Name: マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 学ぶマウス卵母細胞における細胞骨格力の核への伝達と核形状・RNA動態への影響。非侵襲的イメージング法で女性配偶子の機械的特性を解析し、生殖生物学への知見を提供する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.A.J.とM.A.が共同執筆し、共著者全員が原稿にコメントしました。M. A.はCNRSと"Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J.は、Fondation des Treilles、Fonds Saint-Michel、Fondation du Collège de Franceの支援を受けています。

マウス卵子の核形状と凝縮物動態に対する細胞骨格の影響

<ol><li>Quinlan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Streaming+in+the+Drosophila+Oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Developl+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte.</a> Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).</li>
<li>Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+perspective+on+cytoplasmic+streaming%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A physical perspective on cytoplasmic streaming.</a> Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).</li>
<li>Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear positioning.</a> Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).</li>
<li>Metzger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+and+kinesin-dependent+nuclear+positioning+is+required+for+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function.</a> Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).</li>
<li>Roman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+repair+after+physiological+damage+relies+on+nuclear+migration+for+cellular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction.</a> Science. 374 (6565), 355-359 (2021).</li>
<li>Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+nucleus+positioning+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Develop+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of nucleus positioning in mouse oocytes.</a> Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).</li>
<li>Brunet, S., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+vesicle+position+and+meiotic+maturation+in+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte.</a> Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).</li>
<li>Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+markers+are+correlated+with+maturation-competence+of+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes.</a> Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).</li>
<li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+diffusion+positions+the+nucleus+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).</li>
<li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+fluctuations+of+the+nuclear+envelope+shape+the+transcriptional+dynamics+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes.</a> Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).</li>
<li>Al Jord, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+forces+functionally+reorganize+nuclear+condensates+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes.</a> Nat Commun. 13 (1), 5070(2022).</li>
<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), eaaf4382(2017).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li>
<li>Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanisms+of+gene+expression+control%3A+pre-mRNA+splicing+as+a+life+or+death+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision.</a> Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).</li>
<li>Barutcu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+nuclear+domain-associated+transcripts+reveals+speckles+and+lamina+as+hubs+of+functionally+distinct+retained+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns.</a> Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).</li>
<li>Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+stochastic%2C+motor-driven+properties+of+the+cytoplasm+using+force+spectrum+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li>
<li>Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+and+chromatin+behavior+follow+MAP+kinase+activity+but+not+MPF+activity+during+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APCcdh1+activity+in+mouse+oocytes+prevents+entry+into+the+first+meiotic+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).</li>
<li>El-Hayek, S., Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+oocyte+growth+and+development+by+intercellular+communication+within+the+follicular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche.</a> Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).</li>
<li>Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+centriole-+and+RanGTP-independent+spindle+assembly+pathway+in+meiosis+I+of+vertebrate+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes.</a> J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).</li>
<li>Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+RanGTP-regulated+gradient+in+mitotic+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells.</a> Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).</li>
<li>Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus+as+a+multiphase+liquid+condensate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleolus as a multiphase liquid condensate.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).</li>
<li>Terret, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOC1R%3A+a+MAP+kinase+substrate+that+control+microtubule+organization+of+metaphase+II+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes.</a> Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).</li>
<li>Dumont, J., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+FRET+to+study+RanGTP+gradients+in+live+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).</li>
<li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+phase+separation+in+live+cells%3A+diagnosis%2C+caveats%2C+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Develop%22%5BJournal%5D)">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li>
<li>OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li>
<li>Yi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+maintenance+of+asymmetric+meiotic+spindle+position+through+Arp2%2F3-complex-driven+cytoplasmic+streaming+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).</li>
<li>Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+interscale+wavelet+denoising+of+Poisson-corrupted+images%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Process%22%5BJournal%5D)">Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images.</a> Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).</li>
<li>Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).</li>
<li>Letort, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetort%2C+G+%22gletort%2FImageJFiles%3A+GLijplugs_v0.2.0%22">gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0</a>. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).</li>
<li>ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).</li>
<li>Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+shape+fluctuations+of+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).</li>
<li>Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+fluctuations+and+coalescence+of+nucleolar+droplets+in+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus.</a> Phys Rev Lett. 121 (14), 148101(2018).</li>
<li>Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+nuclear+shape+fluctuations+associate+with+chromatin+condensation+in+early+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase.</a> Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).</li>
<li>Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates and cancer.</a> Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

