Name: がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶインピーダンスベースバイオセンサーを用いた脳内皮バリア完全性の測定法。がん細胞とサイトカイン応答によるバリア抵抗変化をリアルタイムで評価し、転移性がんの血脳関門破壊メカニズムを解明する。

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Akshata Anchanは、Gillespie Scholarship(助成金参照:1628-GS)およびFirst Fellowship(助成金参照:2021 FFE)のために、ニュージーランド神経学財団から資金提供を受けました。研究費の一部は、Neurological Foundation Fellowship-2021 FFEとオークランド大学教員研究開発基金によっても資金提供されました。ジェームズ・ハックルズビーは、オークランド医学研究財団からの奨学金によって資金提供されました。BaguleyチームとAuckland Cancer Society Research Centreの患者由来のニュージーランドメラノーマNZM細胞株に感謝します。

1. ECIS を使用して、さまざまな治療に応じた脳内皮バリアの完全性の変化を監視する
<ol><li>ソフトウェア、アレイ・ステーション、マシンのセットアップ<ol><li>96ウェルアレイステーションをマシンに接続します。アレイステーションをビニール袋に入れ、アッセイの少なくとも1時間前にインキュベーターに入れてウォームアップさせます。実験の直前にビニール袋を取り出してください。</li>
		<li>準備ができたら、マシンの電源を入れ、コンピューター上で対応するソフトウェアを開きます。「データの収集」タブの下にある「設定」ボタンを押します。ソフトウェアは接続チェックを完了し、接続されているアダプターのタイプ(例:96ウェルアレイステーション)を検出し、図のプレートマップに赤いウェルを表示します。これは、ソフトウェアがアダプターを検出したが、プレートが取り付けられたことを検出できないことを示しています。これで、システムは96ウェルプレートの準備が整いました。</li>
	</ol></li>
	<li>96ウェルバイオセンサープレートの準備 注:96ウェルプレートの配置が使用されます。各ウェルの基部は、金メッキ電極の指を間立ててパターン化されています。プレートは滅菌パックに入っており、滅菌フード/生物学的安全キャビネットでのみ開封する必要があります。金電極は、電極容量を維持するために、まず10 mMシステインを添加して化学的に安定化させる必要があります。<ol><li>10 mMシステインを滅菌トラフで調製し、マルチチャンネルを使用して、各ウェルに100 μLを慎重にピペットで注入します。システインを室温で15分間インキュベートした後、電極を傷つけないようにウェルの端のみでピペッティングしながら慎重に吸引します。同じピペッティング技術を使用して、滅菌脱イオン水(PBSではない)でシステインを少なくとも2回洗い流します。 注:プレート電極は、製造元のプロトコルに詳述されているように、システインコーティングを使用する代わりに、ECIS装置上の温かい媒体を使用して電気的に安定化することもできます。</li>
		<li>ウェルの底の基底膜として機能するECM基質を準備します。 注:コラーゲンやラミニンなどのECM基質は、脳内皮細胞株の要件に応じて選択できます。ここでは、ヒト脳微小血管内皮細胞株(hCMVEC)にコラーゲンを使用します。</li>
		<li>0.02 M酢酸に溶解した1 μg/cm2 ラットテールコラーゲンIを新鮮な滅菌トラフ(1ウェルあたり100 μL)で調製します。コラーゲンを無菌フード内の暗い場所で1時間放置し、脱イオン水と慎重なピペッティングで2回慎重に洗浄します。 注意: 最後の洗浄後、脱イオン水ができるだけ注意深く除去されていることを確認し、プレートをフード内で乾かします。コーティング後すぐにプレートを使用することをお勧めします。ただし、一時的に4°Cの水に保存できます(1週間未満)。これでプレートを使用する準備が整いました。</li>
	</ol></li>
	<li>96ウェルバイオセンサープレートへの播種のための脳内皮細胞の準備 注:最初に、使用する内皮細胞株の成長段階と播種密度を最適化することをお勧めします。このプロトコルでは、hCMVECラインを使用し、96ウェルプレートにウェルあたり20,000細胞を播種した後、コンフルエントに達するまでに48時間かかります。<ol><li>穏やかな解離試薬を使用して無菌フードで脳内皮細胞を採取し、正確な細胞数を行います。ウェルあたり100 μLの培地に20,000 hCMVECを使用して、48時間安定した成長フェーズを実現します。96ウェルすべての最適なピペッティングを確保するために、過剰な脳内皮細胞を調製します。 注:したがって、96ウェルプレートの場合、10 mLの予熱培地に約2,000,000個の細胞が必要です。</li>
