Name: マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ T4バクテリオファージと大腸菌の相互作用をマウス腸内で研究する方法。無菌マウスモデルを用いて、バクテリオファージの免疫系との関係と腸内微生物叢の動態を解明します。

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著者らは、この研究を行った土地が、xwməθkwəy̓əm(Musqueam)民族の伝統的で先祖代々の未割譲の領土であることを認めている。それが置かれている土地は、何千年もの間、この場所で世代から世代へと文化、歴史、伝統を受け継いできたマスケアムの人々にとって、常に学習の場でした。私たちは、他の人々が https://native-land.ca で生活し、働いている故郷についてもっと学ぶことを奨励しています。著者らは、カナダ自然科学工学評議会(NSERC)のカナダ大学院奨学金-修士号(N.P.)、Michael Smith Health Research BC Trainee Award(RT-2023-3174、MHへ)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)のディスカバリー助成プログラム(RGPIN-2019-04591からCT、RGPIN-2016-04282からLCO)、カナダ高等研究所/人間とマイクロバイオーム(FL-001253 Appt 3362、 CTへ)、Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award(18239、CTへ)、Canadian Institutes for Health Research(PJT-159458からLCO)、Canadian Foundation for Innovation(LCOへ34673、CTへ38277)。UBC Centre for Disease ModellingとubcFLOWはUBC GREx Biological Resilience Initiativeの支援を受けており、 Osborne研究室とTropini研究室のメンバーには、原稿の批判的な議論と評価をしてくれたことに感謝しています。 図1A と 図2A は、Biorender.com を使用して作成されました。

