Name: 膵管腺癌の多能性へのリプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶ膵管腺癌細胞のiPSCへのリプログラミング手法。レンチウイルス導入により安定したiPSC株を樹立し、膵がんの進行段階移行と異質性を解析する。この方法は早期診断マーカーと治療標的の発見に貢献する。

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A.S.とJ.K.は、Cancer Research UKとOHSUの資金提供に感謝します(CRUK-OHSUプロジェクト賞C65925 / A26986)。A.S.は、MRCキャリア開発賞(MR/N024028/1)によってサポートされています。A.A.は、キング・アブドゥルアズィーズ・シティ・フォー・サイエンス・アンド・テクノロジーの博士号奨学金(奨学金文献1078107040)によって資金提供されています。JKは、MRF新治験責任医師助成金(GCNCR1042A)およびKnight CEDAR助成金(68182-933-000、68182-939-000)によって資金提供されています。梶圭介教授には、リプログラミングベクターpSIN4-EF1a-O2SとpSIN4-CMV-K2Mを提供していただき、誠にありがとうございます。オープンアクセスの目的で、著者はクリエイティブ・コモンズ表示(CC BY)ライセンスを、この投稿から生じる著者が承認した原稿のバージョンに適用しています。

PDACおよび膵臓細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミング

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

がんの進行を研究するためのiPS細胞リプログラミングの使用を容易にするために、膵臓がん細胞をリプログラミングするための堅牢なプロトコルが確立されています。がん細胞からiPS細胞を作製することに成功した研究はごくわずかであり、がん細胞を多能性にリプログラミングすることは非常に困難であることが証明されています32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46</sup...

膵管腺がん(PDAC)は最も致命的な悪性腫瘍の1つであり、この疾患の無症候性の性質のために早期診断は依然として困難です。PDAC患者の大多数は、治療の選択肢が非常に限られている進行性転移段階で診断されます1,2。これは主に、血流に放出されたタンパク質として便利に検出できるバイオマーカーなど、初期段階の信頼できるバイオマーカーが不足しているためです。
PDACは進行の非常に早い時期に播種する可能性があり、PDACが膵臓に局在している場合、予後が良好になるとがんの早期発見につながることがわかっています3。しかし、予後が良好と診断され、外科的切除が可能となるPDAC患者の10分の1未満である。それにもかかわらず、切除可能な腫瘍を有する少数の患者は、12ヵ月以内に腫瘍が再発する傾向もあります4。
過去50年間で、外科的技術、患者ケア、および治療法において目覚ましい改善が行われました5,6。しかし、外科的に切除されたPDAC患者の5年生存率は17%にかろうじて上昇している。それにもかかわらず、これはほとんど変わらない(0.9%)未切除患者よりもまだましです4,7。化学療法は、PDACの代替療法としては他に唯一の治療法です。しかし、PDAC患者の大多数はゲムシタビン7,8などの化学療法薬に対して強い耐性を示すため、この選択肢は非常に限られています。エルロチニブなどの他の薬剤は、特定の変異を有する少数のPDAC患者にのみ利用可能であり、そのほとんどがエルロチニブ耐性を示す9。ほとんどのPDAC患者における化学療法に関連する有害な副作用は、この治療のさらに別の欠点です10。最近、有望な戦略により、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)と低分子キナーゼ阻害剤(SMKI)がPDACの治療に有効であることが示されていますが、これらの標的療法に対する持続的な反応は少数の患者に限られています11,12。全体として、PDAC特異的な早期バイオマーカーの発見は、早期診断と治療のための新しい道を開く可能性があります。
PDACは、非侵襲性膵管上皮増殖に起因する膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体病変から発症する13,14。PanINの形成はKRASなどのがん遺伝子変異によって開始されますが、PDACへの進行には追加の遺伝的およびエピジェネティックな変化が必要です。PanINがさまざまな段階を経て侵襲性PDACに進行するには、約10年かかると予測されています13、15、16、17。この時間枠は、早期PDAC診断の恩恵を受ける絶好の機会を提供します。したがって、PDACの進行を研究するために、腫瘍異種移植動物モデルとオルガノイド培養を確立するための広範な研究が行われてきました18,19,20,21。これらのモデルは、PDACの侵襲的段階を研究するのに非常に有用であるが、初期のPanIN段階からの移行ではない。したがって、早期発見バイオマーカーの発見を可能にするために、PanINステージの初期の進行を再現できる実験モデルを開発することが重要です。
4つの転写因子OCT4、SOX2、KLF4、およびc-MYC(OSKM)を使用して、体細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)にリプログラミングすると、細胞の可塑性の程度が示されました22。がん細胞の可塑性は十分に立証されており、ヒトがん細胞をiPS細胞にリプログラミングすることで、細胞を元の細胞状態にリセットし、がんの進行中に蓄積したエピジェネティックな損傷の多くを取り除くことに成功しています23,24,25,26,27,28,29.したがって、このリプログラミング戦略を使用してがん細胞の同一性を操作する可能性は、がんの治療に大きな期待が寄せられています30,31。実際、PDAC由来のiPS細胞の分化は、初期のPanINステージ32を通じてPDACの進行を再現できることを以前に示しました。PDACの初期から中期に特異的な遺伝子と経路を特定することにより、PDACの早期診断に臨床的に使用できる候補バイオマーカーが特定されました32,33。しかし、単一のiPS細胞株を用いて発見されたバイオマーカーは、PDAC患者の大多数において限られた範囲しかカバーしていないことが示された32。他のPDAC患者からiPS細胞株を作製するという課題により、より信頼性の高いバイオマーカーを発見する能力が妨げられてきました。これは、ヒト初代PDAC細胞のごく一部のみが4つの因子をすべて含み、リプログラミングに正常に応答したため、OSKM送達の不均一性を含む多くの技術的要因によるものです。ここでは、OSKMのより効率的で一貫性のあるデュアルレンチウイルス送達を使用して初代PDAC細胞をリプログラミングするための詳細なプロトコルを示します。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Pitutuitary Extract (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素 from Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン、ラットテールメルク由来のタイプI溶液</td><td>&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>完成型 K-SFM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>&nbsp;10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC処理マルチプルウェルプレート</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Corning シリンジフィルター</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>コーニング組織培養処理培養皿</td><td>メルク&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>日インペックス&nbsp;Virkonの消毒剤のVirucidalタブレット</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清(FCS)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HDトランスフェクション試薬&nbsp;</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>&nbsp;E2312</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン溶液、タイプB、2%含有H2O</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>グラスゴー ミニマム エッセンシャル メディア (GMEM)</td><td>メルク&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EGF 組換えタンパク質</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FGF-塩基性 (FGF-2/bFGF) (154 aa) 組換えタンパク質、PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>ヒト膵管上皮細胞株 (H6c7)</td><td>ケラファスト</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF フィーダー細胞&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>ケラチノサイト無血清培地 (KSFM)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトセラム代替品&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 &mu;Mシリンジフィルターユニット(滅菌)</td><td>メルク&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培地&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)&nbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地 (ATCC 修飾)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), フェノールレッド</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (二塩酸塩)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