		<li>脳内皮細胞を新鮮な滅菌トラフに移し、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり100μL(20,000細胞)の細胞懸濁液を慎重に加えます。細胞を定期的にトラフに穏やかに再懸濁して、内皮細胞が時間の経過とともに沈降しないようにします。1つのウェルに培地のみがあり、数学的モデリングを可能にするセルがない(セルフリーウェル)こと、およびプレート全体が30秒以内に播種されていることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>実験の開始<ol><li>プレートアダプターの両側にある赤いクリップを外側に動かして、プレートをインキュベーター内のアダプターに慎重に取り付けます。プレートのA1ウェルをアダプターのA1領域に合わせます。片方の手を上にしてプレートを所定の位置にそっと保持し、もう一方の手で赤いクリップを所定の位置に戻します。 注意: プレートがアダプター内で安定していることを確認してください。</li>
		<li>インキュベーターを閉じて、もう一度 セットアップ を押します。プレートマップで、正しく検出されたウェルを示す緑色のウェルを探します。赤で表示されているウェルには接続エラーがあります。これを修正するには、プレートをすばやく取り付け直します。 注:接続が不十分なウェルの修理に過度の時間を費やすと、細胞の健康が損なわれる可能性があります。</li>
		<li>[Check]を押して、アタッチメントを絶対インピーダンスの読み出しとして再チェックします。これには数分かかります。</li>
		<li>プレートマップの下の 矢印 を押して、正しいプレートカタログが選択されていることを確認します。この場合は 96w20idf です。</li>
		<li>マルチ周波数ボタンを押すと、インピーダンスが複数のAC周波数で測定され、将来の数学的モデリングが可能になります。</li>
		<li>[開始] を押して実験を開始します。細胞を~48時間増殖させ、オームの増加で測定される高抵抗の典型的な単層を形成します。</li>
	</ol></li>
	<li>脳内皮細胞をがん細胞またはサイトカインで96ウェルプレートで処理 注:96ウェルプレートでは複数の刺激を同時にテストできるため、目的の治療オプション(補足図S1-bottom)。各治療は実施でき、実施する必要があります せめて 統計分析を可能にするためのトリプリケート(3つの複製井戸)。ただし、4 つの反復が 補足図S1.<ol><li>48時間後、脳内皮細胞の成長を確認します。治療液を調製する前に、プラトーに達していることを確認してください。 注:内皮細胞株が異なれば、プラトーに到達するのにかかる時間も異なる場合があります。したがって、この実験を行う前に、それらの成長段階と播種密度を最適化する必要があります。井戸は通常、同じ時間内に横ばいになるはずです。そうでない場合は、妥協または不正確にピペッティングされる可能性があるため、含めることはできません。</li>
		<li>サイトカインによる治療では、予熱した完全培地に適切な濃度のサイトカインを、関連するビヒクルおよび培地コントロールと共に調製します。<ol><li>サイトカインは、脳内皮細胞を含む各ウェルに添加すると1:1に希釈されるため、最終的な所望濃度の2倍で調製します。</li>
			<li>各処理を3回に分けて行えるようにするには、全容量300 μL以上(つまり、合計350 μL以上)のすべてのサイトカインを調製し、ウェルあたり100 μLの治療を追加します。</li>
		</ol></li>
		<li>細胞による治療では、細胞(このプロトコルで使用した3つの異なる患者由来の黒色腫細胞株)を穏やかな解離試薬で回収し、正確な細胞数を計数します。治療細胞がエフェクター細胞(例:メラノーマ細胞)で、脳内皮細胞がターゲット細胞である1:1のトップエフェクター:ターゲット比(E:T比)で細胞ベースの治療を行います。つまり、ウェルあたり20,000個の脳内皮細胞に20,000個のメラノーマ細胞を追加します。<ol><li>必要に応じて、1:10または1:100の小さなE:T比で連続希釈します。トリプリケートウェルでの処理を可能にするには、細胞をカウントし、ウェルあたり100 μLの治療添加のために、総容量300 μLを超える(つまり、合計350 μL以上)で細胞を調製します。</li>
		</ol></li>
		<li>96ウェルプレートマップ(補足図S1-Top)に従って、8チューブストリップ形式(つまり、1 mLストリップチューブ)の1.1 mLポリプロピレンクラスターチューブをラベル付けします。ストリップチューブをストリップチューブプレートに挿入し、実験前にオートクレーブします。治療用サイトカインまたは細胞の総量(すなわち、350 μLの治療用)を滅菌ストリップチューブに加え、インキュベーターに入れて保温します。</li>
		<li>ソフトウェアで [一時停止 ] を押して実験を一時停止します。この処理が完了するまでに数秒かかる場合があります。一時停止したら、インキュベーターを開き、片方の手で両方の赤いクリップを慎重に外し、もう一方の手でプレートを安定させます。実験を一時停止し、プレートを滅菌フードに持っていきます。</li>
		<li>インキュベーターからトリートメントストリップチューブを取り外します。マルチチャンネルピペットを使用して、処理ストリップチューブの内容物を慎重に再懸濁し、ストリップチューブから100 μLの処理をウェルの底に触れずに96ウェルプレート上の正しいウェルに加えます。すべてのウェルと培地に慎重に処理を加え、セルフリーウェルのみに処理を加え、このステップを5分以内に完了して完全な96ウェルプレートにします。これは、過度の冷却が内皮単分子膜の耐性に影響を与えるためです。</li>
		<li>処理したプレートを本機に戻し、前回と同様に取り付けてから、セットアップ|チェック。</li>
