経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録
2023年9月29日
このプロトコルは脳の血液関門の信頼できる、有効な 生体外 モデルを記述する。この方法では、マウスの脳血管内皮細胞bEnd.3を使用し、膜貫通電気抵抗を測定します。
現在の研究では、通常、透過性試験と関連するタンパク質発現を使用して、TEER検出の精度を検証しています。単層細胞のBBBモデルは、薬物スクリーニングにはあまり効果がなく、より多くの細胞を使用すると、モデルの構築が難しくなります。この研究のプロトコルは、非侵襲的な手順により、TEER検出後に細胞サンプルを他の実験で使用できるため、比較的簡単です。
細胞モデルの透過性を評価するためのTEERの検出は、中枢神経系の治療と予防のための薬物のスクリーニングを加速し、新薬開発の成功率を高めることができます。将来的には、胸壁の上部コンパートメント細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を検出し、TEERテスト結果がBBBバリア機能の完全性を効果的に表すことができることを確認します。
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概要
本研究では、マウス脳血管内皮細胞（bEnd.3）を用いた、信頼性の高い血液脳関門（BBB）のin vitroモデルを提示します。このモデルでは、経上皮電気抵抗（TER）を測定してBBBの完全性を評価し、中枢神経系治療薬のスクリーニングを促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- 薬理学
背景
- 血液脳関門は、中枢神経系の恒常性を維持するために極めて重要です。
- 従来のin vitroモデルは、細胞の複雑性の制限があるため、薬物試験における有効性が低くなっています。
- 本研究では、より簡便で非侵襲的な手法を提示することで、これらの制限に対処します。
研究の目的
- TER測定による血液脳関門（BBB）の完全性評価を改善する。
- 中枢神経系疾患を標的とする薬剤のスクリーニングを効率化する。
- TER値とタイトジャンクションタンパク質発現の相関性を検証する。
使用された手法
- 本研究ではbEnd.3細胞培養を使用し、96ウェルプレート形式で播種および培養した。
- 主要な介入として、細胞生存率およびバリア機能の完全性を評価するために塩化コバルトを添加した。
- BBBモデルの形成と安定性を判断するため、TEER値を経時的に記録した。
- 対照群と処理群を比較するために統計解析を用いた。
主な結果
- 塩化コバルトによる処理後、TEER値が著しく低下したことから、BBBの完全性が損なわれたことが示されました。
- 本研究により、BBBに対する薬剤の影響を評価するための信頼性の高い手法として、TERを利用できる可能性が示されました。
- 5日目までに細胞バリアの安定性に達しており、本手法の有効性が強調されました。
結論
- 本研究は、創薬におけるBBBの整合性を評価するための、簡便かつ効果的なアプローチを提示しています。
- 得られた結果は、中枢神経系疾患に対する治療的介入の理解を深める可能性があります。
- 概説した手法は、薬理学的研究におけるより広範な応用に適応させることが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
bEnd.3単層モデルにおける経上皮電気抵抗（TEER）測定は、血液脳関門（BBB）の完全性を定量的かつ非侵襲的に読み取ることができ、中枢神経系（CNS）治療薬の初期段階における創薬を直接的に支援します。この手法により、バリアの破壊と回復を迅速に評価することが可能となり、神経治療ポートフォリオにおけるターゲットの検証やメカニズム面でのリスク低減に寄与します。TEERベースのBBBモデルを統合することで、発見生物学と前臨床評価の接点における予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 制御された条件下で、血液脳関門（BBB）の機能的完全性を直接的に検証することが可能になります。
- 低酸素状態や薬理学的刺激によるバリア破壊を定量化することで、メカニズム的なリスク軽減を支援します。
- バリア特性に影響を与える中枢神経系（CNS）候補薬の機能的ターゲット妥当性確認を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- バリア機能の定量的評価のための、再現性と拡張性のあるプラットフォームを提供します。
- BBBの完全性に対する化合物の影響を相互比較するためのアッセイ条件を標準化します。
- 反復的なスクリーニングワークフローに適した、リアルタイムで非破壊的な読み取り結果を提供します。
翻訳および前臨床研究
- in vitroのバリア整合性測定を、CNSプログラムにおけるトランスレーショナルなバイオマーカー戦略と整合させます。
- 探索段階のメカニズム研究から、BBB調節剤の前臨床検証までの連続性を確保します。
- CNS曝露に関連する機能的アウトカムを定量化することで、リスク調整後の進展決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
TEERベースのBBBモデルは、CNS標的アセットの初期探索、リード化合物同定、および前臨床評価の交差点に位置しています。
- 探索生物学：BBB（血液脳関門）の調節および損傷メカニズムに関する仮説を検証するために、バリア機能を定量化します。
- スクリーニング：化合物の選別および優先順位付けのための、標準化された定量的な出力データを提供します。
- 分析：実験条件やタイムポイント間での電気抵抗値の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでのバリア完全性データと、in vivoでの曝露およびバイオマーカー戦略を橋渡しします。
- 企業での再利用：継続的な中枢神経系（CNS）薬物探索キャンペーンに利用可能な、非破壊的な再利用可能アッセイプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： BBB標的メカニズムにおける予測の信頼性を高め、生物学的な曖昧さを低減します。
- 運用の価値： アッセイのセットアップを効率化し、再現性を向上させ、ハイスループットへの適応を可能にします。
- 戦略的価値： CNSポートフォリオにおけるgo/no-go判断および資本配分を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 機能的なBBBの結果に基づいた、リスク調整後のアセットの優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- 血管内皮細胞の培養およびTEER測定装置に関する専門知識が必要です。
- 信頼性の高い出力を得るために、電圧計および電極システムの校正とメンテナンスが不可欠です。
- チーム間での再現性を確保するため、標準化されたプロトコルの活用が有効です。
- さまざまなCNS関連細胞種や、低酸素負荷または薬理学的負荷への適応が可能です。
- 単層モデルであるため、複雑なin vivoのBBB構造と比較して単純であるという限界があります。
バイオファーマ よくある質問
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:17
Culture of bEnd·3 Cells and Cell Viability After CoCl2 Treatment
3:47
In Vitro Blood‐Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER
7:24
Barrier Destruction and Statistical Analysis After TEER Measurement in an In Vitro Blood‐Brain Barrier Model