T4ファージを用いたマウスモデルにおける腸内ファージ-バクテリア動態の探索

著者は何も開示していません。

バクテリオファージ(ファージ)は、細菌に感染して殺すウイルスで、種と菌株レベルの特異性があります1。ファージは、腸内細菌叢などの複雑な細菌群集で重要な役割を果たしており、個体群動態の調節や細菌の適応度の向上に関与しています2。過去10年間、抗菌薬耐性病原体の台頭3と、代替治療戦略としてのファージ療法の可能性により、ファージ研究への関心が再燃しています。近年、溶解性ファージカクテルは静脈内投与され、ヒトの重篤な抗生物質耐性細菌性敗血症感染症に一定の成功を収めています3,4。経口ファージ療法は、腸の感染症や炎症を治療するための抗生物質の潜在的な代替手段としても提案されています。さらに、ファージは、早産ブタの再発性クロストリジオイデス・ディフィシル感染症(rCDI)5,6、炎症性腸疾患(IBD)7,8、壊死性腸炎の治療において、細菌を除去するためにろ過された糞便微生物叢製剤である糞便濾液移植(FFT)の成功に関与しています9.これらの結果を考えると、既存のコミュニティに新規ファージを追加すると、標的細菌だけでなくコミュニティ全体に間接的な影響を与える可能性があるため、ファージと腸内細菌叢、およびファージと哺乳類宿主の両方との相互作用を考慮することが重要です2,10。
in vitroでのファージと標的細菌との相互作用の研究は、腸内におけるファージと細菌の相互作用のメカニズムと影響を理解するのに役立つことが証明されています。この設定では、カウドビラール目の大腸菌特異的T4ファージが腸粘液に付着するために、ビリオン表面の高抗原外カプシド(Hoc)タンパク質内に位置する免疫グロブリン(Ig)様ドメインを必要とすることが示されている11。さらに、トランズウェルアッセイは、T4ファージが上皮細胞培養と相互作用し、マクロピノサイトーシスによって細胞層を通過できることが示されています12,13。これらの結果は、ファージが真核細胞に感染できないにもかかわらず、後生動物の宿主と相互作用できるという仮説を支持しています。これらのモデルは有用ではあるが、ファージ、バクテリア、および後生動物の宿主間の三者間相互作用を包括的に調査するために必要な、腸内生態系で発生する複雑な相互作用の全範囲を欠いている。
マウスモデルは、複雑な環境下でファージを調査するための重要なツールです。ファージ投与の望ましい適用は、IBDを含む慢性炎症性疾患に関連する抗菌薬耐性感染症または病原菌を治療するための代替戦略としてである。しかし、新しい文献は、in vitroでのファージの挙動がin vivoの機能を完全には表していないことを示唆しています。Buttimerら14は、ファージカクテルは、簡略化されたヒト微生物叢コンソーシアムでは標的細菌を枯渇させることができたが、同じ細菌-ファージコンソーシアムでコロニーを形成したgnotobioticマウスではin vivoで再現できなかったことを実証した。さらに、従来のマウスマイクロバイオームでは、T7ファージは標的腸内細菌の選択的枯渇を引き起こしたが、時間の経過とともに緩やかな回復が観察され、耐性が進化したことを示している15。他の研究では、経口投与されたファージとその標的細菌株がin vivoで共存していることが実証されています2,16。実際、ファージとバクテリアの共存を超えて、ファージ投与は全体的な微生物叢群集の構成と機能に広範な変化をもたらしました2,16。いくつかの研究で、細菌量の変化とは無関係に、カウドウイルス類の相対存在量の増加とIBD 7,8,17との関連が明らかになっているため、これは疾患状況に関連しています7。これが病気の病因の要因なのか結果なのかは不明のままです。
ファージ調査の歴史的焦点は、ファージとその標的細菌との関係に関するものでした。ただし、ファージと後生動物の粘膜、上皮、および免疫系との間の潜在的な相互作用を考慮することも重要です。これらの相互作用はすべて、腸管ファージ感染に対する全体的な反応において重要な役割を果たします。これを実証するために、ファージは微生物叢8による干渉なしで免疫系への影響を解明するために無菌(GF)マウスを使用して研究されています。このシステムでは、ファージ核酸は、食作用免疫細胞(マクロファージおよび樹状細胞)のエンドソーム内に位置するToll様受容体(TLR)によって検出されました。これにより、下流のシグナル伝達が活性化され、インターフェロン(IFN)-γ 8またはI型IFN18のT細胞依存性産生が刺激された。さらに、Fluckigerらは、ファージコード(プロファージ)抗原の認識にメモリーCD8+ T細胞を関与させ、その結果、T細胞が腫瘍抗原と交差反応し、腫瘍負荷が軽減されたことを示しました。最後に、ファージ特異的抗体産生は、ファージが飲料水を介して継続的に動物モデルに送達されたマウス研究で文書化されており8,20、または数ヶ月にわたって繰り返し経口強制経口投与によって20、ファージタンパク質が体液性免疫応答を促進する能力を実証しています。ファージ接種のこれらのモードは、免疫系の最適かつ継続的なプライミングを可能にしますが、ファージと腸環境との間の自然に発生する相互作用や、経口適用されたファージ療法の動態を表していない可能性があります。これまでのところ、限られた数の研究が、単一コロニー化されたマウスモデルにおけるファージと単一の細菌種との相互作用を調べた21。しかし、単コロニー化されたマウスは、消化管(GI)と免疫発達に対する個々の種の微生物特異的な影響を解読する上で重要であることが証明され22,23,24、ファージ、標的細菌、および後生動物の宿主の間の三者間相互作用を理解するのに有用であることが証明される可能性があります。
興味深いことに、腸内ファージと腸内共生細菌の相互作用、および後生動物の宿主とその中に存在するファージとの間で発生する相互作用については、まだ学ぶべきことがたくさんあります。このプロトコルはgnotobioticマウス モデルを使用して隔離されたT4バクテリオファージおよび細菌の同等、 エシェリヒ属大腸菌 (K-12、BW25113)を調査する一組のプロシージャを提供する。また、これらの標準化された手順は、増殖パラメータを目的のペアに適合させることにより、他のファージ/バクテリアダイアドを最適化するための基盤を提供します。ここで説明する方法は、(1)マウスの経口強制経口投与のためのT4ファージおよびビヒクルライセートの調製;(2) 大腸菌 モノコロニー化gnotobioticマウスへのT4ファージの経口投与;(3)マウスの糞便および組織のT4ファージレベルを経時的に監視する。
ここで紹介した代表的な結果として、精製したT4ファージライセートは、Rohwer Labが管理するファージバンクストックから増殖させました。T4ファージを伝播させるためのファージ・オン・タップ法は、このプロトコルで参照されているように、適合させた25。この方法では、3日以内に高力価のエンドトキシン低ファージストックが得られます。このアプローチを利用して、10 mLの≥ 1010プラーク形成単位(pfu)/mLのT4ファージと<0.5エンドトキシン単位(EU)/mLを日常的に収集しました。マウスへの経口投与または静脈内投与の推奨エンドトキシンレベルは、それぞれ≤ 20 EU/mLおよび≤ 5 EU/kg/h(または20 gマウスの場合は0.1 EU)であり、in vivo 接種に適したファージ調製法です。すべてのファージストックを生理食塩水マグネシウム(SM)ファージバッファー(ステップ1.1.5.1で提供)に4°Cで保存しました。 大腸菌 はLB培地で培養した。さまざまなバクテリオファージとバクテリアのペアについて、多様な培地と成長条件をこのプロトコルから適合させることができます。ファージはまた、廃水、海水、土壌および腸内容物などの環境から供給することができ、SambrookおよびRussell26に従って、対象の各ファージ−宿主対25に対する適切な増殖および増殖条件を用いて調製前に単離および精製することができる。あるいは、ファージは、市販の供給源( 材料表を参照)またはファージバンクから得ることができる。