		<li>正しいプレートカタログと多周波アクイジション設定が選択されていることを確認し、[ Resume] を押して実験を再開します。実験を進行させ、目的のエンドポイントまで実行します。</li>
		<li>Finishを押して実験を完了すると、記録されたabp.ファイルが自動的に保存されます。[ファイル] |[データのエクスポート] をクリックして、このファイルを xls として取得します。または csv。さらなる分析のためのファイル。</li>
	</ol></li>
</ol>2. cellZscopeを使用して、さまざまな治療に応答した脳内皮バリアの完全性の変化をモニタリングする
<ol><li>装置の金属部品、アダプター、多孔質膜インサートの準備<ol><li>脱イオン水、70%エタノール、再度脱イオン水で金属部品を順次洗浄します。</li>
		<li>下部電極または「ポット」と上部浸漬電極をオートクレーブし、セルモジュールの他のすべてのコンポーネントを70%エタノールで滅菌します。</li>
		<li>滅菌フードに、24個の下部電極/「ポット」をすべてセルモジュールにねじ込んで取り付け、全体を通して無菌性を維持するように注意してください。</li>
		<li>900 μLのベース培地をウェルに加えます。 注:ベース培地は、内皮の基底コンパートメントとして機能するボトムウェルに追加されます。脳内皮の基礎環境をより確実に再現するために、このコンパートメントで血清を使用しないことをお勧めします。.</li>
		<li>浸漬電極をセルモジュールの蓋に磁気的に接続し、ウェルの上の蓋を閉じて、浸漬電極が下部の電極ポットに挿入されるようにします。</li>
		<li>セルモジュールをインキュベーター内のアダプターに取り付け、平衡化するために少なくとも1時間放置します。この段階で、ソフトウェアを開いて Layout タブで実験プレートマップをロードし、処理プレートマップをファイルに埋め込み、最終的にデータを含めます。</li>
		<li>コーティングが必要な場合は、滅菌24ウェル培養プレートを使用してインサートを保持し、ECM基質(例えば、コラーゲン)をウェルの内側セクションに追加することにより、滅菌フードにメンブレンインサートをコーティングします。セクション1.2.3で詳述されているように、シングルチャネルピペットを使用してECM基質を各ウェルに慎重にロードします。</li>
	</ol></li>
	<li>脳内皮細胞をメンブレンインサートに播種するための準備と実験の開始<ol><li>セクション 1.3 に従って脳内皮細胞を採取してカウントしますが、最終的に必要な細胞滴定を 50 mL の遠心チューブで準備します。採取した細胞が、必要なすべての成長因子と血清を含む温かい完全な培地にあることを確認してください。</li>
		<li>シングルチャンネルピペットを使用して、脳内皮細胞(このプロトコルでは80,000個)をウェルインサートの頂端チャンバーに350 μLの完全培地に慎重に播種します。</li>
		<li>セルフリーウェルは、完全な培地をインサートの1つだけにピペットで移します。</li>
		<li>セルモジュールをインキュベーターから取り出し、滅菌フードに入れます。準備したインサートをピンセットを使用して下部電極ポットに移し、インサートの上部サポートのみを処理します。メンブレンの下に気泡が入らないようにしてください。</li>
		<li>セルモジュールをアダプターの上のインキュベーターに戻します。</li>
		<li>ソフトウェアの 「Experiment 」タブの 「Spectrum 」セクションで、「 Start at 1 Hz 」と「 Stop at 100 kHz 」を選択して、全周波数範囲のデータを集録します。 [細かい ステップ] を選択します。</li>
		<li>[待機時間] で [15 分] を選択すると、ソフトウェアによって最も速い速度で連続測定が許可されます。</li>
		<li>[開始]を押して実験を開始し、脳内皮細胞が増殖して高抵抗の単層を形成するのを待ちます。このステップには約 48 時間かかります。</li>
	</ol></li>
	<li>脳内皮細胞をがん細胞とメンブレンインサート上のサイトカインで処理する<ol><li>48時間後、セクション1.5に従って治療サイトカインまたは細胞(例:.、黒色腫細胞)を準備し、該当する場合は細胞カウントを行い、1 mLストリップチューブまたは同等物に収集します。.</li>
		<li>各ウェルに70μLを添加するための正しい濃度で処理を準備します(インサート)。インキュベーターに治療薬を入れて保温します。</li>
		<li>本明細書の装置は15分ごとに測定を行うため、測定が完了した直後に開始する処理時間を選択してください。このとき、セルモジュールをインキュベーターから取り外し、糸くずの出ないワイプを使用して70%エタノールで優しく拭きます。</li>
		<li>滅菌フードでセルモジュールを開き、治療薬70μLをそれぞれのインサートのアピカルチャンバーに慎重にピペットで移します。これを行うには、シングルチャンネルピペットを使用して、気泡を避けて円を描くように追加します。この手順を 10 分以内に完了して、次の測定を開始する前にセル モジュールをアダプターに戻します。</li>
		<li>[停止] を押して実験を終了します。データを直接xlsにエクスポートします。ファイルの下のファイル |[エクスポート]タブ。このファイルを開いた後、適切な名前を付けて保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>