このプロトコルの主ステップは生存か正常な機能9,10,11に影響を与えることなく卵母細胞の適切なmicroinjection、また核斑点のような関連した構造の正しい視覚化を、可能にするcRNAのpredefined量のmicroinjectingを含んでいる。
細胞質動態と(核内)動態の関連性を確立することは、細胞骨格が核またはその内部をどのように攪拌するかを研究する際に不可欠です。このプロトコルは、わずかな修正で、細胞質攪拌強度を核YFP-RangoまたはSRSF2-GFP液滴ダイナミクスに相関させることによってそれを可能にします(11のように)。先に進むには、まず卵母細胞を明視野モードで120秒間撮影して細胞質の攪拌を捉え、その後すぐに491 nmレーザーで120秒間撮影して核の輪郭や液滴のダイナミクスを捉える必要があります。核SRSF2-GFP液滴の場合、相関関係は、それらの有効拡散係数(このプロトコルのステップ7を参照)を、画像相関分析(このプロトコルのステップ4を参照)を使用して得られた細胞質攪拌の逆最大強度値と比較することによって簡単に評価できます。また、液滴表面の揺らぎの解析に用いる凝縮液の大きさも重要です。サイズは表面揺らぎの強度を調節するため、バイアスを防ぐために比較分析には同様の直径の液滴を選択する必要があります。
このプロトコルにはいくつかの制限があります。核外形変動の解析は、YFP-RangoやNLS-GFPなどの完全な核内染色に依存しています。核スペックルの分析では、過剰な量のSRSF2-GFP cRNAをマイクロインジェクションすると、この凝縮液マーカーの相分離特性に明らかな変化が生じる可能性があります(図3C)。したがって、外因性タンパク質の発現プロファイルが内因性タンパク質の発現プロファイルに匹敵することを確認することが重要です。さらに、比較的小さな液滴(半径<2 μm)は、ここで定義したツールでは空間分解能に制限があるため、表面揺らぎ解析パイプラインから除外する必要があります。この分解能の問題は、通常、より解像度の高い顕微鏡を使用することで解決でき、例えば、卵母細胞核や体細胞の非常に小さな核内の小さな凝縮物の表面変動を調べるために必要になる場合があります。
全体として、このプロトコルはスケールを渡るマウス卵母細胞の核のアクチンそしてmicrotubuleの細胞骨格基づかせていた攪拌の捕獲を可能にする。具体的には、細胞骨格による細胞質の動員、核の輪郭の変動、液体のような核の斑点の変位や表面の揺らぎを記録することができます。他の細胞タイプのいくつかの研究は、個々の空間スケールでさまざまな複雑さの異なるプロトコルを介してこれらの問題のいくつかに対処していますが38,39,40、この単純なプロトコルは、単一の作業パイプラインで複数のスケールにわたる前述の細胞動態に対処するために必要なツールを初めて提供します。さらに、このアプローチから生成されたデータは、10,11のように生物物理学的モデリングで補完されると、次の低侵襲評価が可能になります:i)核力学の変化10;ii)細胞質内の細胞骨格ベースの活性力の核内の凝縮物への伝達11;iii)異なる細胞区画にわたるこの活性エネルギーの散逸10,11。重要なことに、このプロトコルは、核小体23のような他の核凝縮物だけでなく、細胞骨格と核凝縮物の両方の挙動の変化が記録された癌細胞のような他の細胞タイプにも適応する可能性があるため、用途が広い17,41。