<table><tbody><tr><td>1-オクタノール(99%)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip滅菌使い捨て真空フィルターユニット</td><td>ミリポアシグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>アガロース(低EEO/多目的/分子生物学グレード)</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>アミコン 100kDa ウルトラ15遠心濾過装置、ウルトラセル-100</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BDマイクロテーナーチューブ、SST</td><td>BDメディカル</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>バイオエクスクルーシブケージ(ISOケージ)&nbsp;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000タッチ&トレード;96ウェル高速反応モジュール</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物(白色結晶から粉末)</td>を備えたサーマルサイク<td>ラーFisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>キャップロック1.5MLチューブ100 / pk用</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>クロロホルム(防腐剤としてのエタノール/認定ACS)</td><td>フィ</td><td>ッシャーC298-500</td><td></td></tr><tr><td>銅被覆鋼ビーズ(4.5 mm)</td><td>クロスマンコーポレーション</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood &ティッシュキット (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq グリーン PCR マスターミックス (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩溶液、分子生物学用、0.5 M in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade;寒天、粉末/フレーク、フィッシャーバイオ試薬&貿易;&nbsp;</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーバイオ試薬&貿易;微生物学培地:LBブロス(粉末) - レノックス&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Green FastMix&reg; qPCR mix, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Incubated Shaker</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>微生物学媒体:LBブロス(粉末)-レノックス</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングスナップキャップ付きマイクロ遠心チューブ、2ml</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルムシーリングフィルム</td><td>ビーミス</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>ファージストックカ</td><td>ロライナバイオバイオサプライ&nbsp;</td><td></td><td>該当なし</td></tr><tr><td>PicoLab&reg;マウスダイエット20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>ピアス&トレード;発色性エンドトキシン定量キット</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNase A (17,500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Set</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(微白粉末)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(結晶性/認定ACS)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター(プローブモデルCL-18;電源モデルFB50)</td><td>フィッシャー香り&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フレキシブルフィルムアイソレーター&nbsp;</td><td>生物学的にクリーンなクラス&nbsp;</td><td></td><td>該当なし</td></tr>の<tr><td>SYBR&trade;Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 ファージプライマー、フォワード (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>T4 ファージプライマー、フォワード (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl、1M溶液、pH 8.0、分子生物学グレード、超高純度</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ22638AE</tr><tr><td>水、(DNASE、RNASEフリー)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス腸におけるt4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をin vivoで研究するためのプロトタイプモデル