脳内皮バリア強度の調査におけるインピーダンスベースのバイオセンサー

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

BBBに影響を与える疾患の治療研究では、脳内皮バリアの完全性と調節の重要性を考慮する必要があります。例えば、脳内皮関門の破壊は、他の解剖学的部位から脳へのがんの転移において批判的に研究されています。これは、脳内皮が循環腫瘍細胞に対する最初のバリアを形成するためです。冒頭で述べたように、内皮バリアの完全性に関する in vitro 研究は、再現性があり、非侵襲的で、ラベルフリーで、定量的で、 in vivo の環境にできるだけ近づく必要があります。この記事では、脳内皮バリアの完全性を評価するための2つの主要なバイオセンサーの使用について説明します。私たちは、最適で再現性のある結果を生み出すために、プロトコールの主なステップと変更を強調しています。
ECISを使用して生成されたデータの再現性の向上
プロトコルの重要なステップ プロトコールの最初の重要なステップは、適切なプレートの取り扱いを確保することです。図2A<...

この記事では、微小血管細胞の評価における現在の傾向について説明します。具体的には、脳微小血管内皮細胞のバリア特性を測定するための2つの市販のプラットフォームの使用について詳しく説明します。内皮細胞は血液に面した細胞で、血管壁の内側を覆っています。しかし、脳微小血管は、保護血液脳関門(BBB)1,2,3の形成を助けるという点で独特です。BBBは、血液から脳への分子の輸送を調節する働きをします。中枢神経系 (CNS) に影響を与える末梢疾患は、一般的に BBB の機能不全に関連しています 4,5。BBBを形成する解剖学的構造は、体の他の場所にある血液-組織界面には存在しません6。これらの解剖学的構造は、脳内皮細胞の近くに位置する周皮細胞を含み、それらの増殖と透過性を調節します。星状細胞の足のプロセスは、栄養素のシャッフルと解剖学的サポートに関与しています7,8;脳内に常在するマクロファージであるミクログリアは、神経炎症や虚血に関与することが多い9,10,11,12、および開窓なしで密に接着した細胞の単層を形成する脳内皮13,14に関与しています。.脳内皮は通常、「脳内皮バリア」として知られており、5つの異なる方法で構造的および機能的バリアを形成します。まず、傍細胞バリアコンポーネントは、細胞間外側の接合部での接着によって形成されます。第二に、細胞内バリアコンポーネントは、エンドサイトーシスを調節することによって維持されます。第三に、特殊な基底膜が、主にコラーゲン15,16で構成される豊富な細胞外マトリックスを介して内皮を固定し、支持します。最後の2つのメカニズムは、それぞれ薬物の代謝と高分子の取り込みを調節するのに役立つ酵素とトランスポーターによるものです17。
傍細胞相互作用は、脳内皮バリアの主要な構成要素を形成し、膜タンパク質のクローディン、オクルージン、および接合接着分子(JAM)を含むタイトジャンクション(TJ)によって促進されます18。膜タンパク質の強力なホモタイプ結合が最初の構造的障壁を形成するが、JAMは付属タンパク質の閉塞性帯にも結合し、したがってTJをアクチン細胞骨格に結合させる19,20。アクチン結合は、TJを内皮21の頂端領域に配置し、内皮細胞を機能的に分極させて、この頂端側または「血液に面する」側に構造的障壁を形成する。内皮の基底外側領域では、高度に特殊化された接着結合(AJ)が細胞形態の維持に調節役割を果たしています。AJはカルシウム依存性カドヘリンを含み、カテニンファミリー複合体20,22を介して隣接する内皮細胞の細胞骨格をリンクします。血管内皮カドヘリン(VE-Cadherin)は、そのようなカドヘリンの1つであり、TJタンパク質の発現および全体的な内皮バリア機能を調節して、内皮単層の完全性を維持します23,24,25,26,27。腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)などの炎症性モジュレーターは、細胞結合部から離れてVEカドヘリンの内在化をシグナルで送り、内皮バリアの不安定化をもたらす28,29,30。血小板内皮細胞接着分子(PECAM)31は、内皮接合部32,33を安定化およびリモデリングする別のAJカドヘリンである。これらの接合タンパク質の密度は、内皮細胞間の傍細胞空間を通る電子の流れを制限します。この属性は、脳内皮のようなコンフルエントセル単層全体の内皮バリア強度または経内皮電気抵抗(TER)を測定するために使用されます。
治療研究は、血液と脳のインターフェースでの重要な役割のために、脳内皮に焦点を当てています。多発性硬化症、脳卒中、神経変性疾患、癌などの神経炎症状態を含むいくつかの疾患が脳内皮に悪影響を及ぼします34,35,36,37。脳内皮バリアが破壊されると、脳は血液中の有害な刺激に効果的にさらされるため、疾患の進行は著しく悪化する38。炎症性メディエーターと転移性黒色腫細胞が脳内皮バリアを破壊することを以前に示しました 内皮バリア強度39,40,41を測定する2つの技術を使用して。