核の位置決めは、複数の細胞および発生機能に不可欠です1,2,3,4,5。卵母細胞と名付けられた哺乳類の雌の生殖細胞は、サイズが非対称に分裂しているにもかかわらず、細胞質をリモデリングして核を細胞の中心に配置します6(図1)。この核の中心化は、マウスとヒトの卵母細胞の発生の成功を予測し7,8、したがって、それらの胚形成能を予測します(図1)。
マウス卵母細胞の細胞質リモデリングは、主にアクトミオシン細胞骨格によって駆動される9(図2)。その活動は、原子核10を攪拌し、再配置し、貫通する機械的な力を発生させる(図2)。その結果、この細胞質から核質への力の伝達は、生体分子凝縮物12,13,14,15,16として知られる核内のいくつかの膜のないオルガネラの1つである核スペックル11と呼ばれる核メッセンジャーRNAプロセシングオルガネラのダイナミクスを調整します(図2)。
ライブイメージングは、核の攪拌の機能的意味を解読する上で決定的であった。何時間にもわたる核移動の動画や、アクチンメッシュやバルク細胞質の高時間分解能の動画は、異なる時間スケールを結びつけて、核の位置決めのための理論モデルの精緻化に大きく貢献した9。また、細胞質、核の輪郭、クロマチンや核凝縮物などの核成分の高時間分解能の動画は、細胞骨格に基づく核の攪拌がマウス卵母細胞のRNAプロセシングと遺伝子発現に及ぼす役割を強調し、細胞内の異なる時空間スケールを橋渡しする10,11。全体として、ライブイメージングに基づくこのようなスケール交差アプローチは、核の細胞骨格の攪拌と卵母細胞の発生の成功を結びつける最初の理論的根拠を提供しました。
プロトコルはマウス卵母細胞の核そして内部部品に細胞質力の伝達を(主にFアクチンによってそして部分的にmicrotubulesによって)調査するのに使用するイメージ投射およびイメージ分析のパイプラインを提供する。これらの実験の結果は、細胞質の活発な動き、核輪郭の揺らぎ、および単一のタイプの核生体分子凝縮物の動きと表面の揺らぎの間の関連性を確立した最近の2つの研究10,11に示されているように、細胞質内の細胞骨格から核内部まで、空間スケールにわたる力の連続体を捕捉することです。 核の斑点。同じアプローチは、悪性癌細胞の状況など、細胞質力が変化すると予想される他のモデル系にも適用され得る17。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 スピニングディスク</td><td>横河</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMI6000B顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet マイクロインジェクター</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter wheel</td><td>Sutter Instruments Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software&nbsp;</td><td>ユニバーサル・イメージング、&nbsp;</td><td></td><td>バージョン7.7.9.0</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OF1およびC57BL/6マウス&nbsp;</td><td>チャールズリバーラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリ(A)テーリングキット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>レティーガ 3 CCD カメラ&nbsp;</td><td>Qマイキング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasyキット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SC35</td>抗体 <td>Abcam</td><td>ab11826</td><td>核スペックル抗体; マウス IgG1 抗 SRSF2/SC35 (1:400)</td></tr><tr><td>SRSF2-GFP プラスミド&nbsp;</td><td>&nbsp;OriGene Technologies</td><td>MG202528</td><td></td></tr><tr><td>NM_011358ストリッパーマイクロピペット</td><td>&nbsp;</td><td>卵子採取に特化した</td>XLABソリューション <td></td></tr><tr><td>T3 mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1384&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage mMachine&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM13344</td><td></td></tr><tr><td>恒温槽</td><td>ライフイメージングサービス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