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

バクテリオファージ(ファージ)は、種レベルおよび株レベルの特異性を持つ細菌に感染するウイルスであり、既知のすべての生態系で最も豊富な生物学的実体です。腸内細菌叢に見られるような細菌群集内では、ファージは微生物叢の個体群動態を調節し、細菌の進化を促進することに関与しています。過去10年間でファージ研究への関心が再燃しており、その理由の一つは、溶解性ファージの宿主特異的な殺傷能力が、抗菌薬耐性菌の脅威の高まりに対抗するための有望なツールを提供していることです。さらに、ファージが腸粘液に付着することを示す最近の研究では、ファージが下にある上皮への細菌の侵入を防ぐ保護的な役割を担っている可能性があることが示唆されています。重要なことは、細菌のマイクロバイオームと同様に、ファジョームの破壊は炎症性腸疾患などの疾患の転帰の悪化と関連していることです。これまでの研究では、ファージが糞便濾液移植によって動物やヒトのマイクロバイオームを調節し、宿主の健康に利益をもたらすことが実証されています。この最近の研究の波により、腸内細菌叢の文脈でファージを研究するためのプロトコルを確立し、標準化する必要性が生じています。 このプロトコルはマウスの胃腸管において隔離されたT4バクテリオファージおよび細菌の宿主、 大腸菌を、調査する一組のプロシージャを提供する。ここで説明する方法は、ファージライセートから開始し、それをマウスに投与し、細菌の宿主とファージレベルへの影響を評価する方法を概説します。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に修正され、加えることができ、生体内で宿主バクテリオファージの原動力を調査するための出発点を提供する 。

