Name: ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の Ex vivo モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 学ぶヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の3次元ex vivoモデル構築法。脂肪組織ニッチにおける腫瘍促進メカニズムの解明と新規治療法の評価プラットフォームとして活用できます。

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この研究は、ジャネット・バロス記念財団から一部資金提供を受けています。大網サンプルの収集について、患者とカルマノスがん研究所婦人科腫瘍科に感謝します。また、カルマノスがん研究所のバイオバンクと相関科学コアが、患者の募集と病理学スライドの作成を調整してくれたことにも感謝しています。バイオバンクと相関科学コアは、ウェイン州立大学カルマノスがん研究所へのNIHセンターの助成金P30 CA22453によって部分的にサポートされています。

以下の研究プロトコルは、ウェイン州立大学治験審査委員会(IRB)によってレビューされ、承認されました。手術前にすべての患者からインフォームドコンセントが得られました。 図 1 は、このプロトコルの 3 つの一般的な手順を示しています。
1. ヒト大網組織の調製
<ol><li>大網培養培地(DMEM/F12 + 10%ウシ胎児血清 + 1%ペニシリン-ストレプトマイシン)を調製し、4°Cで保存します。 この培地30〜40 mLを滅菌50 mLのコニカルチューブまたは手術標本容器に分注します。</li>
	<li>大網生検または大網切除術から手術標本を取得します。手術室で取り出した直後に、滅菌標本を大網培養液に浸します。ワークフローでこれができない場合は、できるだけ早く検体を大網培養培地に入れてください。サンプルを氷上に置いて移し、処理するまで4°Cで保存します。 注:除去された大網標本のサイズによって、実行可能な組織の量が決まります。</li>
	<li>層流フードを使用して、収集から1〜2時間以内に大網標本を処理します。すべての材料とツールが滅菌または滅菌されていることを確認してください。</li>
	<li>大網を採取容器から取り出し、100mmの培養皿に移します。検体を1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)に浸し、検体を静かに洗浄して血栓や破片を取り除きます。</li>
	<li>組織を小片(0.5 cm x 0.5 cmまたは100-200 mg; 図2A)小さな手術用ハサミまたは10〜15mmのメスを使用します。小さな外科用鉗子を使用して、組織を操作し、大網を押しつぶさないようにします。エネルギー装置を使用して大網標本を外科的に除去した場合は、密閉されたエッジで歪んだ組織を使用しないでください。</li>
	<li>切断した大網の各部分を24ウェル培養プレートの個々のウェルに入れ、ウェルに500 μLの大網培養培地、または大網片をウェル床上に浮かせずに大網を覆うのに十分な容量まで満たします(図2B)。</li>
	<li>大網片は、注入の準備ができるまで4°Cの新鮮な培地に保管してください。</li>
</ol>2. 卵巣がん細胞の調製
<ol><li>ヒト卵巣がん細胞を75cm2の培養フラスコで37°C、5%CO2で培養し、大網採取日までに少なくとも75%のコンフルエントに培養する。 注:このプロトコルは、以前に15,16,17,18と記載されたmCherry陽性OCSC1-F2ヒト卵巣癌細胞を利用します。蛍光シグナルでタグ付けされた任意のがん細胞株に修飾できます。</li>
	<li>大網標本を採取した直後に層流フード内に細胞を調製します。すべての材料とツールが滅菌または滅菌されていることを確認してください。</li>
	<li>10 mLの滅菌1x PBSを培養フラスコに加え、フラスコを静かに揺動させて細胞を洗浄します。1x PBS を除去し、3 mL の 0.05% トリプシン-EDTA を加えます。</li>
	<li>培養フラスコを静かに揺らしてすべての細胞をコーティングし、フラスコをインキュベーター(37°C、5%CO2)に5分以内入れます。培養フラスコを叩いて細胞を完全に剥離し、3 mLの大網培養培地を加えてトリプシンを中和します。</li>