女性不妊症の原因を理解する上での大きな課題は、卵母細胞と呼ばれる女性の生殖細胞の発生を支配するメカニズムを解明することです。それらの発達は、細胞の成長とその後の分裂、胚発生を開始するために精子との融合のために卵母細胞を準備する2つの重要な段階によって特徴付けられます。増殖中、卵母細胞は細胞質を再編成して核を細胞中心に配置し、マウスとヒトの卵母細胞の発生の成功を予測し、その結果、胚発生能を予測します。マウス卵母細胞では、この細胞質再編成は細胞骨格によって駆動され、その活動は核を攪拌、再配置、および貫通する機械的力を生成することが示されました。その結果、この細胞質から核質への力の伝達は、生体分子凝縮物として知られる核RNAプロセシングオルガネラのダイナミクスを調整します。このプロトコルは、マウス卵母細胞の空間スケールを渡って核に対する細胞骨格の影響を、高い時間分解能で文書化するための実験フレームワークを提供します。i)卵母細胞細胞質における細胞骨格活性、ii)卵母細胞核の細胞骨格ベースの攪拌、およびiii)卵母細胞核質内の生体分子凝縮物動態に対するその影響を評価するために必要なイメージングおよび画像解析のステップとツールについて詳しく説明します。卵母細胞生物学にとどまらず、ここで詳述した方法は、体細胞での使用にも適用でき、同様に、細胞骨格に基づくスケール全体の核動態の調整に対処できます。

