Name: 超短自己組織化ペプチドマトリックス中のSW1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ超短自己組織化ペプチドマトリックスを用いたSW1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製と評価法。免疫染色や3Dバイオプリンティングで形態と生存性を解析し、再生医療への応用を促進します。

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この研究は、キングアブドラ科学技術大学によって財政的に支援されました。著者らは、KAUSTのSeed Fund Grantと、KAUSTのInnovation and Economic Developmentが授与したイノベーションファンドを認めています。著者らは、KAUSTのBioscience and Imaging Core Labsが生物学的特性評価と顕微鏡分析をサポートしてくれたことに感謝します。

1. バッファーと溶液の調製
注:記載されているすべての濃度は最終濃度です。
<ol><li>ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン-ストレプトマイシンをそれぞれ10%と1%の最終濃度で添加し、完全なイスコーブ改変ダルベッコ培地(IMDM)を調製します。4°Cの暗所で最大1か月間保管してください。</li>
	<li>リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)にMgCl2 (3 mM)、スクロース(300 mM)、Triton X-100(0.5%)を混合して、透過化緩衝液を調製します。この溶液は4°Cで最大2か月間保存します。</li>
	<li>ウシ血清アルブミン(BSA、1%)、グリシン(0.3 M)、およびTween-20(0.1%)をPBS中に組み合わせて、ブロッキングバッファーを調製します。この溶液は4°Cで最大2か月間保存します。</li>
	<li>滅菌条件下で超純水でPBSを10倍から2倍に希釈します。この溶液は室温で6か月以上保存してください。</li>
	<li>3mgのペプチド粉末を紫外線下で30分間滅菌します。500μLの超純水を加え、ボルテックスミキサーで溶解します。 注:最終濃度は目標濃度の2倍、つまり6 mg / mLである必要があります。1x濃度は3 mg / mLになります。</li>
</ol>2. ペプチド中のSW1222からの大腸がんオルガノイドの作製
<ol><li>アリコートを4°Cで一晩解凍し、地下マトリックスコントロールの準備に必要なまで氷に保管します。</li>
	<li>2xペプチド溶液の10 μL液滴を24ウェルプレートの各ウェルの中央に置きます。プレートを室温で10分間インキュベートします。あるいは、ウェルあたり8〜10個の液滴を6ウェルプレートに堆積させます。 注:共焦点顕微鏡および電子顕微鏡で使用することを目的としたサンプルは、滅菌カバーガラスの上に播種すると、操作しやすくなります。</li>
	<li>2x PBSを10μL加えます。先端を使用してPBS溶液を穏やかに混合します。ゲルを少なくとも20分間安定させ、液滴がほぼ無傷のままであることを確認します。 注:PBSの添加と穏やかな混合の目標は、液滴の完全性を維持し、ヒドロゲルが層に広がるのを防ぐことです。</li>
	<li>0.125%トリプシン-EDTA溶液(5mL)を使用してSW1222細胞を剥離します。細胞をトリプシンと37°Cで5〜10分間インキュベートし、フラスコから剥がれるまで培養します。細胞の凝集を避けるために、フラスコを叩くのを控えてください。</li>
	<li>5 mLの完全培地を加えて、トリプシンを不活性化します。30 μmの細胞ストレーナーを使用して細胞懸濁液をろ過します。あるいは、25Gの針が付いたシリンジを使用して、凝集体を破壊します。</li>
	<li>0.4 × 106 cells/mLの細胞懸濁液を調製し、10 μLのマイクロピペットを使用して各ペプチド液滴に2 μLの細胞懸濁液を注入します。</li>
	<li>液滴を37°C、5%CO 2で30分間インキュベートします。 インキュベーション後、0.5 mLの補充培地を各ウェルに加えます。</li>
	<li>待っている間に、補充した培地を使用してメインストック(ロットに応じて8〜12 mg / mL)を最終濃度3 mg / mLに希釈することにより、基底膜マトリックスコントロールを調製します。この溶液に細胞を添加します(25μLあたり800細胞)。 注:基底膜の操作は、常に氷上で行う必要があります。ハイドロゲルに触れる前に、先端を氷冷したPBSですすぐ必要があります。そうしないと、チップ内で重合が発生します。</li>
	<li>各ウェルに基底膜溶液の液滴20μLをプレートします。液滴をゲル化させるには、37°Cで20分間インキュベートします。 材料をゲル化した後、0.5 mLの完全培地を加えます。</li>
	<li>3〜4日ごとに媒体を交換してください。細胞が組織化し、内腔形成のシグナルを示しているのを4日目という早い時期に観察します。</li>
	<li>1日目、4日目、7日目に明視野で細胞を画像化し、オルガノイドの増殖を評価します。</li>
</ol>3. 生存率と増殖
<ol><li>生存率アッセイ用に3枚のブラックウェルプレートを、増殖アッセイ用に3枚のブラックウェルプレートを調製します。ウェルあたり25 μLの2xペプチド溶液を添加し、同量の2x PBSを使用してゲル化します。上記のようにセルをシードします。</li>
	<li>ペプチドハイドロゲルの各製剤について、増殖プレートのブランクとして使用するウェルを3つ調製します。これらに細胞を播種しないでください。</li>
	<li>培地を生存率ウェルプレートから取り出し、1x PBSで3 x 5分間洗浄します。</li>
	<li>哺乳類細胞の生存率/細胞毒性キット( 材料の表を参照)から、カルセイン-AMとエチジウムホモダイマーを8 μMに希釈し、同じ光保護コニカルチューブに入れます。光保護コニカルチューブでこの溶液2 mLを2 mLのPBSに調製するには、4 μLのCalcein-AMストック溶液と8 μLのEthidium homodimer-1ストック溶液を加えます。</li>
	<li>ステップ3.4で調製したカルセイン/エチジウムホモダイマー溶液を96ウェルプレートに加えます。ウェルあたり100μLを添加します。光から保護し、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>1x PBSで3 x 5分間洗浄します。4倍対物レンズを使用する場合は最低3つのフィールド(中央、上、下)、蛍光顕微鏡で10倍および20倍の対物レンズを使用する場合は最低5つのフィールド(中央、左上、右上、左下、右下)を画像化します。</li>
	<li>増殖ウェルプレートから培地を取り出して、最終容量が90 μLになるようにします。</li>
	<li>10 μLのAlamar Blue溶液( 材料表を参照)を加えて、最終濃度10%にします。</li>
	<li>光から保護し、37°C、5%CO2で2〜4時間インキュベートします</li>
	<li>ウェルプレートリーダーを使用して、蛍光(Ex/Em = 530-560/590 nm/nm)または吸光度(570 nm)を測定します。ブランクについて得られた値を平均化し、セルを含む各ウェルの値からそれらを減算します。</li>
	<li>各条件の信号を平均し、それぞれのブランクの平均を差し引くことにより、増殖値を計算します。相対吸光度/蛍光シグナルの時間に対するインデックス付き箱ひげ図を生成することにより、グラフを作成します。</li>
</ol>4. マトリックスへの細胞の接着アッセイ
<ol><li>100 μL のペプチドハイドロゲルを 2 つの独立した 96 ウェルプレートに調製します。</li>