	<li>細胞懸濁液をピペッティングで混合し、懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。懸濁液を24°C、1,200 x g で5分間遠心分離します。 上清を除去し、細胞ペレットを6 mLの新鮮な大網培養培地に再懸濁します。</li>
	<li>血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液を懸濁液100〜200μLあたり少なくとも100,000細胞に希釈します。これは、大網の各カット部分への注入量です。</li>
	<li>適切な数の細胞を新しい培養フラスコに移し、細胞継代を継続します。</li>
</ol>3. 卵巣がん細胞の注入
<ol><li>1 mL のシリンジを使用して細胞懸濁液を吸い上げ、26 G の針を取り付けます。針を使用して細胞懸濁液を吸い上げると、細胞が断片化する可能性がありますので、使用しないでください。</li>
	<li>小さな外科用鉗子を使用して、切断された大網の一部を拾います。大網を別の作業中の滅菌皿に移して、注射を容易にします。.針先で大網を静かに刺し、少量の細胞懸濁液を組織に注入します(図2C)。</li>
	<li>大網のいくつかの領域にわたって、少なくとも100μLまたは100,000細胞の総量まで注射を繰り返します。.細胞懸濁液の多くが標本の周囲に溜まっているように見える場合があることに注意してください。注入の品質に懸念がある場合は、注入を繰り返すか、より多くの細胞懸濁液を検体に注入します。</li>
	<li>注入した大網サンプルを24ウェル培養プレートの各ウェルに戻します。大網培養培地の体積は、大網を浮遊させずに大網を覆うレベルであることに注意してください。プレートを慎重に取り扱い、インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。</li>
	<li>オプション:マトリゲル(基底膜マトリックス)を使用して、大網組織を固体マトリックスに懸濁し、注入を容易にし、細胞懸濁液の送達をより濃縮します。<ol><li>基底膜マトリックスを4°Cで融解し、使用直前に大網培地と1:1の比率で混合します。基底膜マトリックス混合物は、注入するまで氷上または4°Cで保存します。大網の切り取った部分を浸すのに十分な基底膜マトリックス混合物で空のウェルを満たします。</li>
		<li>標本を基底膜マトリックス混合物に入れ、24ウェル培養プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に20分間入れます。混合物が固まったら、上記のように注入を続行します。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光イメージングを使用して注入が成功したことを確認します。注入部位に蛍光シグナルのストリークが可視化されていることを確認します(図2D)。注射後に大網に付着した細胞の実際の数は予測できないことに注意してください。.</li>
</ol>4. ヒト大網細胞と卵巣癌細胞の共培養
<ol><li>500〜2000μLの新鮮な大網培養培地を追加して、48〜72時間ごとに培地を交換します。大網組織の上に培地を直接ピペットで移すと、がん細胞が移動する可能性があるので、使用しないでください。メディアの色が黄色に変わった場合は、メディアを交換してください。 注:培地交換の頻度は、使用する培地の量とがん細胞の増殖の軌跡によって異なります。がん細胞が大網に種をまくと、大網片が浮いているかどうかは重要ではなくなります。</li>
	<li>オプション:基底膜マトリックスを使用した場合、マトリックスは通常、最初の培地交換時までに溶解します。</li>
	<li>蛍光イメージングを使用して卵巣がん腫瘍の成長を監視します。イメージングの頻度は研究者の裁量に委ねられています。約14日までに小さな腫瘍の証拠が予想されます(図3A-C)。結果は、注射の質によって異なる場合があります。</li>
	<li>実験エンドポイントに基づいて実験を終了します。 注:大網組織の腫瘍の成長と完全性は、過去50日間観察されています。</li>
</ol>