図3の画像パネルは、典型的な完全に増殖した卵母細胞(図3A)、YFP-Rangoを発現する完全に増殖した卵母細胞の核質(図3B)、正しく増殖した卵母細胞の核質(左パネル;図3C)または過剰(右パネル;図3C)SRSF2-GFP cRNAの投与、およびSC35抗体を用いた完全に増殖した卵母細胞の核スペックルの免疫染色(図3D)。マイクロインジェクションするSRSF2-GFP cRNAの正しい用量は、SRSF2-GFPの発現プロファイルと核スペックルの内因性プロファイルとの視覚的比較に基づいて定義されました。
卵母細胞の細胞質攪拌力は、STICベクターマップと画像相関解析(9 および11参照)を用いた研究室の以前の研究で示されているように、遺伝的( FMN2変異マウスなど)と化学的(サイトカラシンDなど)の両方の細胞骨格摂動によって減少する可能性があります。対照卵母細胞のSTICマップは多数のベクトルを示し、色は高い流速を示しますが、細胞骨格力が破壊された卵母細胞のマップはベクトルが少なく、流速が低いことを示す色で表示されます。同様に、対照卵母細胞では、細胞骨格力が破壊された卵母細胞と比較して、画像相関が非常に速く失われます。これは相関曲線でも観察可能であり、細胞骨格力が破壊された卵母細胞と比較して、対照卵母細胞の曲線の減少が速くなったり9 、曲線が反転するとより速く増加したりします11。
細胞骨格の力は、核とその内部の細胞小器官、特に核スペックルのような核凝縮物を攪拌する10,11。図4Aでは、対照卵母細胞の核が重要な末梢変動にさらされており、これは核プローブYFP-Rangoを使用して見ることができます。細胞骨格力が破壊された卵母細胞の核形状は、時間の経過とともに安定しています(図4C)。核の輪郭変動の解析は、攪拌を正確に定量化するための鍵となります。核心心からその周辺までの距離の分散(r-R)2(図4B)を決定することにより、変動を定量化することができ、細胞骨格力が破壊された卵母細胞よりも対照卵母細胞の方が核攪拌が6倍高いことが示された10。図5A-Bでは、核スペックル(SRSF2-GFP+液滴)が、細胞質力の制御状況と破壊された状況を高い時間分解能で示しています。コントロールでは、細胞質力が破壊された卵母細胞の液滴表面よりも液滴表面が有意に大きく変動し、Radioak32プラグインを使用して視覚化および定量化できます。視覚的には、緑と赤の色(図5A-Bの下の画像に見られるRadioak出力)は、プラグインが連続する画像間の表面変化を検出した角度を示し、白は表面の変化がないことを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig01.jpg"> 図1:マウスの卵形成後期と胚発生初期 。卵母細胞の増殖後期に起こる核のセンタリング、卵母細胞分裂中に起こる染色体オフセンタリング、および胚発生の初期段階(1細胞期と2細胞期)の図。雌のゲノム(卵母細胞核と雌前核)はピンク色、雄性前核は青色です。胚核(親ゲノムの融合後)は紫色です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig02.jpg"> 図2:増殖マウス卵母細胞におけるスケール全体の細胞質および核リモデリングの図。この図は、9,10,11の主な調査結果をまとめたものです。アクトミオシンによる細胞質のリモデリング、核攪拌、および時空間スケールにわたる機能的核生体分子凝縮液リモデリングの図解。核スペックルのスケール交差リモデリングは、その機能に関連する生体分子反応(すなわち、pre-mRNAのスプライシング)を増強します。このプロトコルでは、すべてのイメージングが画像フレーム間で0.5秒の同じ時間分解能で行われるため、空間スケールでのみ核攪拌の評価が可能であり、時間スケールでは評価できないことに注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig03.jpg"> 図3:完全に増殖した卵母細胞と核質のサンプル画像。 (A)核小体を取り囲むクロマチン(シアン)を示す完全に成長した卵母細胞の明視野画像。点線の白い円が核の輪郭を描いています。(B)YFP-Rangoを発現する生きた卵母細胞核;核小体に蛍光がないことに注意してください。(C)正しい用量のcRNA(左パネル)または高用量のcRNA(右パネル)のマイクロインジェクション後にSRSF2-GFPを発現する生卵母細胞核の例。左側の凝縮(液滴)相と溶解相、および右側の条件にそれらがないことに注意してください。(d)固定卵母細胞における核スペックル免疫染色;内因性発現プロファイルが C のものと同等であることに注目してください(左パネル)。スケールバー = 5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig04.jpg"> 図4:制御と破壊された核の輪郭変動のプラグイン出力。 (A)YFP-Rangoを発現するコントロール卵母細胞核(上)と、Ovocyte_nucleusプラグインによって生成された対応するバイナリマスク(下)のタイムラプス。(B)核の輪郭変動の原理 経時的および特定の方向での測定。方向は、0°から360°まで1°刻みの回転角度θによって定義されます。t=0 s (黄色) と t=135 s (紫) の 2 つの代表的な形状が表されます。青色の形状は、時間の経過に伴う平均形状に対応します。(C)F-アクチン(FMN2変異マウス)と微小管(ノコダゾール治療;10)の両方の破壊により細胞骨格力が低下した卵母細胞内の核の核の輪郭変動。スケールバー = 5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig05.jpg"> 図5:コントロールと破壊された液滴表面の揺らぎのプラグイン出力。 (A)1フレームあたり500msで画像化され、Ice Look Up Table(LUT)に示されたコントロールSRSF2-GFP核液滴のクロップ(上)。フィジーで生成された同じ液滴のバイナリマスク(中央)。Radioakプラグインは、液滴の表面変動を分析した後に出力し(下)、緑と赤はプラグインが連続する画像間で表面の変化を検出した角度を示し、白は表面の変化がないことを示します。(B)F-アクチンと微小管の両方の破壊により細胞骨格力が低下した卵母細胞の核液滴の表面揺らぎ(11のように)。スケールバー = 5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:Ovocyte_nucleusプラグイン解析出力例 図4Aに示したものと同じ原子核を分析しました。θ(θ)は度単位の角度であり、t1〜t600はフレーム番号に対応し、時間で変換できます。半径の単位はμmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%201_Ovocyte_nucleus%20output%20example.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
付表2:核外形変動の計算に用いたスプレッドシートのサンプル。 図4Aに示したものと同じ原子核を分析しました。θ(θ)は度単位の角度であり、t1〜t600はフレーム番号に対応し、時間で変換できます。タブ 生と平均: 半径の単位は μm です。タブr-R:r-R距離はμm単位です。表(r-R)2:変動値はμm2単位である。タブ x と y は、[生と平均] タブの半径のデカルト座標に対応します。これにより、平均形状タブで経時的な原子核の平均形状を描画できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%202_Nuclear%20outline%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表3:Radioakプラグイン分析出力の例。図5Aに示したものと同じ液滴を分析した。異なる時点と角度で測定された半径が表示されます。半径の単位はμmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%203_%20Radioak%20output%20example.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
付表4:核液滴表面の揺らぎを計算するために使用したスプレッドシートの例。 図5Aに示したものと同じ液滴を分析した。θ(θ)は度単位の角度であり、t1〜t600はフレーム番号に対応し、時間で変換できます。タブ 生と平均: 半径の単位は μm です。タブr-R:r-R距離はμm単位です。表(r-R)2:変動値はμm2単位である。タブ x と y は、[生と平均] タブの半径のデカルト座標に対応します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%204_Droplet%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルはマウス卵母細胞系の核形そして内部膜のない細胞小器官に対する細胞骨格の物理的な影響を文書化するために実験フレームワークを提供する。このフレームワークは、他の細胞タイプやコンテキストでの使用にも適合させることができます。