	<li>各ウェルに20,000個の細胞を播種し、100 μLの培地を加えます。プレートを37°C、5%CO2で90分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、1つのプレートのみを取り、P200マイクロピペットを使用して培地を20〜30秒間慎重に再懸濁します。先端をゲルから離してハイドロゲルを乱さないように注意してください。あるいは、ハイドロゲルの機械的特性が許す場合(G' > 8,000 Pa)、移動する渦を使用してウェルプレートの4つの側面を軽くたたきます。 注:培地を再懸濁する(またはウェルプレートをボルテックスで叩く)と、未付着の細胞とマトリックスの表面への接着が希薄な細胞の両方が除去されます。細胞の接着は90分以内に起こりますが、この付着の強度は特定のペプチドハイドロゲルとその接着および結合特性によって異なります。結腸直腸オルガノイドの成長は、剛性値が2,000 Pa未満のマトリックスで好まれることが知られています。したがって、このプロトコルで提示されるハイドロゲルは柔らかくもろいため、穏やかな機械的ストレスを使用することを重要視しています。</li>
	<li>両方のウェルプレートから100 μLの培地を取り出し、1x PBSで1回洗浄します。</li>
	<li>1 μg/mL DAPI溶液を調製します。100 μLのDAPI溶液をすべてのウェルに加え、室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>蛍光顕微鏡で代表的な数のフィールドを画像化します。すべての画像が同じ目的を使用して取得され、ピクセル/距離比が一定になるようにします。 注:10倍対物レンズの場合は9つのフィールド、または20倍対物レンズの場合は15フィールドの画像をイメージします。</li>
	<li>蛍光画像を画像解析ソフトウェア(ImageJなど)に読み込み、すべての画像上の粒子を解析します。<ol><li>[Image] メニューから [Type] を選択し、[8-bit] をクリックします。</li>
		<li>[画像]メニューから[調整]を選択し、[明るさ/コントラスト]をクリックします。[自動]ボタン |適用します。</li>
		<li>[画像] メニューから [調整] を選択し、[しきい値] をクリックします。[自動]ボタンをクリックして、ウィンドウを閉じます。</li>
		<li>[分析]メニューから、[粒子の分析]をクリックします。要約するオプションにチェックを入れ、[OK]をクリックします。</li>
		<li>[概要] ウィンドウで、[ファイル] メニューにカーソルを合わせ、[保存] をクリックして概要値を保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>すべての画像の結果を標準の統計ソフトウェアにエクスポートします。</li>
	<li>ストレスの前後でセルがカバーする面積の割合を計算します。各条件に対する面積の割合のインデックス付き箱ひげ図を作成します。</li>
</ol>5. ペプチドハイドロゲル中のオルガノイドの免疫染色
<ol><li>ステップ2.1-2.10で説明したように、ペプチドハイドロゲルの液滴20 μLに800個の細胞を4日間播種します。</li>
	<li>4日目に培地を取り出し、1x PBSを使用して各ウェルを2回洗浄します。</li>
	<li>400μLの4%ホルムアルデヒド溶液を加えます。ウェルプレートを室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>ホルムアルデヒド溶液をP1000で取り出し、1x PBSで一度洗浄します。</li>
	<li>1 mLの透過化バッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>P1000で透過化バッファーを取り出し、1x PBSで1回洗浄します。</li>
	<li>ブロッキングバッファー0.5 mLを添加し、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>P1000でブロッキングバッファーを取り外し、1x PBSで洗浄します。</li>
	<li>一次抗体をブロッキングバッファーで希釈します( 材料表を参照)。200μLを2つのウェルに加えます。</li>
	<li>4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>P200で染色液を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。</li>
	<li>二次抗体をブロッキングバッファーで希釈します。これは、製造元の指示に従ってください( 材料表を参照)。二次抗体溶液中にファロイジンコンジュゲートを1:40の比率で添加します。</li>
	<li>光から保護し、室温で3時間以内でインキュベートします。P200で染色液を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。</li>
	<li>ブロッキングバッファーに1 μg/mLのDAPI溶液を調製します。各ウェルに300μLのDAPI溶液を加えます。</li>
	<li>光から保護し、室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>P200で染色液を取り出し、1x PBSで一度洗浄します。</li>
	<li>光から保護し、4°Cで最大7日間保管してください。</li>
</ol>6. マトリックス中のオルガノイドのイメージングと画像解析
<ol><li>落射蛍光顕微鏡を使用して、染色したサンプルを10倍で画像化します。ファロイディンチャネルとDAPIチャネルのみを使用してください。</li>
	<li>Celloposeソフトウェアを開き、 ctrl + L を押して画像をロードします。ソフトウェアは選択した画像の場所にあるすべてのファイルにアクセスできるため、サブフォルダを持たずにすべての蛍光画像を正確な場所に保存してください。</li>
	<li>Segmentationパネルにコロニーの平均直径を入力し、ENTERをクリックします。</li>
	<li>結腸オルガノイドのカスタムモデルを選択し、 Run Model ボタンをクリックします。 注:ここでは、Cellpose2.029,30で2つのゼロからモデルを使用することをお勧めします</li>
	<li>ctrl + s を押して、マスクを .npy ファイルとして保存します。</li>
	<li>キーボードの矢印キーを使用してフォルダーの画像間を移動し、フォルダー内のすべての画像で結腸オルガノイドのモデルを実行します。</li>
	<li>フォルダのコピーを作成し、結腸オルガノイド内腔のモデルを使用して手順6.2〜6.6を繰り返します。</li>
	<li>ImageJを開き、 プラグイン|マクロ |走る。。。 をクリックして、Cellpose Githubサイトから入手できるimagej_roi_converter.pyファイルを実行し、ウィンドウが表示されるのを待ちます。</li>
	<li>colon organoidフォルダから 最初のファイル を選択し、[ Open]をクリックします。</li>
	<li>最初のファイルに対応する seg.npy ファイルを選択し、[ 開く] をクリックします。 注:ImageJは、マスクを関心領域に変換し、対応する蛍光画像と重ね合わせます。</li>
	<li>ROI マネージャー ウィンドウで [すべて選択] をクリックし、[測定] をクリックします。</li>
	<li>[ファイル] |名前を付けて保存... をクリックし、結果を保存します。 注:これにより、フィールド内の各コロニーのすべての形状プロパティを含む.csvファイルが作成されます。</li>
	<li>コロンオルガノイドルーメンのフォルダ内の同じ画像に対して、手順6.8〜6.12を繰り返します。</li>
	<li>OriginProをロードし、 ctrl + 3 を押して インポートウィザードを開きます。3つの ドットボタンをクリックし 、同じ画像のオルガノイドとルーメンの形状プロパティに対応する両方の.csvファイルを選択します。</li>
	<li>ルーメン形状プロパティの結果をコピーして、コロニーの結果の横にある 1 つの列に貼り付け、各ルーメン測定値がそれぞれのコロニーとペアになっていることを確認します。</li>
	<li>新しい列で、ルーメンとコロニーの領域を分割して、それを含むコロニーの相対的なルーメン面積を求めます。</li>
	<li>各コロニーの真円度とルーメン面積に対応するカラムを選択します。プロットをクリック |ベーシック 2D |スキャッター。</li>
	<li>プロットウィンドウを右クリックし、[ プロットの詳細]を選択します。 [重心(PRO)]タブ をクリックし、[ サブセットの重心ポイントを表示]、[データポイントに接続]、および [楕円を表示]というオプションにチェックマークを付けます。</li>
</ol>