Electric cell-substrate impedance Sensing(ECIS)は、内皮細胞バリアの完全性をラベルフリーで リアルタイム に評価できるインピーダンスベースのバイオセンサーです。ここでは、アッセイウェルは金メッキ電極で裏打ちされており、これによりアッセイシステムに交流(AC)が導入されます。これらのウェルには脳内皮細胞が播種されるため、細胞を通じてACを印加することができます。(図1A-ウェル;側面図)。これにより、インピーダンスの計算に使用される電気回路が確立されます(図1A-回路図)。インピーダンスは、脳内皮細胞がプレートに付着し、傍細胞接合部を形成し始めると増加します。インピーダンスは、内皮細胞がコンフルエントになり、単層を形成し、電流の流れを制限すると横ばいになります。異なる周波数でのACの印加は、内皮細胞を通る電流の流れ経路に影響を与えます。より高い周波数(>104 Hz)で印加すると、電流は内皮細胞体を流れます。これにより、細胞の付着と拡散を評価するために使用される細胞単分子膜の静電容量に関する情報が得られます。低周波数(10、2-10、4 Hz)では、膜インピーダンスが高くなり、セル を流れる 電流が制限されます。この場合、電流の大部分はセル 間 を移動します。約4,000Hzでは、電流の流れに対する抵抗は、主に 細胞間 空間を介した内皮細胞間接合に起因します。したがって、この周波数での抵抗の変化は、内皮バリアの完全性に関する情報を提供します。
生のインピーダンス測定ではバリア特性に関する洞察を得ることができますが、ECISソフトウェアは、複数のAC周波数で測定された総抵抗を数学的にモデル化し、より正確には、バリアインテグリティの2つの主要なパラメータに分離することができます。これらのパラメータは、隣接する細胞の側方膜間の傍細胞抵抗性(抵抗β-Rb;傍細胞バリア; 図1A-緑の矢印)、および基底細胞層と電極との間の基底側抵抗(抵抗α-アルファ;基底側バリア; 図1A-青い矢印)。3 番目にモデル化されるパラメーターは、細胞膜の静電容量 (Cm; 図1A-赤い矢印)。Cm は、細胞膜組成を示す、細胞を通る電流の容量性の流れを示します。本明細書では、Rbまたは傍細胞バリアの変化は、内皮バリアの完全性を維持する上で重要なTJおよびAJの変化を示しています。Rbを確実に解釈するために、GiaeverとKeese42 によって開発され、Stolwijkらによって批判的に議論された43つの重要な仮定がなされます。これらの仮定は、ECISモデリングの有効性を確保するために重要ですが、コンフルエントな内皮単分子膜によって容易に満たされます。
ECISと同様に、cellZscopeは内皮バリア抵抗の変化の測定を可能にします。ただし、細胞は多孔質のメンブレンインサートで培養されます。このシステムでは、電気回路はメンブレンインサートの両側にある2つの電極の間にあります。内皮単層は、この膜インサートの上で培養され、経内皮電気抵抗(TER)の測定が可能になります(図1B-ウェル;側面図)。ECISと同様に、このシステムでは、総インピーダンスは、印加される電流の周波数44に応じて、いくつかのバリア成分に起因することができる。低周波数では、電極容量(C El)がシステムの総インピーダンスを支配します。あるいは、高周波では、媒体(R媒体)の抵抗が全インピーダンスを支配します。したがって、最も有用な測定値は中周波範囲(102-10 4 Hz)内にあり、内皮バリアの2つの主要コンポーネントに関する情報を提供します(図1B回路図)。まず、103-10 4 Hzでは、膜抵抗(R膜)が無視できるほど高く、電流が主にコンデンサを流れるため、セル層の静電容量(CCl)が全体のインピーダンスを支配します。したがって、CClは細胞膜を通る抵抗の変化を示します。あるいは、TERは主に102-10 3 Hzで全体のインピーダンスを付与し、電流の流れは隣接する細胞間の接合部空間を通って流され、接合タンパク質によって一緒に保持されます。したがって、これは、以前にECISのRbで見られたように、内皮バリアの傍細胞成分に関する情報を提供します。
図1Cは、黒色腫細胞による治療によって脳内皮の特定の領域がどのように破壊されるかを詳述しています。この混乱は、細胞傍空間を通る電流の流れの変化によってバイオセンサーによって検出されます(RbまたはTERとして測定)。基底外側空間(アルファとして測定);細胞膜(CMまたはCClとして測定)。この紹介で詳述した両方のバイオセンサーを使用して、サイトカインや浸潤性黒色腫細胞などのさまざまな刺激による治療後の脳内皮バリアの変化を測定しました。特定の刺激が内皮バリアを破壊すると、測定された抵抗は減少し、電流が流れるのを許す抵抗が最も少ない経路が作成されます。したがって、「バリア抵抗性」の低下は、バリアの完全性の喪失または脳内皮バリアの破壊を示唆しています。これらのアッセイでは、耐性とモデル化されたパラメーターをリアルタイムで解釈することにより、この混乱を研究しました。このような研究課題に対処するためのECISとcellZscopeの適用については、他の場所で詳しく説明しています39,41,45,46。
インビトロ 研究は、疾患を進行させる分子と機能経路を明らかにすることにより、重要な疾患メカニズムの発見を可能にします。しかし、そのためには、 in vitroでの疾患の信頼性の高い再現が必要であり、これは機能している体とは大きく異なります。理想的なシナリオでは、 in vitro 研究は、再現性があり、非侵襲的、ラベルフリー、定量的、 およびin vivoで見られる構造的影響を模倣する必要があります。この記事では、これら2つの競合する技術を使用して、治療によって誘発される脳内皮バリアの完全性の変化を測定するための方法論について詳しく説明します。その結果を組み合わせて、障壁の混乱をより包括的に把握し、克服すべき限界を共有することの利点について説明します。

