Name: 膵管腺癌の多能性へのリプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶ膵管腺癌細胞のiPSCへのリプログラミング手法。レンチウイルス導入により安定したiPSC株を樹立し、膵がんの進行段階移行と異質性を解析する。この方法は早期診断マーカーと治療標的の発見に貢献する。

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A.S.とJ.K.は、Cancer Research UKとOHSUの資金提供に感謝します(CRUK-OHSUプロジェクト賞C65925 / A26986)。A.S.は、MRCキャリア開発賞(MR/N024028/1)によってサポートされています。A.A.は、キング・アブドゥルアズィーズ・シティ・フォー・サイエンス・アンド・テクノロジーの博士号奨学金(奨学金文献1078107040)によって資金提供されています。JKは、MRF新治験責任医師助成金(GCNCR1042A)およびKnight CEDAR助成金(68182-933-000、68182-939-000)によって資金提供されています。梶圭介教授には、リプログラミングベクターpSIN4-EF1a-O2SとpSIN4-CMV-K2Mを提供していただき、誠にありがとうございます。オープンアクセスの目的で、著者はクリエイティブ・コモンズ表示(CC BY)ライセンスを、この投稿から生じる著者が承認した原稿のバージョンに適用しています。

PDACおよび膵臓細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミング

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

がんの進行を研究するためのiPS細胞リプログラミングの使用を容易にするために、膵臓がん細胞をリプログラミングするための堅牢なプロトコルが確立されています。がん細胞からiPS細胞を作製することに成功した研究はごくわずかであり、がん細胞を多能性にリプログラミングすることは非常に困難であることが証明されています32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.これらの研究のほとんどは、iPS細胞株を作製するために不死化がん細胞株を使用し、初代患者由来細胞36,37,38,40,42,43,44,46を使用しませんでした36。例えば、OSKM因子のレトロウイルス導入を用いて、4つの異なる肝癌細胞株のリプログラミングが試みられたが、1つの細胞株だけが正常に再プログラムされた41。しかし、作製された肝臓がんiPS細胞株は、数回の継代後に幹細胞性が失われ、OSKMリプログラミングに対するがん細胞の高い耐性が浮き彫りになった41。以前は、OSKMのレンチウイルス送達を使用してPDAC細胞を個別に再プログラムする試みが行われていました。しかし、外因性OSKM発現に依存して1本のiPS細胞株しか作製されなかったため、完全に再プログラムされていなかった37。別の研究では、エピソームベクターを用いて、ゲノム統合を行わずにOSKM因子を送達したが、PDACから1つのiPS細胞クローンしか作製できなかった39。がん細胞のリプログラミングの成功は限られているため、がん研究におけるiPS細胞技術の使用を妨げる多くの課題が増加しています。
ここでは、2人の異なる患者と1つの確立されたPDAC細胞株(BxPc3)に由来する初代PDACサンプルからのiPS細胞の作製について説明します。さらに、iPS細胞は膵管上皮細胞株であるH6c7からも作製されています。私たちの知る限り、BxPc3とH6c7から安定なiPS細胞株の導出に成功したのはこれが初めてです。このプロトコールに続いて、健康な人から得られた初代ヒト線維芽細胞からiPS細胞を作製することにも成功し、この方法の適用範囲はがん研究にとどまりません。
プロトコルの成功の背後にある重要な要素の1つは、OS因子とKM因子を共発現するためのビシストロニックレンチウイルスベクターの使用です。これらのベクターには、一方のベクターにOCT4とSOX2を発現し、もう一方のベクターにKLF4とcMYCを発現する内部リボソーム侵入部位2(IRES2)が含まれています。各リプログラミング因子が個別に送達されたモノシストロニックベクターを用いた複数の研究は、各ベクターの取り込みが異なり、OSKMの化学量論とリプログラミング効率に影響を与えることを示している47。バイシストロニックベクターを使用すると、この問題を軽減できます。さらに、レンチウイルスベクターにIRESを用いることで、リプログラミング効率が有意に向上することが示されている48。このレンチウイルス系では、OSの発現はEF1aプロモーターによって駆動され、KMの発現はCMVプロモーターの制御下にあります。CMVプロモーターは、EF1a49,50とは異なり、DNAメチル化およびヒストンの脱アセチル化により、高効率なサイレンシングを受けることができることが知られている。したがって、再プログラミング中のOS前のKMの早期サイレンシングは、プロトコルの成功のための重要な要素である可能性があります。これは、リプログラミング51,52,53,54,55におけるOSKM発現ダイナミクスの重要性を示す以前の研究と一致しています。したがって、ビシストロニックベクトルは、すべてのOSKM因子が単一のプロモーター56から発現されるポリシストロニックベクトルよりも有利でもある。プロトコルの成功に寄与する他の要因には、レンチウイルス感染の用量と、細胞タイプごとにカスタマイズされたリプログラミングに使用される感染細胞の数が含まれます。
要約すると、初代PDAC細胞を他の細胞株および正常細胞とともに再プログラミングするための最適化された方法が提示されます。この方法は、がんの進行をモデル化し、この場合は早期のPDACバイオマーカーを発見するためのiPS細胞リプログラミングの使用を拡大するのに役立ちます。