細胞接着および形態学のための生体機能的自己組織化ペプチドの評価

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
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<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
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<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
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著者は、宣言する利益相反を持っていません。

生物医学研究におけるSAPの大きな可能性は、バイオファンクチャリゼーションによる順応性と適応性によって強調されています。このように広範な順列が存在するため、特にオルガノイド研究において、特定のアプリケーションで最も有望な構成を効率的に試験し、決定するという課題が生じます。迅速で費用対効果の高いソリューションが最も重要です。SW1222細胞株は、ヒト結腸直腸腺がんに由来し、このような集中的な評価の極めて重要な候補として浮上しています。ここでは、ペプチドベースのマトリックスで成長したオルガノイドの評価と特性評価の方法を紹介しました。このプロトコールは、生存率と増殖の評価、接着アッセイ、形状解析、免疫細胞化学を用いたオルガノイドのモニタリングと解析に焦点を当てた、統合的で費用対効果の高い戦略を約束します。当社の細胞培養実験におけるさまざまなペプチド濃度の選択は、特定の実験目的に沿った慎重に検討された理論的根拠によって支えられており、ペプチドマトリックスの文脈におけるオルガノイド培養の理解を深めることに大きく貢献しています。私たちの研究の旅は時間とともに進化し、さまざまな処方を探求するための多様なアプローチが必要とされています。まず、1.5 mg/mL から 4.5 mg/mL までのさまざまなペプチド濃度の利用は、さまざまな潜在的な結果を調査したいという願望に動機付けられました。低濃度を使用することで、オルガノイドの成長と発達を効果的にサポートするために必要な最小ペプチド濃度を評価することを目指しました。この情報は、費用対効果が高く、リソースが最小限に抑えられたアプリケーションの実現可能性を理解するために不可欠です。逆に、ペプチド濃度の上限とオルガノイドの挙動に対する潜在的な影響を調べるために、より高い濃度が選択され、過剰なペプチド濃度の飽和効果と潜在的な欠点に関する問題に対処しました。
第二に、具体的な実験目標が私たちの選択を導きました。例えば、細胞接着を調査する際には、ストレス下でのハイドロゲルの骨折を減少させるためにペプチド濃度を使用しました。逆に、長期的な生存率と組織の成熟に焦点を当てた研究では、ゲルを提供しながら可能な限り低いレオロジー値を達成するために、低濃度が使用されました。さらに、同様の製剤を使用した場合のオルガノイド培養で経時的に得られるさまざまなプロファイルを示すために、増殖値を選択しました。この多様なアプローチの重要性は、幅広い条件と結果を網羅する包括的なデータセットを生成する能力にあります。オルガノイド培養に対するさまざまなペプチド濃度の影響を調べることで、マトリックス特性とオルガノイドの挙動との間の微妙な相互作用をよりよく理解することができます。
初期評価では、明視野イメージングを使用して、24ウェルプレートで1週間にわたるSW1222細胞の進行をモニタリングします。形態と細胞密度の一般的な分析は、細胞株に適用されているオルガノイド株9 の日常的な手法です。このプロトコルの非侵襲的な性質により、細胞培養の観察が途切れることなく行われ、各コロニーの形態学的変化と細胞密度に関する重要なデータを取得することができます。この初期分析により、超短自己組織化ペプチドマトリックスの適合性に関する貴重な洞察を得ることができます。これらの観察結果は、さらなる詳細な分析の基礎を築き、ペプチドマトリックスが結腸直腸癌オルガノイドの開発と成長をサポートするための効果的な足場として適していることを実証しています。さらに、各コロニーの成長と変化を監視することで、興味深い観察結果が得られる可能性があります。たとえば、 図4では、マトリゲルで成長するコロニーが互いに衝突する可能性があることを観察できますが、境界は一貫して維持されているように見えます。しかし、ペプチドで培養した細胞は、7日目までに細胞の位置が以前と正確に同じではなくなるようにペプチドを再編成します。このプロトコルが、オルガノイドの成長をタグ付けして追跡する自動システムにエクスポートされた場合には、この点を考慮する必要があります。
その後の精査には、カルセインとエチジウムホモダイマーに基づく生存率アッセイを使用して、細胞の生存率と増殖を評価することが含まれます。生存率アッセイは、死細胞と比較した生細胞の集団に関する定性的な情報を提供します。増殖アッセイは、細胞分裂を評価するための細胞の代謝状態に関する定量的情報を提供する31。これらは、細胞培養で広く使用されている標準的なアッセイであり、細胞の増殖状態の一般的な概要を提供します。SAPマトリックスは生体適合性が広く実証されていますが、オルガノイドは、それらが埋め込まれているマトリックスを含む最適でない培養条件により、生存率が低下することが知られています。さらに、ペプチドマトリックスの機械的特性は、細胞の生存率に影響を与える可能性があります。マトリックスが硬すぎたり硬すぎたりすると、細胞に機械的なストレスがかかり、細胞が損傷する可能性があります。逆に、マトリックスが柔らかすぎたり不安定だったりすると、細胞の接着や生存を十分にサポートできない可能性があります。さらに、ペプチド中に存在する生理活性モチーフまたは官能基は、特定の細胞受容体またはシグナル伝達経路と相互作用し、細胞死につながる可能性があります。したがって、細胞の生存率と増殖を継続的に監視することが重要です。