マウス腸内のT4ファージ/大腸菌 ダイアド間の相互作用を調べるために、T4ファージとビヒクルライセートを調製、洗浄、精製しました(図1A)。T4ファージライセートをプラークアッセイで力価測定し、SM緩衝液中で2 x 107 pfu/mL(2 x 106 pfu/マウス)に希釈した。ビヒクルライセートも力価を計上して、生存可能なファージの存在がないことを確認し、T4ファージライセートと同じ量のSMバッファーで希釈しました。エンドトキシンレベルは、発色性エンドトキシン定量キットを使用して希釈ライセートで定量しました。T4ファージ、熱不活化ファージ、およびビヒクルライセートのエンドトキシンレベルは、飲料水の許容レベル(&lt;20 EU/mL)を下回っていました25(図1B)。ビヒクルライセートはT4ファージライセートと同量のエンドトキシンを有していたため、適切なコントロールであると見なされた。熱不活性化ファージライセート(熱処理前の2 x 107 pfu/mL)は、ビヒクルおよびT4ファージライセートの両方よりもエンドトキシンが少なかった。キットの説明書に従って、1-オクタノール処理したサンプルをビヒクルライセート(スパイクビヒクル)にエンドトキシン標準試料を添加してアッセイ阻害について試験し、最終濃度を 0.5 EU/mL にしました。スパイクしたビヒクルエンドトキシンレベルからビヒクルエンドトキシンレベルを引いた値は、メーカーの推奨に従って 0.5 EU/mL±25%)でした(図 1B)。これにより、1-オクタノールの除去に成功し、アッセイの結果を妨げる可能性のあるライセートによって引き起こされるアッセイ阻害がないことが確認されました。
大腸菌 K-12(BW25113)モノコロニー化されたC57BL/6マウスを、無菌フレキシブルフィルムビニルアイソレーター内でgnotobiotic条件下で繁殖させた(図2A)。F0世代のマウスは、大腸菌を環境に加え、共同飼育することでコロニーを形成しました。出生時から垂直伝播と共飼育によって大腸菌にコロニーを形成した子孫(F1世代とF2世代)のみを実験に使用しました。この戦略は、細菌の接種に応答して発生する免疫系、粘液産生、および消化管の発達の変化を制御し22,37、したがって、ファージの導入によってのみ発生する変化の測定を可能にします。成熟後、実験マウスを無菌アイソケージに移し、そこでそれぞれ2 x 106 pfuのT4ファージまたは等量のビヒクルライセートを経口強制経口投与した。T4ファージおよび大腸菌の存在量は、糞便ペレットの収集および0.5%(軟)寒天培地または1.5%寒天培地のいずれかのスポットプレーティングアッセイによって4週間にわたってモニターされました。この実験の過程で、T4ファージと大腸菌は、どちらの集団も枯渇することなく共存することができました(図2B、C)。2 x 102および2 x 104 pfu/マウスの低用量でのT4ファージの経口投与は、2 x 106 pfuと比較して、T4ファージが腸にコロニーを形成する能力を低下させませんでした(図2D)。同様に、大腸菌レベルに対するT4接種の用量依存的な効果は観察されませんでした(図2E)。
重要なことに、サンプル間のめっきの一貫性がプラーク数にとって重要であることがわかりました。例えば、軟寒天に細菌を添加した場合、細菌の密度がアッセイの結果に大きく影響すると判断されました。1時間、1.5時間、または2時間継代培養した大腸菌を添加すると、2.8時間以上継代培養した大腸菌を添加した場合よりもプラーク数が少なくなりました。さらに、大腸菌を 2.8 時間から 16 時間 (一晩) 継代培養した場合、プラークの定量は ~1 x 109 pfu/mL で安定し、1 時間の代培養から計算した値(~2 x 108 pfu/ml)と比較して約 5 倍の増加でした(図 3A)。継代培養ではなく、一晩培養した軟寒天に標的菌を接種することができます。ここで、軟寒天に接種した16時間(一晩)の大腸菌培養液の量は、プラーク数に影響を与えました(図3B)。これらの結果は、寒天培地内の大腸菌の密度がプラークアッセイ数に影響を与える可能性があることを示しています。どちらのアプローチでも、ファージ定量の結果は同じ値(109 pfu/ml)で横ばいとなり、プラーク数の精度を確保するためには、標的細菌が軟寒天培地で十分に高密度でなければならないことが示唆された。
まとめると、これらの結果は、実験操作を行う前に、 in vitro および in vivo のパイロット実験を通じてファージ-バクテリアの動態を理解することの重要性を強調しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> 図1:ファージ溶解物の調製。 (A)高力価ファージストックからファージライセートを開始するためのワークフロー。ライセートを増殖させ、洗浄し、濃縮し、エンドトキシンを除去しました。汚染された1-オクタノールは、速度真空によって除去された。(B)エンドトキシンは、発色性エンドトキシン定量キットを使用して、ファージおよびビヒクルライセートで定量しました。青色の破線は、生成物阻害コントロールにおける生成物阻害を反証するための上限と下限を示しています(0.5 EU/mL ± 25%)。各ポイントは、2 つのテクニカル レプリケートのうちの 1 つを表します。棒の高さは、反復間の平均を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> 図2:単コロニー化マウスの作製と糞便ペレット中のファージおよび細菌レベルのモニタリング。 (A)単一細菌種を有する無菌マウスのコロニー形成とF1およびF2単菌マウスの作製ワークフロー。(B-E)大腸菌で単コロニー化されて生まれ、6〜8週齢でT4ファージを接種したC57BL / 6マウスの糞便ペレットで検出されたT4ファージと大腸菌のレベル。0日目(コロニー形成前)およびコロニー形成後指示された日数で、T4ファージレベルをスポットプレーティングおよびプラークアッセイにより、単寒天培地法を用いて測定した。大腸菌レベルは、1.5%LB寒天培地にスポットメッキして測定しました。(B、C)2 x 106 pfuのT4ファージまたはビヒクルライセート(容量およびエンドトキシンレベルで正規化)を接種した後の回収された糞便ペレット中の(B)T4ファージおよび(C)大腸菌レベルの動態。(D、E)(D)T4ファージの2 x 102 pfu、2 x 104 pfuまたは2 x 106 pfuの接種後の回収糞便ペレット中のT4ファージおよび(E)大腸菌レベル。エラーバーは、平均と平均の標準誤差(SEM)を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> 図3:プラークアッセイにおけるトラブルシューティングの精度。 (A)軟寒天培地(0.5%寒天培地、LB)用の大腸菌の一晩培養または継代培養を使用したT4ファージライセート力価。継代培養は、一晩で大腸菌培養液を1:50に希釈して新鮮なLBに入れ、5 mLの軟寒天培地に100 μLの大腸菌と20 μLのT4ファージを接種しました。CaCl2 と MgSO4 は、これらの試験では軟寒天培地に添加していませんが、必要に応じて添加できます。大腸菌の継代培養時間が2.8時間未満では、見かけのファージ力価が低くなりました。(B)軟寒天培地における異なる大腸菌密度を用いたT4ファージライセート力価。一晩培養した大腸菌(Aのように継代培養ではない)の異なる量の大腸菌を軟寒天培地に添加すると、異なる見かけのファージ力価が得られました。エラーバーは、計算されたファージ力価の不確かさを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ(ファージ)は、腸内細菌叢の不可欠な構成要素です。これらの共生生物は細菌の適応度と個体群動態を促進しますが、腸の恒常性や疾患にどのような影響を与えるかについてはほとんどわかっていません。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に適応可能なマウス モデル内の隔離されたT4バクテリオファージを調査する。

マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

私たちの研究は、バクテリオファージ、バクテリア、哺乳類の免疫系との間の三者相互作用を、腸、gnotobioticマウス腸の文脈で理解することを目的としています。私たちは、腸内細菌叢の重要性をよりよく理解するために、健康状態や病気の条件下でのこれらの相互作用についての洞察を得ることを望んでいます。最近の開発により、バクテリオファージは哺乳類の免疫系によって検出されることがわかっています。ヒト腸管ファゲオームは、炎症性腸疾患などの病態において調節不全である可能性があり、ファージによる免疫刺激が疾患の表現型を悪化させる可能性があることが示唆されています。私たちの目標は、gnotobioticマウスモデルでの接種および計数のためのT4ファージライセートを産生するための標準化されたプロトコルを他の人に提供することです。これらのプロトコルは、他のバクテリオファージ細菌ペアで使用するために構築および変更することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

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全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em&gt;バークホルデリア</em&gt;種

ここでは、手順は、 大腸菌 K1の培養新生児ラットにおける全身性感染の確立のために記載されている。この非侵襲的手順は、脈絡叢での胃腸管のコロニー形成、全身循環への病原体の転座、および中枢神経系への侵入を可能にする。...

神経病原の非侵襲的モデルエシェリヒア·コリ新生ラットにおける感染

現在の研究は、ウマのFcεRIα遺伝子を持つラット好塩基性白血病細胞のトランスフェクションに基づく遺伝子操作アッセイシステムの開発と応用を説明しています。トランスフェクションされた細胞は、アレルギー反応のメディエーターの放出がIgEと抗原によって活性化される機能的な受容体を発現します。...

開発 in vitroでモデル系エクウス caballusのIgE

学ぶ T4バクテリオファージと大腸菌の相互作用をマウス腸内で研究する方法。無菌マウスモデルを用いて、バクテリオファージの免疫系との関係と腸内微生物叢の動態を解明します。

マウス腸におけるT4バクテリオファージと大腸菌の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

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マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

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