卵巣がん-大網相互作用のための3D ex vivoモデルの確立

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+of+the+ovary%2C+fallopian+tube%2C+and+peritoneum%3A+2021+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynaecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li>
<li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma%3A+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li>
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</ol>

著者は何も開示していません。

このプロトコルを使用して、卵巣癌の腹膜癌腫症の前臨床モデルが、基本的な in vitro 技術と ex vivo 技術の組み合わせを使用して開発されました。大網標本にmCherry+ OCSC1-F2ヒト卵巣がん細胞を播種した後、50日間の共培養で進行性の腫瘍増殖が観察されました。この方法は、さまざまな大網標本を使用したいくつかの実験的試験で開発され、最適化されました。腫瘍増殖が成功するかどうかは、大網の質、がん細胞の生存率、および注射の有効性にかかっていた。この報告では、以前にいくつかの出版物で報告されたmCherry+ OCSC1-F2細胞とmCherry+ R182ヒト卵巣がん株のみを使用しました12、15、16、17、18、19、20、21、22。倍加時間(OCSC1-F2では16時間、R182では36時間)の異なるこれら2つの細胞株を用いて、大網組織内で対数的成長を達成するまでの時間の違いが認められました。それにもかかわらず、私たちは共培養系で両方の細胞株を確立することに成功しました。
研究者、研究コーディネーター、手術チーム間の効率的なコミュニケーションは、大網標本の収集と処理に不可欠でした。治験責任医師はプロトコル候補を特定し、研究コーディネーターは手術前に患者から同意を得て、治験責任医師は手術室から標本を採取しました。このワークフローを考えると、収集に影響を与える多くの患者側の要因が予測不可能であったため、治験責任医師のスケジュールは柔軟である必要がありました(例:手術のキャンセル、手術時間の変更、不十分または大網の除去なし)。手術室からの組織を直接視覚化して選択することで、標本の完全性、外科的無菌性、およびタイムリーな処理が保証されました。当初、標本収集は研究コーディネーターに委託されていました。しかし、いくつかの検体を採取した後、処理までの時間が遅れ(すなわち、>4時間)、大網の質が著しく劣っている(例えば、組織がバラバラになっている)ことに気づいた。ある実験的試験では、がん細胞の準備が間に合わなかったため、大網組織を注射前に4°Cで48時間保存した。同様の腫瘍増殖が依然として観察されたが、温度変化が腫瘍微小環境(TME)に影響を与えることが知られているため、このシーケンスは繰り返されなかった。
検体採取の前には、手術スケジュールに従ってがん細胞が十分にコンフルエントしていることが重要でした。毎月採取される検体数は変動するため、卵巣がん細胞の活発な培養が常に維持されているとは限らなかった。凍結細胞は、少なくとも1週間前に融解し、標準プロトコルを使用して播種し、生存率を確保するために少なくとも1回は細胞を通過させました。このプロトコルで使用された細胞株は比較的弾力性がありました。しかし、手術当日までに細胞が回復せず、注射できないケースもありました。この研究では、コンフルエントが50%未満のがん細胞を注入する試みはありませんでした。その後の細胞調製に関連する遅延は、優れた無菌技術を使用し、予想される検体採取スケジュールに応じてコンフルエンスを維持するために細胞を比率で分割することで軽減されました。プロトコルは、蛍光タグを付けた2つのがん細胞株のみに限定しましたが、他の確立されたがん細胞株や蛍光タンパク質を持たない原発がん細胞も利用できることに注意することが重要です。
最後に、腫瘍増殖速度は、注射直後の脂肪細胞に隣接し、脂肪細胞内のがん細胞の合流点と相関していました。これは、注入後のすべての大網標本の蛍光画像を撮影することによって決定されました。固形臓器や皮下組織への腫瘍細胞接種と比較して、大網組織へのがん細胞の注入はより困難でした。大網のゆるい構造と脂肪の粘稠度は、組織が漏れることなく大量の細胞懸濁液を効果的に保持することを妨げます。細い針(30G以下)で注入すると、細胞増殖が減少するため、細胞断片化が懸念されました。さまざまな注入技術、細胞数、細胞懸濁液量を試験したところ、上記のプロトコルで一貫した結果が得られました。同時に、プロトコルに対するそのようなバリエーションは、細胞の悪性の性質を考えると、同様の結果を生み出す可能性が高いことを認めています。マトリゲルを添加すると、細胞外マトリックスが細胞懸濁液をよりよく保持するため、注入ステップが容易になりました。しかし、この方法はより高価であり、サンプル中の腫瘍量を一貫して高くすることはありませんでした。全体として、大網標本で腫瘍が増殖しないことはまれであったが、腫瘍の数と成長速度はさまざまであった。
このモデルは、脂肪に富む腹膜組織への早期転移を再現することにより、卵巣がんの腫瘍形成の特徴をシミュレートしました。このプロトコルは、スキルを必要とせずにバリエーションを作成でき、複製が容易で、潜在的な翻訳価値を持つシステムを生成します。卵巣癌における既存の in vitro および ex vivo モデルと比較して、ここで説明する方法は、いくつかの技術を組み合わせて、腫瘍構造とTMEを長期間にわたって保持するモデルを作成します。また、複数の腫瘍を有する大網標本を新しいウェルに移し、がんのない大網で培養(注射しない)した場合、7日以内にナイーブ大網にがん細胞が播種されることを観察しました。この知見は、複製された腫瘍が上皮間葉転換を介して転移の可能性を保持していることを示唆している。組織生検を長期間培養した文献では、同様の卵巣がんモデルは同定されなかった。このアプローチは、マウス大網から単離された中皮細胞を採取後30継代以上培養できるという以前の発見によって裏付けられている23。
この研究で記述されたモデルは、卵巣癌細胞と脂肪に富む大網内の細胞との間の直接的な相互作用の影響をさらに理解するために採用することができます。がん細胞は大網組織から解離し、トランスクリプトームまたは免疫組織化学(IHC)分析のために得ることができます。さらに、細胞は薬物反応の研究に使用できます。
このモデルの主な限界は、腫瘍の数、腫瘍の増殖速度、および腫瘍の位置が予測不可能であったことである。標準化の欠如とサンプル間のばらつきは、このモデルの適用を制限する可能性があります。また、このプロトコルの開発中にさらなる調査を必要とするいくつかの観察を行いました。例えば、ある実験における「対照」の反復は、患者がその後大網微小転移と診断されたため、実際には癌がなかった;しかし、非注射の腫瘍は実験期間を通じて生存可能であった。このモデルの将来のアプリケーションには、初期の腫瘍形成中のTMEの分子研究、免疫細胞の注入によるTMEの操作、および薬物応答の研究が含まれます。要約すると、ここで説明する前臨床モデルは、既存の研究ツールのレパートリーに追加され、卵巣癌におけるTMEの分子メカニズムの解明に役立つと信じています。