以前の研究25では、ペプチド1およびペプチド2は、マトリゲルと比較して同程度の細胞死を示した(図5)。しかし、親ペプチド中の細胞の増殖プロファイルには、さまざまな濃度の変動が観察されました。特に、4日目から7日目までの増殖速度は増加するのではなく一定であり、細胞が活性の低い段階に入っている可能性があることを示唆しています。さらに、4日目と7日目の間に観察された細胞生存率の変化も比較的一貫しており、成長と繁殖の潜在的な停滞を示唆しています。
評価と特性評価を進めるために、我々は、細胞剥離効果を評価するために機械的ストレスに依存する3D培養に適応した接着アッセイを採用した32。機械的ストレスを誘発する方法は、ハイドロゲルの機械的特性に基づいて選択する必要があります。この手法の有効性は、選択したモデルシステムに本質的に結びついており、得られる洞察は、それが生物学的状況をどれだけうまく表現しているかに左右されます。接着性やオルガノイド特性のばらつきは、多くの物理的および化学的相互作用に起因する可能性があり、これらはハイドロゲルの組成やナノファイバーの接着特性などの要因によって影響を受ける可能性があります。これらの要因は、我々の知見の一般化可能性に影響を与える可能性がある33。ただし、読者がこのプロトコルをより硬いまたは高延性のハイドロゲルに適合させる場合は、より堅牢なストレス法の使用を検討してください。
この手法を利用して、生体機能モチーフによってSAPに与えられる全体的な接着性を評価しました(図6)。私たちは2つの現象を観察しました。まず、ペプチドはさまざまな初期接着特性を示しました。具体的には、IKVAVモチーフと高濃度の生体機能ペプチドを含むハイドロゲルは、その表面積の40%以上にわたって細胞を接着することがわかりました。次に、誘導ストレスの適用後、一部のペプチドでは接着細胞が著しく失われました。特に、非生物官能性ペプチドを高濃度で含むペプチドでは、保持能が比較的高かった。したがって、IKVAVリガンドとSAPは、マトリックスへの細胞の異なるタイプの接着を提供します。この手法により、材料のパターンの発見や付着メカニズムの解明が可能になります。さらに、原子間力顕微鏡を用いた接着性測定など、プローブの先端とサンプル表面との間の接着力をナノスケールで調べることができれば、材料や生体サンプルの接着特性に関する貴重な情報を得ることができます。
オルガノイド形成を誘導するさまざまなペプチド材料の能力は、コロニーの真円度と、そのようなペプチドハイドロゲルで成長したオルガノイドの相対的な内腔面積によって評価されました。真円度とは、物体の丸みや形状を指します。オルガノイドの文脈では、真円度を使用して構造の形態と対称性を評価できます。いくつかの研究で、オルガノイドの円形形態について言及されています。例えば、乳がんオルガノイドは、臍帯状の基底外側の末梢を持つ厳密な円形の形態を持つ傾向がある34。このことは、オルガノイドの形状を評価するためのパラメータとして真円度を使用できることを示唆しています。ルーメンサイズとは、オルガノイド内の中央の空洞または空間を指します。これは、オルガノイドの分化と成熟を反映するため、重要な特徴です。分化過程において、オルガノイドは内腔サイズの減少および上皮層の厚さの増加を受ける35。これは、内腔サイズがオルガノイドの発生段階の指標として使用できることを示しています。真円度と内腔サイズを評価することで、オルガノイドの構造的および機能的特性に関する貴重な情報を得ることができます。明確に定義された内腔を持つ円形オルガノイドは、天然の組織構造をより代表しており、臓器機能をよりよく模倣することができる36。
これらの特性は、以前に染色したサンプルから細胞骨格と核の蛍光画像を取得することで評価できます。画像はCellposeを使用してセグメント化され、得られたマスクの形状測定値はImageJを使用して取得されました。培養4日後の細胞骨格染色サンプルの形状解析により、オルガノイドの特性がさらに明らかになりました。形状解析に基づくオルガノイドの環境に対する応答を決定するために、主に明視野イメージングに焦点を当てた同様の方法が採用されており、画像解析36,37,38によるオルガノイドの特性の決定に基づいている。最後に、免疫細胞化学を用いて、さまざまな極性マーカーを用いた細胞極性を評価しました。特に、ペプチドハイドロゲルの使用は、マトリックスの除去およびオルガノイド39の回収を必要としないため、サンプルの取り扱いを減少させる。
この方法の重要性は、ペプチドハイドロゲルをオルガノイド培養用のマトリックスに翻訳できる方法を開発するために、他の動物由来のマトリックスと比較した生体機能SAPハイドロゲルの汎用性に依存しています。超短自己組織化ペプチドマトリックスをマトリゲルやコラーゲンなどの従来のマトリックスと比較すると、多くの利点が明らかになります。第1に、ペプチドマトリックスは、ペプチド配列を正確に制御および合成することができるため、優れた再現性を提供し、異なるバッチ40間で一貫した特性および性能を確保することができる。さらに、機械的特性と耐劣化性の点で高い安定性を示し、長期間にわたって構造的完全性を維持し、オルガノイド成長のための安定した微小環境を提供する41。さらに、超短ペプチドマトリックスにより、微小環境の精密な制御と微調整が可能になります。ペプチド配列は、特定の生理活性モチーフまたは官能基を組み込むように改変することができ、細胞分化のための所望の手がかりを提示する42。
要約すると、この方法の重要性は、オルガノイド培養を促進するためのペプチドベースのハイドロゲルの合理的な設計に情報を提供する可能性にあります。このプロトコールは、細胞の挙動を体系的に評価することにより、オルガノイドの増殖を最適化するための有望なペプチド組成の同定を促進します。このような知見は、より広範な研究分野に広がり、オルガノイドベースの研究や再生医療アプローチの進歩に貢献する態勢を整えています。