膵管腺癌の多能性へのリプログラミング

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

転写因子を用いた人工多能性幹細胞(iPS細胞)の作製は、ほぼすべての分化細胞種から達成されており、研究や臨床応用に高い価値があることが証明されています。興味深いことに、膵管腺がん(PDAC)などのがん細胞のiPS細胞のリプログラミングは、浸潤性PDAC表現型を逆転させ、がんエピゲノムを上書きすることが示されています。PDAC由来iPS細胞の分化は、初期の膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体からのPDACの進行を再現し、PDACの進行の初期に起こる分子的および細胞的変化を明らかにすることができます。したがって、PDAC由来のiPS細胞は、早期発見診断マーカーの発見のためのPDACの初期段階をモデル化するために使用できます。これは、初期のPanIN期の信頼できるバイオマーカーがないため、通常、転移後期で診断されるPDAC患者にとって特に重要です。しかし、PDACを含むがん細胞株を多能性にリプログラミングすることは、依然として困難で労働集約的であり、異なる細胞株間で大きなばらつきがあります。ここでは、ビシストロニックレンチウイルスベクターを用いて、様々なヒトPDAC細胞株からiPS細胞を作製するための、より一貫性のあるプロトコルについて述べる。得られたiPS細胞株は安定しており、リプログラミング因子や誘導性薬物の外因性発現に依存しないことを示しています。全体として、このプロトコルは、PDAC症例のより特異的で代表的な早期バイオマーカーの発見に不可欠な、幅広いPDAC由来iPS細胞の作製を容易にします。

PDAC、BXPc3、H6C7、hFib細胞由来のiPS細胞コロニーの形態を示す代表的な画像を 図1に示します。PDAC-iPS細胞コロニーは、リプログラミング25日目に形成され始めました。より確立されたESC様形態を持つ頑健なiPS細胞コロニーが、リプログラミングの40日目に同定されました(図1)。同様に、BxPc3-iPS細胞の形成は23日目に始まり、35日目までに確立されました。H6C7-iPS細胞の形成はPDAC-iPS細胞と類似しており、45日目に確立され始めました。hFib-iPS細胞コロニーは、リプログラミングの15日目に形成され始めました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opa...

本プロトコルは、膵管腺癌(PDAC)および正常な膵管上皮細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)に再プログラミングすることを記述する。レンチウイルスの調製から安定なiPS細胞株の樹立まで、最適化された詳細な手順を段階的に提供します。

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

膵臓がん幹細胞(CSC)は、アンカレッジ非依存球体培養技術を使用してin...

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。...

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal...

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

体 SCs の可用性は再生医療の重要な疾患モデル作製と SC プロパティへの洞察力を得るために。再プログラムする実験的戦略の紹介、体外が単一の転写コアクチベーター...

・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

原発の腺房細胞分離、蛋白質の表現や活動の変調、文化、およびダウン ストリーム アプリケーションは ex の豊富有用腺房の上皮化生...

真似をして 3次元細胞培養の膵腺房の上皮化生を操作します。

膵管腺癌の患者由来オルガノイド培養は、高忠実度で上皮腫瘍細胞コンパートメントを表す急速に確立された3次元モデルであり、この致死性悪性腫瘍に対する翻訳研究を可能にする。ここでは、オルガノイドを確立し、伝播する方法を詳細に提供するとともに、これらのモデルを用いて関連する生物学的アッセイを行う方法を提供する。...

患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶ膵管腺癌細胞のiPSCへのリプログラミング手法。レンチウイルス導入により安定したiPSC株を樹立し、膵がんの進行段階移行と異質性を解析する。この方法は早期診断マーカーと治療標的の発見に貢献する。

膵管腺癌の多能性へのリプログラミング

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