アデノ随伴ウイルス(AAV)と2細胞胚エレクトロポレーションを用いたラット胚のCRISPR-Cas9ゲノム編集
2024年3月15日
このプロトコルは、遺伝子修正されたラットモデルを生成するための最適化されたアプローチを提示します。アデノ随伴ウイルス(AAV)はDNA修復テンプレートの送達に使用され、エレクトロポレーションはCRISPR-Cas9試薬の送達に使用され、2細胞胚のゲノム編集プロセスを完了します。
CRISPRベースのゲノム編集ツールは、遺伝子操作されたREPモデルの作成を大幅に促進しました。CRISPRシステムは、Cas9ヌクレアーゼに対する単一のガイドRNA複合体で構成されており、ゲノム内の目的の配列を標的にして二本鎖DNA切断を作成するようにプログラムすることができます。DNA修復テンプレートの同時送達により、このDNA切断は、ホモロジー指向性修復と呼ばれるプロセスを通じて、任意の操作されたDNA配列の付加とともに正確に復元することができます。
このプロセスにより、標的DNAの挿入または置換を含むノックインラットモデルを作製することができます。このプロトコルを用いて、アデノ随伴ウイルスを用いてラット胚にDNA修復テンプレートを送達し、その後、2細胞胚エレクトロポレーションによるCRISPR Cas9複合体を送達する修正アプローチを紹介します。AAV血清型1または6は、CRISPRを介した相同性指向性修復プロセスを通じてラットゲノムに組み込まれるように設計された、遺伝子操作されたDNA修復テンプレートでパッケージ化されています。
AAVは、30マイクロリットルのラットKSOM培地に、マイクロリットルあたり7番目のゲノムコピーまでの最終濃度3 X 10で添加されます。次に、前核が見える1細胞期の胚を採取し、AAVを含む培地に移し、ウイルスの形質導入を促します。当社のプロトコルを使用すると、AAV血清型1および6が効率的なDNA修復テンプレート送達のために容易に通過できるため、透明帯を薄くする必要はありません。
胚は、5%の二酸化炭素と最大湿度で摂氏37度でAAVで一晩培養されます。翌日、1マイクロリットルあたり100ナノグラムのシングルガイドRNAと、1マイクロリットルあたり100ナノグラムのCas9タンパク質をOptiMIM培地で希釈したエレクトロポレーション混合物を作製します。混合物を室温で10分間インキュベートし、CRISPR RNP複合体を形成させます。
インキュベーション時間中に、エレクトロポレーターをオンにし、スライドガラス電極にリード線を取り付けます。RNP形成が完了した後、溶液に気泡が入らないように注意しながら、5マイクロリットルのエレクトロポレーション混合物を電極間にピペットで移します。2細胞段階にある胚は、AAVを含む培地から取り出され、電極間のエレクトロポレーション混合物に慎重に移動されます。
胚は整列し、エレクトロポレーション中に溶解を引き起こすため、どちらの電極にも触れないようにします。これは、顕微鏡で見たこの手順のビューです。また、電極間の体積が大きくなるとインピーダンスが減少することにも注意が必要です。
このため、エレクトロポレーション混合物を希釈しないように、胚と一緒に最小限の培地を移植する必要があります。次に、オーム記号の付いたボタンを押してインピーダンスを測定します。インピーダンスは0.18〜0.3オームの範囲内である必要があります。
範囲内にある場合は、スタートボタンを押すことでエレクトロポレーションが開始されます。このプロセスは数秒しかかからず、顕微鏡で見るとこんな感じです。各電極に気泡が急速に形成されていることに気付くでしょう。
エレクトロポレーションの直後に、スライドガラスから胚を採取し、新鮮なラットKSOM培地で3回洗浄します。その後、胚をin vitro研究のために培養したり、代理母の雌に移植して生きた子孫を産出したりすることができます。エレクトロポレーション後の胚の腫脹は一般的であることに注意することが重要です。
この腫れは、培養で数時間後に治まるはずです。また、エレクトロポレーション後の2つの細胞胚の最大20%で細胞融合イベントが見られることも一般的です。細胞融合は、典型的には、電極間の胚の注意深い水平軸位置合わせによって回避することができる。
ラット胚でプロトコルをテストし、培養芽球をスクリーニングして、2つのloxP部位を含む操作された短い人工イントロン配列を挿入します。胚盤胞の60%以上が、次世代の配列解析に基づいて正しく標的を絞ったノックイン対立遺伝子を含んでいることに気づきました。次に、生きたノックインラットを作製するためのプロトコルをさらにテストし、ラットDRD2遺伝子のATG開始部位を標的とするCreリコンビナーゼコーティングシーケンスをエンジニアリングするプロジェクトを設計します。
生まれた11人の子孫のうち、10人は、5つのプライムホモロジーアーム、3つのプライムホモロジーアーム、およびCreリコンビナーゼを検出するための内部PCRアッセイにわたるPCR分析によって陽性でした。7つの異なるプロジェクトの概要として、ホモロジーアームジャンクション全体のPCR解析とDNA配列検証によって決定された創始動物の平均ノックイン成功率76%を達成しました。このAAVを介したDNA送達と2細胞胚エレクトロポレーションパイプラインを使用することで、最大3KBの長さのDNA挿入において、従来のアプローチよりも大幅に高いノックイン効率を実現しました。
また、ラットの胚でこの手順の使用を実証しましたが、標的DNA挿入を生成するために他の種にも効果的に適用できる可能性があることに注意することも重要です。
概要
本プロトコルでは、CRISPR技術を用いて遺伝子改変ラットモデルを作製するための最適化された手法を提示します。DNA修復テンプレートの導入にはアデノ随伴ウイルス（AAV）を使用し、ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9試薬の導入には、2細胞期胚へのエレクトロポレーションを用います。