近年、自己組織化ペプチド(SAP)は、組織工学用途の有望な生体材料として浮上しています。SAPは、ナノファイバーの自然形成、生体適合性、生分解性、非免疫原性などのユニークな特性を有しており、足場開発の有力な候補となっています1。SAPはこれまで様々な種類の細胞と併用されてきましたが、特に報告されている超短SAPは、幹細胞のカプセル化を促進しながら、30種類以上の継代を網羅し、染色体異常の発生を最小限に抑えながら、幹細胞の多能性を維持しています2,3,4。したがって、オルガノイド培養での使用にSAPを適応させることは、合理的な次のステップを構成しました。
オルガノイドは、単一の多能性細胞から生じる複雑な三次元構造です。これらの構造は、さまざまな細胞タイプを生じさせ、その後、自己組織化して、in vitroでの胚成長および組織成長の発生過程を再現します5。この革新的なフレームワークは、in vivo 臓器に特徴的な遺伝的、表現型、および行動的特性を効率的に保存しながら、in vitro 研究のための強力なツールに進化しました6。それにもかかわらず、オルガノイドベースの所見のベンチからベッドサイドへの移行における主な障害は、再現性の必要性です7。この結果のばらつきは、主にヒト多能性幹細胞を特殊な細胞系譜に完全分化させることの難しさに起因しており、さらに、真正な組織構造の欠如とオルガノイドモデルに見られる固有の複雑さが加わります。幹細胞およびオルガノイドベースの研究8の人気が高まっていることから、動的な機械的特性を持つ生体材料や、分解性が制御されたインテグリン様の接着部位や足場に対する需要が高まっています7,9。これらの特性は、生物官能基化されたSAPを戦略的に活用することで効果的に調整することができます。
SAPは、明確に定義された構造に自発的に組織化する固有の能力を持つアミノ酸の短い配列です10。これらのペプチドは、多くの場合、疎水性残基と親水性残基を交互に含み、水素結合、静電相互作用、および疎水性効果11,12などの非共有結合相互作用を通じて自己組織化を促進します。これらのペプチドの自己組織化プロセスは、主にシステムの自由エネルギーを最小限に抑える必要性によって推進されます。水性環境では、疎水性の残留物は水への曝露を最小限に抑えるために集まる傾向がありますが、親水性の残留物は周囲の水分子と相互作用します。この現象は、さまざまなナノ構造の形成につながります。この場合、超短自己組織化ペプチドは、ペプチド配列および環境条件2,12,13,14,15,16に依存する特性を有するナノファイバーを形成する。これらのペプチドは、個々のペプチド鎖が互いに平行または逆平行に整列し、水素結合によって安定化されるβターンコンフォメーションを採用しています(図1)。陽イオンの存在は、ナノファイバー形成につながる自己組織化プロセスを加速します。
ペプチドナノファイバーは、大量の水を捕捉する生来の能力を有することが確認されています。この特性により、ヒドロゲルの生成が促進され、その後、細胞の増殖と成長を助長する生体適合性および生分解性の三次元空間として現れます。これらの自己組織化ペプチドナノファイバーは、天然の細胞外マトリックス(ECM)環境1に固有の地形的特徴を複雑に模倣します。この類似性は、細胞にその生理学的生息地を模倣する環境を与え、最適な細胞活動をさらに促進する17。さらに、これらのペプチドに固有の汎用性は、かなりの程度の同調性を可能にする4。このような適応性により、剛性、ゲル化速度、多孔性などのマトリックスの特性を変更することができます。これらの適応は、ペプチド配列の修飾によって達成されます。その結果、自己組織化ペプチド(SAP)は、現代の生体材料科学において極めて重要な構成要素として浮上し、組織再生および細胞培養の足場として広く使用されている13,17。
自己組織化ペプチドの重要な利点の1つは、分子レベルで容易に合成および修飾できることです。この利点により、特定の官能基または生理活性モチーフをペプチド配列に組み込むことができ、調整された特性および機能性を有するペプチドの設計が可能になります18,19,20(図1B)。例えば、生体官能性化されたSAPは、ECMを模倣し、RGDペプチド19,21を用いて分化を促進するように設計することができる。ペプチドBen-IKVAVは、そのリガンド特異的な動機により、ニューロン特異的マーカーの発現を有意に増加させることも報告されています22。これらのペプチドは、インテグリン結合ペプチドなどの生理活性分子を表示するように操作することもでき、細胞の生存を増強する23。最後に、他の生物官能化されたSAPは、それらの構造にIKVAVおよびYIGSRモチーフを含めることにより、血管新生を促進するために開発されている24。
以前の出版物で報告された生物官能性化されたSAPは、生物官能化されたSAPが由来するナイーブペプチドを含めることによって、自己組織化をさらに修飾できることを示している25。これらのSAP混合物は、生化学的活性と物理化学的特性が異なるさまざまなSAP製剤も提供できます。例えば、両親媒性ペプチドIIFKは、IKVAVモチーフの組み込みに代表されるように、さまざまなモチーフによる生体機能化に耐えることができる超短SAPです(図1B)。両方のペプチドは、単独でも組み合わせてもナノファイバーを形成することができます。各配合は、さまざまな物理的特性を持つハイドロゲルをもたらします(図2)
しかし、SAPの生物学的機能化から得られる可能性のある順列や代替法は多岐にわたるため、オルガノイド試験のための迅速で費用対効果の高いオプションを提供する必要があります。このような集中的で費用対効果の高いオルガノイド評価の候補の1つは、ヒト結腸直腸腺癌に由来するSW1222細胞株です26,27。SW1222細胞は、オルガノイドに似た3次元構造に凝集できる特性を有しており、組織発生や再生医療への応用研究に理想的なモデルです。SW1222細胞は、LGR5遺伝子27の固有の過剰発現により、オルガノイドを生成できると同定されている。個々のLGR5+幹細胞からのオルガノイドの作製は、SW1222細胞が結腸直腸癌オルガノイドの形態学的特性を達成する傾向と同様に、以前に説得力を持って示されてきた28。
この手法論文では、SW1222細胞を使用して、さまざまな生体機能ペプチドが細胞接着と内腔形成に及ぼす影響を評価および特性評価するための詳細なプロトコルを紹介します(図3)。段階的な手順とイメージング解析方法を提供することで、オルガノイドのバイオファブリケーションとオルガノイド培養のための単純なSAPマトリックスの評価に関する貴重な洞察を提供したいと考えています。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco 14190144</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート、組織培養処理済み</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド (w/v)、メタノールフリー</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート、組織培養処理済み</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルブラックプレート、組織培養処理</td><td>コーニング</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue 細胞生存率試薬</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>抗エズリン抗体、ウサギモノクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>二次使用:抗ウサギ Dylight 633</td></tr><tr><td>抗パンカドヘリン抗体、ウサギポリクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>二次使用:抗ウサギ Alexa 488</td></tr><tr><td>抗ZO1タイトジャンクション抗体、ヤギポリクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>二次使用:抗ヤギ Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Airyscan</td><td>ZEISS</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>インビトゲン</td> https://github.com/MouseLand/cellpose 共焦点レーザー走査顕微鏡から取得<td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギIgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor 488</td>, <td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr>, <tr><td>Glycine</td><td>Cytiva</td>, <td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor, 488</td>, <td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体, DyLight 633</td>, <td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清 (HI FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、六水和物 (MgCl2 6 H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>オルガノイド培養用マトリゲル、フェノールレッドフリー</td><td>のコーニング</td><td>356255</td><td>原稿ではマトリゲルまたは基底膜マトリックスとされています。</td></tr><tr><td>顕微鏡、明視野</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、EVOS</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ペプチド P (Ac,Ile,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td><td>ラボメイド</td><td>NA</td><td>ペプチドによるカスタムメイドが可能Bachemなどのメーカー。</td></tr><tr><td>ペプチドP1(Ac、Ile、Ile、Phe、Lys、Gly、Gly、Gly、Arg、Gly、Asp、Ser、NH2)</td><td>のラボメイド</td><td>NA</td><td>をBachemなどのペプチドメーカーにオーダーメイドできる。</td></tr><tr><td>ペプチドP2(Ac、Ile、Ile、Phe、Lys、Gly、Gly、Gly、Ile、Lys、Val、Ala、Val、NH2)</td><td>ラボメイド</td><td>NA</td>バ<td>ケムなどのペプチドメーカーでオーダーメイドできます。</td></tr><tr><td>ローダミンファロイジン</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>丸型カバースリップ、直径 10 mm</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>サーモフィッシャー - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 30 &mu;メートルストレーナ</td><td>シスメックス</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222 ECACC</td><td></td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 水</td><td>インビトジェン</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