<table><tbody><tr><td>aMEM</td><td>Gibco</td><td>12561072</td><td>Melanoma cell base 培地</td></tr><tr><td>cellZscope array</td><td>nanoAnalytics</td><td>cellZscope2; ソフトウェア v4.3.1</td><td>TER 測定バイオセンサーアレイ</td></tr><tr><td>コラーゲン I&mdash;ラットテール</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td>コーティング用ECM基板</td></tr><tr><td>ジブチリル-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>脳内皮培地サプリメント</td></tr><tr><td>ECIS アレイ</td><td>&nbsp;Applied Biophysics</td><td>ECIS Z&Theta;; ソフトウェア v1.2.163.0</td><td>Rb/Alpha 測定バイオセンサーアレイ</td></tr><tr><td>ECIS プレート</td><td>&nbsp;応用生物物理学</td><td>96W20idf&nbsp;</td><td>96ウェルバイオセンサープレート</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12203C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>305050-061</td><td>脳内皮培地サプリメント</td></tr><tr><td>hCMVEC</td><td>Applied Biological Materials</td><td>T0259</td><td>脳内皮細胞株</td></tr><tr><td>hEGF</td><td>PeproTech</td><td>PTAF10015100</td><td>脳内皮培地サプリメント</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3393</td><td>脳内皮培地サプリメント</td></tr><tr><td>hFGF</td><td>PeproTech</td><td>PTAF10018B50</td><td>脳内皮培地サプリメント</td></tr><tr><td>ハイドロコルチソン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>脳内皮培地サプリメント</td></tr><tr><td>IL-1&β;</td><td>PeproTech</td><td>200-01B</td><td>サイトカイン</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>メラノーマ細胞培地サプリメント</td></tr><tr><td>M199</td><td>Gibco</td><td>11150-067</td><td>脳内皮細胞ベース培地</td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td></td><td></td><td>脱イオン水</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td><td>サイトカイン</td></tr><tr><td>トランズウェルインサート</td><td>コーニング</td><td>CLS3464</td><td>多孔質膜インサート</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酵素</td><td>Gibco</td><td></td><td>12604021 解離試薬</td></tr></tbody></table>

がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定

Measuring Changes in Brain Endothelial Barrier Integrity with Two Impedance-based Biosensors in Response to Cancer Cells and Cytokines

血液脳関門(BBB)は、血液中の有害な病原体から脳実質を保護します。BBBは、周皮細胞、星状細胞性足突起、および密接に付着した内皮細胞からなる神経血管ユニットで構成されています。ここでは、脳内皮細胞が血液媒介性病原体に対する最初のバリアラインを形成しています。がんや神経炎症などの状態では、血液中の循環因子がこのバリアを破壊する可能性があります。疾患の進行は、バリアの破壊後に著しく悪化し、脳の領域へのアクセスまたは障害を可能にします。これは、特に脳のレベルで利用可能な治療オプションが限られているため、予後を著しく悪化させます。したがって、新たな研究は、血液中のこれらの有害な因子が脳内皮細胞と相互作用するのを防ぐことができる潜在的な治療法を調査することを目的としています。
市販のElectric Cell-Substrate Impedance Sensing(ECIS)およびcellZscope機器は、BBB内皮などの細胞単層全体のインピーダンスを測定して、それらのバリア強度を決定します。ここでは、さまざまな刺激が加えられたときの脳内皮バリアの完全性を評価するための両方のバイオセンサーの使用について詳しく説明します。重要なのは、複数の変数と生物学的処理の同時研究のためのハイスループット能力の重要性を強調することです。

ECIS インピーダンス データの解釈
最適な実験条件の理解 ここでは、データをソフトウェアを使用して直接表示したり(図2A)、分析やグラフプロットのためにエクスポートしたりできます(図2B)。 図2A は、実際のソフトウェアインターフェースに表示されるデータの例を示しています。左のグラフは、アレイステーションと呼ばれるアダプターへの96ウェルバイオセンサープレートの不適切な負荷による接続の中断の例を示しています。通常、電極に傷がついたり、プレートとアレイステーションの位置がずれたりすると、不適切な信号が生成されます。右の画像は、ウェルが適切に接続されている、正しくロードされたプレートからの記録を示しています。 図2A右では、0時間から30時間への抵抗の増加は...