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

本研究室では、マウス卵母細胞モデルシステムを用いて、有性種の生殖に不可欠な雌の色域量の獲得に関わるメカニズムの解明を目指しています。最近、私たちは、核とその内容物の攪拌を促進する新しい機械的形質導入プロセスを特定し、マウス卵母細胞における母体RNAの微細制御につながりました。このプロトコルで提示されるイメージングおよび画像解析パイプラインにより、細胞質から核およびマウス卵母細胞の核RNAプロセシングボディを含むその構成要素へのスケールを横断する連続体としての細胞骨格力の伝達を強調することができます。このプロトコルは、単一のパイプラインで複数の細胞スケールにわたる最初の伝送に初めて対処できるシンプルなツールを提供します。生物物理学的モデリングで補完されたこのプロトコルは、核力学の変化と細胞コンパートメント間のエネルギーの散逸に対処するための非侵襲的技術を構成します。

capturing-cytoskeleton-based-agitation-mouse-oocyte-nucleus-across

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

卵母細胞が減数分裂成熟中に染色体の分離の誤差による異数性になりやすいです。異数体卵は不妊、流産やダウン症などの発達障害を引き起こす可能性があります。ここでは、卵母細胞と減数分裂成熟を研究し、倍数性を評価する方法に選択の材料を導入する方法を説明します。...

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。...

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

成熟したショウジョウバエ卵子の収集、調製、イメージングのためのプロトコールを提示します。これらの方法により、減数分裂中の染色体の挙動と紡錘体の組み立てと機能の視覚化が可能になります。...

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

ここでは、中期 II ステージに卵核胞から体外成熟中に実行される卵発達能力の非侵襲的評価するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、粒子画像流速測定法 (PIV) ニューラル ネットワーク解析とタイムラプス...

ニューラル ネットワークによる発達有能か無能なマウス完全育てられた卵母細胞の同定

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。...

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

ショウジョウバエでは、卵母細胞核は卵発生時に微小管依存性の移動を受ける。ここでは、卵室ex-vivoでライブイメージングを行うことで、移行に追随するために開発されたプロトコルについて説明します。私たちの手順は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してマルチポジション3Dタイムラプス映画を取得するために12時間生きている卵室を維持します。...

ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

近赤外フェムト秒レーザーを用いた中期I期にマウス卵母細胞の細胞質微小管組織化中心の枯渇を可能にする最適化されたプロトコルを提示します。...

マウス卵母細胞における細胞質微小管組織化中心の多光子レーザーアブレーション

染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。...

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

卵巣癌の同所性動物モデルは、より良い人間の病気を複製し、従って、癌の進行と治療に対する腫瘍の反応の理解を高める。マウスモデルでは、ルシフェラーゼを発現する卵巣腫瘍細胞のintrabursal注射を受け取ります。治療は、経口胃管栄養法により投与される。腫瘍の成長はによって監視されています...

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

学ぶマウス卵母細胞における細胞骨格力の核への伝達と核形状・RNA動態への影響。非侵襲的イメージング法で女性配偶子の機械的特性を解析し、生殖生物学への知見を提供する。

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

さらに動画を探す