超短自己組織化ペプチドマトリックス中のsw1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製とキャラクタリゼーション

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

超短自己組織化ペプチド(SAP)は、細胞外マトリックスに似たナノファイバーを自発的に形成することができます。これらの繊維は、生体適合性、生分解性、および非免疫原性のハイドロゲルの形成を可能にします。私たちは以前に、SAPがタンパク質由来のモチーフで生物官能基化されると、結腸直腸オルガノイド形成をサポートする細胞外マトリックス特性を模倣できることを証明しました。これらの生体機能ペプチドハイドロゲルは、元の親ペプチドの機械的特性、調整性、および印刷適性を保持しながら、細胞とマトリックスの相互作用を可能にして細胞接着を増加させる手がかりを組み込んでいます。この論文では、結腸直腸がんオルガノイドを費用対効果の高い方法で形成できる腺がんがん細胞株を使用して、細胞接着と内腔形成に対するさまざまな生体機能ペプチドハイドロゲルの効果を評価および特徴付けるために必要なプロトコルを示します。これらのプロトコルは、免疫染色および蛍光画像解析を使用して、細胞接着および管腔形成に対する生体機能ペプチドハイドロゲルの影響を評価するのに役立ちます。この研究で使用した細胞株は、以前に動物由来のマトリックス中のオルガノイドの生成に利用されています。