研究の主要構成要素
科学分野
- 遺伝子工学
- 神経科学
- モデル生物
背景
- CRISPRベースのゲノム編集ツールにより、ゲノムへの精密な修飾が可能になります。
- このシステムは、ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを用いて、標的DNA切断を誘導します。
- 相同組換え修復（Homology Directed Repair）により、設計されたDNA配列の組み込みが可能になります。
- アデノ随伴ウイルスは、DNA修復テンプレートのデリバリーメカニズムとして機能します。
研究目的
- ノックインラットモデルを作製するための改良アプローチを提示すること。
- DNA修復テンプレートの効率的な導入にAAVを利用すること。
- CRISPR-Cas9の導入におけるエレクトロポレーションの有効性を実証すること。
使用方法
- 設計されたDNA修復テンプレートを含むAAVセロタイプ1または6の導入。
- ラットの2細胞期胚へのCRISPR-Cas9複合体のエレクトロポレーション。
- 精密なゲノム編集のための相同組換え修復（HDR）の適用。
- 遺伝子組換えラットの作製における改良プロトコルの効率評価。
主な結果
- ラットゲノムへのDNA修復テンプレートの統合に成功。
- 目的の遺伝子改変を導入した標的ノックインラットモデルの作製。
- 胚編集におけるAAVおよびエレクトロポレーションの有効性の実証。
- 従来の手法と比較した本プロトコルの効率性の検証。
結論
- 改良されたプロトコルにより、遺伝子改変ラットモデルの作製効率が向上します。
- AAVおよびエレクトロポレーションは、胚におけるゲノム編集の有効なツールとなります。
- この手法は、遺伝子工学および神経科学における今後の研究を促進させることができます。
よくある質問
業界における重要性
遺伝子組換えラットモデルを効率的に作製することは、バイオ医薬品パイプラインにおけるトランスレーショナルリサーチおよび前臨床検証において極めて重要です。本プロトコルでは、AAVを介したDNA導入と2細胞期胚へのエレクトロポレーションを活用してCRISPR-Cas9ゲノム編集を効率化し、技術的障壁を低減させるとともにノックイン効率を向上させています。この手法により、予測の信頼性が高まり、ターゲット検証やメカニズム研究に不可欠な疾患関連モデルの作製が加速されます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 機能的なターゲット解析のためのノックインラットモデルを迅速に作製することが可能になります。
- 精密な遺伝子改変を容易にすることで、メカニズムの低リスク化をサポートします。
- 高効率なゲノム編集を通じて、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の表現型スクリーニングおよびアッセイ開発のための、検証済み動物モデルを提供します。
- 胚操作のばらつきを最小限に抑えることで、再現性と標準化を向上させます。
- 信頼性の高いモデル特性評価のために、定量的なジェノタイピング出力を提供します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナル・バイオマーカー研究のための、疾患関連ラットモデルの作製を可能にする。
- 遺伝学的発見からin vivoでの前臨床検証までの継続性を促進する。
- 堅牢なin vivoデータを提供することで、リスク調整後の進展判断を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、仮説検証およびリード化合物のバリデーションに向けた遺伝子改変モデルを効率的に作製することを可能にし、創薬探索から前臨床試験に至る一連の流れに統合されます。
- 探索生物学：標的ゲノム編集により、仮説検証とパスウェイの解明を加速させます。
- スクリーニング：アッセイへの適用および化合物評価のための、再現性のある動物モデルを提供します。
- 分析：モデル検証のための定量的なジェノタイピングおよびシーケンシング結果を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患に関連するin vivoシステムを用いて、探索段階と前臨床段階を橋渡しします。
- エンタープライズ再利用：多様な遺伝学的モデルを生成するための、拡張可能で再利用可能なワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：予測の信頼性を高め、ターゲット検証におけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用の価値：ワークフローを効率化し、再現性を向上させ、必要とされる技術的スキルを最小限に抑える。
- 戦略的価値：より迅速なgo/no-go判断を可能にし、後期段階における生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けと、プログラム全体における効率的なリソース配分を支援する。
実施上の考慮事項
- 胚の取り扱いおよびCRISPR-Cas9試薬の調製に関する専門知識が必要です。
- エレクトロポレーション装置およびAAV作製設備へのアクセスが必要です。
- 再現性のある胚の整列およびエレクトロポレーションパラメータを確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- 種特有の胚の特性を考慮することで、他の種への適用が可能です。
- 細胞融合の発生や胚の腫脹の可能性があるため、慎重な手順制御が必要です。