ここでは、インピーダンスベースのバイオセンサーであるECISとcellZscopeを使用して、脳内皮バリア強度を測定する手法を示します。脳内皮の in vitro モデルにさまざまな刺激を追加する準備と技術について詳しく説明します。私たちは、調査結果を測定し、記録し、代表的な分析を行います。

The blood-brain barrier (BBB) protects the brain parenchyma against harmful pathogens in the blood. The BBB consists of the neurovascular unit, comprising ...

私たちの研究は、脳の微小血管系と血液脳関門に焦点を当てています。脳内皮細胞は、脳への分子の流れを調節します。インピーダンスベースのバイオセンサーを使用して、疾患におけるバリアの完全性を評価します。同時解析と複数の治療変数により、いくつかのがん細胞株が脳内皮を破壊することをすでに立証しています。重要なことに、これは主にプロテアーゼやサイトカインによって媒介されるのではなく、がん関連の小胞体の機能である可能性があることを立証しました。私たちは、転移性がんがどのようにして脳内皮細胞を破壊し、脳に侵入し、二次腫瘍を形成するのかを研究しています。インピーダンスベースのバイオセンサーを使用して、この相互作用を調査し、脳血管系の障害と疾患を理解します。私たちの目標は、脳内皮細胞を混乱から救うための標的を特定してブロックすることです。このプロトコルでは、5年から7年の経験から得られた、両方のインピーダンスベースの技術を使用した際の再現性と堅牢性を向上させるための変更について詳しく説明します。他の技術と比較した両システムの利点と限界については、本稿で説明しています。この技術を用いることで、脳微小血管内皮細胞のいくつかの性状を同時に、かつリアルタイムに調べることができます。私たちは、がん細胞とサイトカインが内皮バリアを破壊できることを立証しました。次に、これらの技術を使用して測定されたように、これらの接着分子または受容体をブロックすることが脳内皮バリアの保護に役立つかどうかを評価します。

measuring-changes-brain-endothelial-barrier-integrity-with-two

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

出典:Mudduluru, G., et.al. インピーダンスに基づくがん細胞の移動と浸潤のリアルタイム測定。J. Vis. Exp.

脳腫瘍細胞浸潤のインピーダンスに基づく測定

このプロトコルは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング、細胞の付着、増殖、運動性、および薬理学的および毒性刺激に対する細胞応答の定量化のための接着細胞のインピーダンススペクトルを記録し、分析する方法を検討します。内皮透過性および細胞 - 細胞および細胞 - 基質接点の評価の検出が強調される。...

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

ここでは、インピーダンス細胞分光法を利用した血液脳関門のin...

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

分子マーカーとしてγH2AX形成を用いてDNA二本鎖縞の定量化は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、放射線に対する細胞の曝露後のγH2AX病巣の定量化のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。...

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

我々のプロトコルは、ラット腹部乳腺を細かく分析し、どのように乳腺全体のマウントを準備する方法について説明します。また、3つのエンドポイント（終端蕾の数、上皮伸長と分化）を使用して、乳腺の形態を分析し、食事の修飾にさらされたラットで乳腺がんのリスクを予測するためにこれらの結果を使用する方法について説明します。...

ラットにおける乳腺の形態と乳癌リスクの変化

OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。...

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

このプロトコルは、DNA損傷だけでなく、有糸分裂時にその局在化に応答して活性化されたDNA二重鎖切断シグナル伝達タンパク質を可視化するための方法を説明します。...

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

ここでは、生きているゼブラフィッシュの胚の酸化ストレスを測定するためのプロトコルを報告します。この手順により、全胚組織と単一細胞集団の両方で活性酸素種(ROS)を検出できます。このプロトコルは、定性的分析と定量的分析の両方を実現します。...

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。...

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

学ぶインピーダンスベースバイオセンサーを用いた脳内皮バリア完全性の測定法。がん細胞とサイトカイン応答によるバリア抵抗変化をリアルタイムで評価し、転移性がんの血脳関門破壊メカニズムを解明する。

がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定

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