性の表現型を示すCD8+ T細胞を標識する抗体で処理されます。標識された切片をマルチスペクトル顕微鏡を用いて可視化し、異なるCD8+...

免疫療法耐性T細胞亜集団を解析するためのマルチプレックス免疫蛍光イメージング

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パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

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腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ...

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学

私たちは、腫瘍微小環境（TME）を模倣するために透過性の微多孔質膜インサートを適応させました。このモデルは混合細胞培養で構成されており、蛍光標識や細胞選別を使用せずに、高度に濃縮された個々の細胞集団の簡易な生成を可能にし、正常またはストレス条件下でTME内の細胞間コミュニケーションを研究することができます。...

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。...

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タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

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