膵管腺がん(PDAC)は最も致命的な悪性腫瘍の1つであり、この疾患の無症候性の性質のために早期診断は依然として困難です。PDAC患者の大多数は、治療の選択肢が非常に限られている進行性転移段階で診断されます1,2。これは主に、血流に放出されたタンパク質として便利に検出できるバイオマーカーなど、初期段階の信頼できるバイオマーカーが不足しているためです。
PDACは進行の非常に早い時期に播種する可能性があり、PDACが膵臓に局在している場合、予後が良好になるとがんの早期発見につながることがわかっています3。しかし、予後が良好と診断され、外科的切除が可能となるPDAC患者の10分の1未満である。それにもかかわらず、切除可能な腫瘍を有する少数の患者は、12ヵ月以内に腫瘍が再発する傾向もあります4。
過去50年間で、外科的技術、患者ケア、および治療法において目覚ましい改善が行われました5,6。しかし、外科的に切除されたPDAC患者の5年生存率は17%にかろうじて上昇している。それにもかかわらず、これはほとんど変わらない(0.9%)未切除患者よりもまだましです4,7。化学療法は、PDACの代替療法としては他に唯一の治療法です。しかし、PDAC患者の大多数はゲムシタビン7,8などの化学療法薬に対して強い耐性を示すため、この選択肢は非常に限られています。エルロチニブなどの他の薬剤は、特定の変異を有する少数のPDAC患者にのみ利用可能であり、そのほとんどがエルロチニブ耐性を示す9。ほとんどのPDAC患者における化学療法に関連する有害な副作用は、この治療のさらに別の欠点です10。最近、有望な戦略により、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)と低分子キナーゼ阻害剤(SMKI)がPDACの治療に有効であることが示されていますが、これらの標的療法に対する持続的な反応は少数の患者に限られています11,12。全体として、PDAC特異的な早期バイオマーカーの発見は、早期診断と治療のための新しい道を開く可能性があります。
PDACは、非侵襲性膵管上皮増殖に起因する膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体病変から発症する13,14。PanINの形成はKRASなどのがん遺伝子変異によって開始されますが、PDACへの進行には追加の遺伝的およびエピジェネティックな変化が必要です。PanINがさまざまな段階を経て侵襲性PDACに進行するには、約10年かかると予測されています13、15、16、17。この時間枠は、早期PDAC診断の恩恵を受ける絶好の機会を提供します。したがって、PDACの進行を研究するために、腫瘍異種移植動物モデルとオルガノイド培養を確立するための広範な研究が行われてきました18,19,20,21。これらのモデルは、PDACの侵襲的段階を研究するのに非常に有用であるが、初期のPanIN段階からの移行ではない。したがって、早期発見バイオマーカーの発見を可能にするために、PanINステージの初期の進行を再現できる実験モデルを開発することが重要です。
4つの転写因子OCT4、SOX2、KLF4、およびc-MYC(OSKM)を使用して、体細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)にリプログラミングすると、細胞の可塑性の程度が示されました22。がん細胞の可塑性は十分に立証されており、ヒトがん細胞をiPS細胞にリプログラミングすることで、細胞を元の細胞状態にリセットし、がんの進行中に蓄積したエピジェネティックな損傷の多くを取り除くことに成功しています23,24,25,26,27,28,29.したがって、このリプログラミング戦略を使用してがん細胞の同一性を操作する可能性は、がんの治療に大きな期待が寄せられています30,31。実際、PDAC由来のiPS細胞の分化は、初期のPanINステージ32を通じてPDACの進行を再現できることを以前に示しました。PDACの初期から中期に特異的な遺伝子と経路を特定することにより、PDACの早期診断に臨床的に使用できる候補バイオマーカーが特定されました32,33。しかし、単一のiPS細胞株を用いて発見されたバイオマーカーは、PDAC患者の大多数において限られた範囲しかカバーしていないことが示された32。他のPDAC患者からiPS細胞株を作製するという課題により、より信頼性の高いバイオマーカーを発見する能力が妨げられてきました。これは、ヒト初代PDAC細胞のごく一部のみが4つの因子をすべて含み、リプログラミングに正常に応答したため、OSKM送達の不均一性を含む多くの技術的要因によるものです。ここでは、OSKMのより効率的で一貫性のあるデュアルレンチウイルス送達を使用して初代PDAC細胞をリプログラミングするための詳細なプロトコルを示します。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Pitutuitary Extract (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>コレラ毒素 from Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン、ラットテールメルク由来のタイプI溶液</td><td>&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>完成型 K-SFM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>&nbsp;10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC処理マルチプルウェルプレート</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Corning シリンジフィルター</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>コーニング組織培養処理培養皿</td><td>メルク&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>日インペックス&nbsp;Virkonの消毒剤のVirucidalタブレット</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清(FCS)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HDトランスフェクション試薬&nbsp;</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>&nbsp;E2312</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン溶液、タイプB、2%含有H2O</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>グラスゴー ミニマム エッセンシャル メディア (GMEM)</td><td>メルク&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EGF 組換えタンパク質</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FGF-塩基性 (FGF-2/bFGF) (154 aa) 組換えタンパク質、PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>ヒト膵管上皮細胞株 (H6c7)</td><td>ケラファスト</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF フィーダー細胞&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>ケラチノサイト無血清培地 (KSFM)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトセラム代替品&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 &mu;Mシリンジフィルターユニット(滅菌)</td><td>メルク&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培地&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)&nbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地 (ATCC 修飾)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), フェノールレッド</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (二塩酸塩)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