卵巣がんは、世界で最も致命的な婦人科悪性腫瘍です1。このがんを発症する生涯リスクは約70人に1人で、診断年齢の中央値は63歳です2。原発性卵巣悪性腫瘍は、組織学的に上皮性または非上皮性のいずれかに分類される。上皮性卵巣がん(EOC)は腫瘍の90%以上を占め、最も一般的なサブタイプは高悪性度漿液性がん(HGSC)であり、EOCの約70%〜80%を占めています。現在、病気を早期に発見するための有効なスクリーニング方法はありません。そのため、ほとんどの患者は、がんが腹膜腔全体に拡がった後、進行した病期(すなわち、国際婦人科産科[FIGO]ステージIIIまたはIV)で診断されます2。
標準的な最前線治療は、目に見える肉眼的病変をすべて切除する細胞縮小手術と、その後、残存する顕微鏡的病変を破壊するための補助プラチナ製剤ベースの化学療法です。過去20年間で卵巣がんの治療には多くの進歩がありましたが、進行した疾患の患者の約70%が治療後3年以内に再発します3。これらの患者の全体的な予後不良を考えると、EOCにおける進行中および将来のトランスレーショナルリサーチの取り組みは、早期発見のためのバイオマーカーの特定、転移の予防、耐性を回避するための現在の治療法の改善、および新しい個別化がん治療法の開発を目的としています。
腹腔内の全身性転移とそれに関連する化学療法抵抗性は、卵巣癌患者の治療を改善するための主要な制限の2つです4,5。大網は、胃から腸に垂れ下がる脂肪質のエプロンのような構造で、卵巣がん転移の主な部位です6,7。大網は、物理的なバリアとしての機能に加えて、再生能力と血管新生能力を持ち、免疫活性を持っていることが示されており、これらが一緒になって血管新生を促進し、創傷治癒を促進し、感染を制限します8。さまざまな細胞タイプに分化できる幹細胞を高濃度で含み、損傷した組織の修復に役立ちます。大網は、損傷や感染に反応して炎症を起こすことがあり、それが免疫細胞の損傷部位への移動を引き起こす9。これらの免疫細胞は、損傷した組織の修復と再生を促進するのに役立つ成長因子やその他の分子を放出します。大網に局在するマクロファージ、リンパ球、形質細胞などの免疫細胞は「乳白色の斑点」と呼ばれる構造で、病原体を検出して攻撃し、腹膜免疫を調節する役割を担っています。また、大網は免疫寛容10(自己抗原に耐え、健康な組織を攻撃しない免疫系の能力)を誘導する役割も担っていることが示されている。しかし、同じ免疫関連活動は、大網腫瘍の増殖、転移、免疫監視の脱出などの病理学的反応にも関与しています9,11。私たちの研究室や他の研究による以前の研究は、抗腫瘍免疫応答の阻害と化学療法抵抗性の獲得における脂肪微小環境のユニークで積極的な役割を示しています12,13,14。残念ながら、大網が腫瘍誘発性の微小環境を提供する細胞および分子メカニズムに関する情報は限られています。
がん細胞と大網の相互作用をよりよく理解するために、ヒト卵巣がん細胞と患者由来の大網外植片からなる3D培養システムを開発しました。ここに記述されているプロトコルは腹膜の癌腫症の新しい 生体外 モデルを表す。このモデルは、この脂肪が豊富な組織における卵巣がん腫瘍形成の自然な進行を模倣しています。提案されたモデルは、生成が容易で安価であり、卵巣癌研究におけるトランスレーショナル研究に適用できる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>1 mL インスリンシリンジ 26 G 着脱式ニードル付き</td><td>BD</td><td>329652</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>CELLTREAT</td><td>229010B</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 組織培養ディッシュ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>CELLTREAT</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルセル培養プレート</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 組織培養フラスコ</td><td>CELLTREAT</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell Counter</td><td>Corning</td><td>9819000</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 imager</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-グルタミン, +2.438 g/L ナトリウム重炭酸塩</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定</td><td>Gibco</td><td>1043028</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356230</td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>No. 10 ステンレス鋼使い捨てメス</td><td>インテグラ-ミルテックス</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4 (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Revolve顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>エコー

ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の ex vivo モデル

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

卵巣がんは、最も致命的な婦人科悪性腫瘍です。大網は、転移性卵巣がん細胞に支持的な微小環境を提供するだけでなく、腫瘍耐性を可能にする免疫調節シグナルを提供する上で重要な役割を果たします。 しかし、卵巣がん細胞と脂肪に富む組織との相互作用を厳密に模倣したモデルは限られています。大網が腫瘍誘発性の微小環境を提供する細胞および分子メカニズムをさらに理解するために、私たちは癌細胞と大網の相互作用の独自の3D ex vivo モデルを開発しました。ヒト大網を用いて、この脂肪に富む微小環境の中で卵巣がん細胞を増殖させ、腫瘍の増殖や免疫調節に関与する因子をモニターすることができます。このモデルは、この脂肪に富む腫瘍微小環境を研究するためのプラットフォームを提供することに加えて、このニッチな転移性がん細胞を標的とする新しい治療アプローチの開発と評価のための優れたプラットフォームを提供します。提案モデルは、生成が容易で安価であり、トランスレーショナル調査に適用できます。

大網標本への卵巣がん細胞の正常な定着は、約14日目までに明らかになりました(図3A-C)。少なくとも 24 回の繰り返しを調製し、さらなる実験を可能にするために、収集した検体ごとに注入しました。蛍光画像を撮影することにより、腫瘍の成長をモニターしました(図3D、E)。画像は、大網に付着していない各ウェルの底にも癌細胞の単層が成長したため、慎重に解釈する必要がありました。大網が培地に懸濁されたときの画像は、がん細胞の単層と蛍光シグナルが重ならないように撮影することを好んだ。
14日目までに蛍光シグナルが見られない場合は、注射の失敗と見なすことができます。がん細胞は、最初の7日間は大網の表面に広がっていましたが、時間が経つにつれて集まって腫瘍を形成することが観察されました(図3A-D)。サンプル間の腫瘍量に対する代替指標は、大網培養培地の色が赤から黄色に変化する速度であった(図3F)。蛍光イメージング、組織学的レビュー、および肉眼検査を利用して、50日間の共培養後の腫瘍の成長と大網組織の生存率を確認しました(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig01.jpg"> 図1:プロトコルの一般的なステップの図。 (A)ステップ1:大網の準備。(B)ステップ2:がん細胞の注入。(C)ステップ3:がん細胞-大網微小環境の確立。(図は BioRender.com で作成)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig02.jpg"> 図2:大網へのがん細胞の調製と注入 。 (A)大網は1×1cmに切り分けられます。(B)各ピースを24ウェルプレートのウェルに入れ、500μLの培地で覆います。(C)大網片へのがん細胞の注入。(D)注射後に蛍光がん細胞の筋状が観察される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig03.jpg"> 図3:14日および25日間の共培養後の代表的な画像。 (A-C)14日間の共培養後の代表的な画像:(A)相、(B)mCherryチャンネル、(C)マージ。(D-E)25日間の共培養後の代表的な画像。(F)培地の色がピンク色から黄色に変化することは、がん細胞の注入が成功し、共培養が確立されたことを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig04.jpg"> 図4:肉眼的形態およびヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色 。 (A、B)50日目の共培養の代表的な肉的形態。矢印はmCherry+卵巣がん細胞の増殖部位を示す。(C、D)50日目の共培養の代表的なH&amp;E染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは癌の細胞大網の相互作用の三次元(3D) ex vivo モデルの確立を記述する。このモデルは、脂肪ニッチ内の腫瘍誘発メカニズムを解明し、新しい治療法をテストするためのプラットフォームを提供します。

ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の Ex vivo モデル

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

現在の研究では、単離された脂肪細胞と卵巣がん細胞で構成される共培養システムを使用しています。これらの脂肪細胞は、in vitroで前脂肪細胞と分化します。これらの細胞は、トランズウェルインサートを介して分離されるため、細胞同士の直接的な接触がありません。このex vivo培養法は、がん細胞と脂肪微小環境との直接的な相互作用を研究するためのモデルを提供します。私たちのモデルは、人間の運動量の構造を保持し、したがって、この器官に典型的に存在するさまざまな細胞タイプを維持します。脂肪細胞に加えて、これらの細胞には、免疫細胞だけでなく、支持線維芽細胞も含まれます。また、このモデルでは、これらのセルを固有のマトリックスに保持します。このモデルは、このニッチな分野で転移性がん細胞を標的とする新しい治療アプローチの開発と評価のための優れたプラットフォームを提供します。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ここで説明した中皮クリアランスアッセイは、蛍光標識細胞とタイムラプスビデオ顕微鏡可視化と定量的に卵巣癌多細胞スフェロイドと中皮細胞単層の相互作用を測定するために利用しています。このアッセイは、卵巣癌転移の初期段階をモデル化します。...

in vitroで中皮クリアランスアッセイでそのモデルの卵巣がんの転移の初期段階を

このビデオでは、腹腔の内壁のin vitro...

腹腔内層における卵巣癌転移のモデリング:腹膜内層のin vitro 3Dモデルを確立する方法

このビデオでは、ヒト大網標本から初代ヒト中皮細胞を単離するプロトコールについて説明しています。中皮細胞は、卵巣がん細胞の接着、浸潤、および増殖を調査するためのin...

中皮細胞の単離:ヒト大網組織標本から初代中皮細胞を単離する技術

この動画では、GFP発現卵巣がん細胞を重ね合わせた生体外臓器培養を確立し、大網外植片内での卵巣がんのコロニー形成を研究します。このプロトコルは、転移を促進する乳白色の斑点として知られる大網内の免疫細胞構造を分析します。...

Otrial Cancer Cell Colonizationのモデリング:Murine Oothitum Explantsにおける蛍光標識卵巣癌細胞の乳白色スポットコロニー形成を確立するためのex vivo法

このビデオでは、腫瘍の発生と腹膜転移を研究するためのマウス実験モデルを作成するためのプロトコルについて説明しています。この卵巣がんモデルは、ヒト上皮性卵巣がん細胞を雌マウスの卵巣に同所性接種することによって生成されます。...

マウス卵巣への卵巣癌細胞の同所性接種:細胞の腹膜播種を研究するための卵巣癌マウスモデルを確立する手順

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生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

卵巣がんの転移は、多数のびまん性腹腔内病変を特徴としており、腫瘍負荷の正確な視覚的定量化は困難です。 ここでは、赤色蛍光タンパク質(RFP)標識腫瘍細胞と光学イメージングを使用して、転移性腫瘍量のin situおよびex...

腹腔内卵巣癌転移の定量

ここでは、卵巣癌細胞の接着、浸潤、増殖を調査するツールとして、初代ヒト中皮細胞と細胞外マトリックスで層状にされた線維芽細胞からなる腹腔の内層の3次元in vitroモデルを構築するためのプロトコルを提示します。...

ヒト腹腔器官培養における卵巣癌普及の初期段階のモデル化

卵巣癌の腹膜播種の多段階プロセスを明確にするために、現在の研究では、これらの腫瘍細胞と同所接種を介して元の腫瘍の開発と腹膜転移のマウス実験モデルを提示します。...

オリジナル腫瘍の開発のマウス実験モデルと腹膜転移<em&gt;経由で</em卵巣癌細胞で&gt;同所接種

この原稿は、腫瘍低酸素症が転移に及ぼす影響を直接テストし、その作用メカニズムを解読することを可能にする動物モデルの開発について説明しています。ここで説明する実験はユーイング肉腫に焦点を当てていますが、同様のアプローチを他の腫瘍タイプにも適用できます。...

腫瘍転移に対する低酸素のテストの効果のためのインビボモデル

学ぶヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の3次元ex vivoモデル構築法。脂肪組織ニッチにおける腫瘍促進メカニズムの解明と新規治療法の評価プラットフォームとして活用できます。

ヒト大網を用いた卵巣癌腹膜転移の Ex vivo モデル

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