まず、24ウェルプレートで増殖した細胞を明視野イメージングを用いて7日間評価しました。 図4に示すように、週の間にオルガノイドに集合する細胞の小さなクラスターを特定しました。制御されたスキャン法は、異なる日間の細胞とオルガノイドの移動性を追跡することができます。一般的に、私たちは全週にわたって細胞の形態の進化を調べました。SW1222由来のオルガノイドは、丸い形態と明るい外観を持つ必要があります。外観が暗いほど、望ましくない細胞密度が高いことを示しており、これはペプチドP、7日目に培養したコロニーの一部に見られる(図4)。
図5 は、細胞生存率(図5A)および増殖アッセイ(図5B)の結果を示しており、これらはそれぞれ死細胞および生細胞の量および代謝活性を指し示しています。ここでは、カルセインとエチジウムのホモダイマーベースの生存率アッセイを使用し、これらの細胞をマトリゲルで培養すると、7日目までに死細胞の小さな集団が見られることに気づきました。この現象は、すべてのペプチドベースのハイドロゲルにも見られましたが、2D培養では見られませんでした。増殖の結果、1日目から7日目にかけて代謝活性が総的に増加したことが示されました。さらに、いくつかの条件で、4日目と7日目の間に活動がわずかに減少することがわかりました。この観察結果は、生存率アッセイで見られる死細胞集団の増加と相関しています (図5A)。
細胞間の相互作用とペプチドハイドロゲルの生体機能化の予備評価のために、機械的ストレスに基づく接着アッセイを実施して細胞剥離を誘導しました。 図6からわかるように、異なる濃度の生体機能ペプチドP2の使用は、剥離プロセスの前後に保持される細胞の数に大きく影響しました。ここでは、ペプチドP2の生体機能モチーフのみを含むペプチドをポジティブコントロールとして用いた。また、非生体機能ペプチドPをネガティブコントロールとして用いた。グラフからわかるように、ペプチドPに播種された細胞は、初期接着が比較的低く、保持値も低かった。さらに、生体機能ペプチドP2の比率の変化は、ストレス後に保持される細胞の量と相関していました。したがって、このアッセイを使用すると、P2ペプチドは、生体機能モチーフによって駆動される場合とされない場合があるが、混合物中に存在する生体機能ペプチドの量と相関していた細胞接着に影響を与えたと結論付けることができます。
次に、作製したオルガノイド中のマトリックスの影響を調べました。コロニーの真円度とコロニーの大きさに対する内腔の相対的な大きさを、4日間培養した細胞骨格染色サンプルの形状解析を行うことにより評価しました。データ ポイントは x 軸と y 軸に沿って特定の分布を持ち、各条件には真円度と相対ルーメン面積の特定の値を持つ重心がありました。 図7 は、2Dで培養した細胞がコロニーの真円度に非常に高いばらつきを持っていたことを示しています。対照的に、マトリゲルで培養された細胞は、内腔の相対的なサイズに対してより広範な分布を持っていました。
興味深いことに、すべてのペプチド含有ハイドロゲルの重心値は非常に類似した位置を持っていました。ただし、データ ポイント間の距離は異なる分布プロファイルを示しました。例えば、P3ペプチドは3つのペプチドハイドロゲル間での分布が小さく、非生体機能ペプチドPからのデータポイントはより大きな分布を持つように見えました。これらのデータは、P1とP3の両方を含むハイドロゲルがオルガノイド培養に最適化できる可能性があることを示唆しています。
最後に、頂端マーカーZO-1およびezrinについて染色したサンプルで免疫細胞化学を用いて、特異的マーカーの発現を評価しました。これらのマーカーにより、各オルガノイド内の細胞の分極を評価することができました。また、細胞間接合部を可視化するためのpan cadherinマーカーと、内腔を可視化するための細胞骨格特異的マーカー(phalloidin)の評価も行いました。 図8A は、4日目と7日目に非生物機能ペプチドP、生理機能ペプチドP1、およびマトリゲルに見られるオルガノイドを示しています。ZO-1およびezrinマーカーは、オルガノイドの頂端膜および基底外側膜内に局在する必要があります。適切な細胞分極により、4日目までにルーメン領域の近くで両方の分子の発現を観察することができますが、これは他の方法では見えません。実際、 図8に見られるように、ZO-1マーカーとezrinマーカーは、Matrigelで培養したオルガノイドの頂端膜に位置していました。興味深いことに、エズリンマーカーは非生体機能ペプチドPではほとんど見えませんでした。このことから、細胞の非効率的な分極がペプチドPにおけるこれらの分子の発現を低下させたと推測されます。
さらに、ペプチドハイドロゲルでは核の分散が不規則になる傾向がありましたが、マトリゲルに埋め込まれたオルガノイドは、非対称の単一の核層を形成していました。この説明は、結腸直腸オルガノイドの理想的な形態と一致します。しかし、ペプチドハイドロゲルでは核の配向が完全に非対称ではなかったものの、非生体機能ペプチドPでは、主に多層の核を持つ密度の高いコロニーが見出されました。対照的に、細胞間結合は、頂端膜および基底外側膜に対して垂直に局在する必要があります(図8B)。このマーカーにより、コロニー内にあるすべての細胞のエッジを観察することができました。Matrigelで増殖した場合、細胞は7日目までにパンカドヘリン(細胞-細胞結合)のほぼ完全に放射状に分布していました。対照的に、ペプチドPのような非分極コロニーは、細胞の乱れた配置を示し、基底膜および頂端膜付近の細胞間接合部の発現を示しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg"> 図1:ナノファイバーを形成する超短自己組織化ペプチド(A)脂肪族超短ペプチドの自己組織化過程の図。(B)IKVAVリガンドで生体官能化された超短SAP IIFKの化学構造。この図は、Loo et al.4から修正されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg"> 図2:ペプチドの構造と特性(A)親ペプチドIIFKと生体機能ペプチドP2の化学構造が示されています。(B)倒立バイアルの試験結果は、重要なゲル化濃度とゲル化時間の違いを明らかにしています。P2は、親ペプチドIIFKよりも高いCGCを持つ半透明のゲルを形成します。特に、IIFK:P2(1:1)混合物は、どちらのペプチド単独よりもさらに高いCGCと長いゲル化時間を示します。(C)走査型電子顕微鏡写真は、IIFK、P2、およびIIFK:P2(1:1)混合物の構造特性を視覚的に把握します。(D)原子間力顕微鏡の高さトポグラフィー画像は、8 mMの濃度でゲル化したペプチドを示しており、その表面の特徴を詳細に観察できます。(E)円二色性分光法により、IIFK:P2混合物の様々な濃度での立体配座変化が明らかになり、その二次構造変化が明らかになります。(F)レオロジー分析では、さまざまな濃度でのゲル化ペプチドの剛性を測定し、その機械的特性に関する貴重な洞察を提供します。この図は、Perez-Pedroza et al.25から転載しています。スケールバー = 1 μm (C)、200 nm (D)。略語:CGC =臨界ゲル化濃度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg"> 図3:ペプチドハイドロゲル中の生存率、接着性、オルガノイド形成能力、免疫染色によるオルガノイド製造および特性評価のためのペプチド調製および細胞播種を示す図<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg"> 図4:PおよびP1と標識されたペプチドハイドロゲル内で培養されたSW1222細胞から採取した明視野顕微鏡画像とマトリゲルコントロールの比較。 興味深いことに、ペプチドハイドロゲルで培養されたオルガノイドは、7日目までに主に球形の形態を示します。対照的に、マトリゲル内に位置するものは、SAPのオルガノイド培養の暗い体(黒い矢印)と比較して、明るい体からわかるように、細胞密度が低下しているようです。それにもかかわらず、それらは隣接するコロニー間に明らかなクラスタリングを示しています。さらに、マトリゲル環境内の細胞の移動能力が比較的減少していることが明らかになります。スケールバー = 650 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg"> 図5:生体機能化されたSAP中のSW1222細胞の生存率および増殖アッセイ、さまざまな濃度で (A)生体機能ペプチドP1およびP2で培養された細胞の生存率評価、マトリゲルおよび2Dと比較 (B)非生体機能ペプチドP1および生体機能ペプチドP2での細胞培養の増殖評価、マトリゲルおよび2Dコントロールと比較。ここでは、生死アッセイのためにマトリゲルで増殖する細胞と同様の挙動が見られます。死細胞(黄色の矢印)のわずかな増加は、主にマトリゲルなどのいくつかの条件で見られます。増殖については、ペプチドの種類や濃度によって傾向は異なりますが、一般的にはプラスの傾向が見られます。スケールバー = 250 μm。この図は、Perez-Pedroza et al.25から採用されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg"> 図6:分離した細胞の数に対するペプチドの影響 (A)機械的ストレスの前後にDAPIで染色された細胞の蛍光画像。ここでは、ペプチドP、修飾ペプチドP2、IKVAVモチーフを使用しています。(B)細胞接着の変化は、ImageJの被覆領域を測定することによって決定した。比較分析により、生物官能性ペプチドP2は、非生物官能性ペプチドPと比較して保持能が高いことが明らかになりました。この図は、Perez-Pedroza, et al.25から採用されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg"> 図7:内腔の相対面積と真円度の重心計算によるオルガノイド形成能力の評価。 データの重心と分散は治療によって異なりました。予想通り、最もパフォーマンスが悪かったのは2D測定の条件で、これは広範囲の真円度値で拡大し、ルーメンの相対面積が最も低かった。マトリゲルは、真円度が最も高いだけでなく、内腔も最大でした。ペプチド条件は両方の値でわずかに異なりましたが、P3条件はデータの中で最も無視できる変動を保持していました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg"> 図8:4日目と7日目のオルガノイドの各種マーカーの共焦点顕微鏡画像 (A) ZO-1(緑)、ezrin(赤)、DAPI(青)マーカーを使用して、オルガノイド内の細胞の頂端分布を見つけます。マトリゲルコントロールに見られるように、これらの分子は通常、頂端膜と基底外側膜に局在しています。非生体機能ペプチドPは、7日目までにのみこれらの分子の発現を示します。(B)パンカドヘリン(緑色)抗体で染色した細胞間接合マーカーは、オルガノイドの基底外側および頂端膜に対して垂直でなければなりません。対比染色には、細胞核(青)と細胞骨格(赤)を使用します。非生体機能ペプチドPは、他の2つの処理(P3およびマトリゲル)とは対照的に、基底外側膜での細胞間結合発現を誘導しました。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコールは、免疫染色による細胞接着、オルガノイド形態、および遺伝子発現のための生体機能的自己組織化ペプチドを評価することを目的としています。結腸直腸癌細胞株を使用して、集中的なテストのためのオルガノイドを取得する費用対効果の高い方法を提供します。