膵管腺癌の多能性へのリプログラミング

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

転写因子を用いた人工多能性幹細胞(iPS細胞)の作製は、ほぼすべての分化細胞種から達成されており、研究や臨床応用に高い価値があることが証明されています。興味深いことに、膵管腺がん(PDAC)などのがん細胞のiPS細胞のリプログラミングは、浸潤性PDAC表現型を逆転させ、がんエピゲノムを上書きすることが示されています。PDAC由来iPS細胞の分化は、初期の膵臓上皮内腫瘍(PanIN)前駆体からのPDACの進行を再現し、PDACの進行の初期に起こる分子的および細胞的変化を明らかにすることができます。したがって、PDAC由来のiPS細胞は、早期発見診断マーカーの発見のためのPDACの初期段階をモデル化するために使用できます。これは、初期のPanIN期の信頼できるバイオマーカーがないため、通常、転移後期で診断されるPDAC患者にとって特に重要です。しかし、PDACを含むがん細胞株を多能性にリプログラミングすることは、依然として困難で労働集約的であり、異なる細胞株間で大きなばらつきがあります。ここでは、ビシストロニックレンチウイルスベクターを用いて、様々なヒトPDAC細胞株からiPS細胞を作製するための、より一貫性のあるプロトコルについて述べる。得られたiPS細胞株は安定しており、リプログラミング因子や誘導性薬物の外因性発現に依存しないことを示しています。全体として、このプロトコルは、PDAC症例のより特異的で代表的な早期バイオマーカーの発見に不可欠な、幅広いPDAC由来iPS細胞の作製を容易にします。

PDAC、BXPc3、H6C7、hFib細胞由来のiPS細胞コロニーの形態を示す代表的な画像を 図1に示します。PDAC-iPS細胞コロニーは、リプログラミング25日目に形成され始めました。より確立されたESC様形態を持つ頑健なiPS細胞コロニーが、リプログラミングの40日目に同定されました(図1)。同様に、BxPc3-iPS細胞の形成は23日目に始まり、35日目までに確立されました。H6C7-iPS細胞の形成はPDAC-iPS細胞と類似しており、45日目に確立され始めました。hFib-iPS細胞コロニーは、リプログラミングの15日目に形成され始めました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 図1: iPS細胞コロニーの代表画像画像は、(A)PDAC、(B)BxPc3、(C)H6c7、および(D)hFibに由来する確立されたヒトES細胞様形態を示しています。再プログラミングの日数は、各画像の上に示されています。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
クローンiPS細胞株は、PDAC、BxPc3、H6C7、およびhFib細胞の各リプログラミングから確立されました。確立されたすべてのiPS細胞株は、未分化ヒトESC細胞表面マーカーであるTRA-1-60に陽性で染色され、多能性へのリプログラミングが確認されました(図2)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg"> 図2:クローンiPS細胞株の代表画像。 画像は、(A)PDAC、(B)BxPc3、(C)H6c7、および(D)hFibから得られたもので、ESC様の形態(上段)およびTRA-1-60の陽性染色(下段)を示しています。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコルは、膵管腺癌(PDAC)および正常な膵管上皮細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)に再プログラミングすることを記述する。レンチウイルスの調製から安定なiPS細胞株の樹立まで、最適化された詳細な手順を段階的に提供します。

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