超短自己組織化ペプチドマトリックス中のSW1222細胞株由来結腸直腸癌オルガノイドの作製とキャラクタリゼーション

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

私たちの研究は、大腸がんオルガノイド培養のためのマトリックスとしての超短自己組織化ペプチドの評価を目的としています。私たちは、オルガノイドの形態学、生存率、増殖、および生体機能化の接着と影響に関する問題に取り組んでいます。ペプチドマトリックスの組成を最適化してオルガノイドの増殖を効果的に行い、再生医療に貢献することを目標としています。私たちの分野の最先端技術には、精密な有機物製造のための3Dバイオプリンティング、ダイナミックな培養環境のためのマイクロ流体プラットフォーム、原子間力顕微鏡や多光子顕微鏡などの高度なイメージングツールが含まれます。CRISPR-Cas9遺伝子編集は遺伝子改変を精製し、シングルセルRNAシーケンシングは詳細な分子洞察を提供します。現在の実験上の課題には、オルガノイドの再現性の向上、より大きなコンストラクトのための血管新生の改良、複雑な組織構造の模倣などがあります。長期培養におけるこれらの制限を克服し、免疫成分をモデルに組み込むことが積極的な領域です。標準化されたプロトコルを達成し、この分野で進行中の課題に対抗する倫理的懸念に対処する。私たちの分野での重要な発見には、オルガノイド培養に対する超短自己組織化ペプチドの適合性の実証が含まれます。私たちは、これらのペプチドの汎用性、再現性、安定性を示し、微小環境を微調整するためのプラットフォームを提供しています。これは、オルガノイドベースの研究、再生医療、および生体機能化されたハイドロゲル研究の進歩に貢献しています。私たちのプロトコールは、研究のギャップを埋めるものであり、それにより、超短自己組織化ペプチドマトリックスのオルガノイドを評価するための体系的なアプローチを提供します。これらのマトリックス内の細胞の挙動を評価するための標準化された方法の必要性に対処し、最適なオルガノイド増殖のためのペプチドベースのハイドロゲルの持続時間設計を支援し、再生医療研究を前進させます。

fabrication-characterization-colorectal-cancer-organoids-from-sw1222

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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