Name: 樹冠形成ジャイアントケルプの野外採集と実験室でのメンテナンスによる修復促進 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 学ぶ「グリーングラベル」法によるMacrocystis pyriferaの野外採集と実験室培養プロトコル。温度・光条件の制御、培地交換、スポロフィル処理の詳細な手順を解説し、海藻林修復研究に有用なリソースを提供します。

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この研究は、JBLとMESBにカリフォルニア・シー・グラント・ケルプ回復研究プログラムR/HCE-17、PDDに全米科学財団研究研修生賞DGE-1735040、ザ・ネイチャー・コンサーバンシー、シュミット・マリン・テクノロジー・パートナーズ、サステナブル・オーシャン・アライアンス、AP-Lにティンカー財団、RBLとJLに気候科学アライアンス・バハ・ワーキング・グループから資金提供を受けました。カリフォルニア大学アーバイン校のスティーブン・アリソン氏、カスケード・ソーテ氏、サマンサ・カニンガム氏、サム・ウェーバー氏、ケイトリン・イー氏に感謝します。カリフォルニア大学サンタクルーズ校のマーク・カー、ピーター・ライモンディ、サラ・エミンハイザー、アン・カプシンスキー。ウォルター・ヘディとノラ・エディ、ザ・ネイチャー・コンサーバンシー。フィリペ・アルベルトとガブリエル・モンテシノス(ウィスコンシン大学ミルウォーキー校)ホセ・アントニオ・ゼルトゥチェ・ゴンザレス、アレハンドラ・フェレイラ・アリエタ、リリアナ・フェレイラ・アリエタ(バハ・カリフォルニア自治大学)MexCalのLuis Malpica-Cruz、Alicia Abadía-Cardoso、Daniel Díaz-Guzmán。MexCalitosダイバーのアレハンドラ・レイエス、モニカ・ペラルタ、テレサ・タベラ、ジュリア・ナバレッテ、アイノア・ビラルタ、ジェレミー・バウアー、アルフォンソ・フェレイラ。技術的なアドバイスについては、Nancy Caruso氏もサポートしてくれました。バハ・カリフォルニア自治大学オセアノロギカス研究所(Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California)には、水浴システムの開発に使用された施設を提供していただいたことに感謝します。アイラ・スピッツァー氏の水中およびドローン動画コンテンツに感謝します。

著者は何も開示していません。

人為起源の気候変動は、世界の海洋の健全性に対する脅威を増大させており44,45,46,47,48、その結果、大きな攪乱と生物多様性の損失49,50,51,52を引き起こしています。劣化した生態系の回復を加速させるため、国連は2021年から2030年を「国連生態系回復の10年」と宣言し、海洋の健全性の悪化を逆転させることを目的とした「持続可能な開発のための国連海洋科学の10年」と時を同じくしている53。この世界的な行動喚起に沿って、ケルプ・フォレスト・アライアンスは、2040年までに100万ヘクタールを回復し、300万ヘクタールの昆布林を保護するというケルプ・フォレスト・チャレンジを立ち上げた54。海洋の回復は過小評価されており55、昆布の生態系は、サンゴ礁、マングローブ林、海草藻場などの生息地に比べてかなり注目されていません56。劣化した生態系の回復は海洋生態系の再構築に効果的であることが示されているが、平均して1ヘクタールあたり80,000ドルから1,600,000ドルの費用がかかる可能性があり、総費用の中央値は2〜4倍になる可能性が高い57。現在および予測される損失は、緊急の保全介入として、スケーラブルで実現可能かつ費用対効果の高い昆布修復方法論の開発を必要としています。
現在の昆布の修復作業では、成体の昆布の移植、遊走子や配偶体の直接播種、放牧者の管理、人工サンゴ礁の設置など、昆布の損失のサイト固有の要因に対処するために、さまざまな方法論を組み合わせて使用しています11。ただし、これらの方法はかなりのリソースを必要とし、スケーラビリティが制限されます。成体の昆布の典型的な移植では、潜水士が底生生物に人工的な材料や構造物を手間をかけて配置する必要があります。競争相手や放牧者の管理など、沿岸の岩礁を再建するためのボトムアップの介入も、これらの生物的ストレス要因の手動の水中除去または排除に依存しているため、人件費によって制限されます11。 「グリーングラベル」 技術は、水面からの簡単な展開でこれらの制限を克服し、水中での設置や技術的な知識を必要とせず、比較的低コストでスケーラビリティを実現します28。この革新的なアプローチは、有望な修復ツールを提供し、その可能性を最大限に引き出すために、さまざまな場所や環境での広範な試行を促します32。
ノルウェーの保護されたフィヨルドでは、サトウキビ(Saccharina latissima26)を用いた「緑の砂利」による修復作業の成功が報告されていますが、この技術は、東太平洋のMacrocystis pyriferaの試験段階にあります。M. pyrifera のアウトプラントの生息範囲内での予想される生存率に対処するには、追加の試験が必要である。M. pyrifera の生育に典型的な波にさらされた条件では、小さな砂利は動きや摩耗を起こしやすく、外植植物の損傷につながる可能性があります。さらに、M. pyrifera のガスで満たされた肺嚢胞がもたらす正の浮力は、「緑色の砂利」の外植が修復場所から効果的に運び去られることにつながる可能性があるため、この種の砂利のサイズと重量は探索すべき重要な要素です。最近のパイロット研究(2022年5月;Ensenada, Baja California, Mexico)では、M. pyriferaによる野外での予備的な成功が観察されており、周囲の基質へのハプテラ付着と、野外で2か月後に体長1.2mに達する稚魚の成長が示されています(図4)。これは、東太平洋のM. pyriferaに「緑の砂利」を利用する上で、まだ探求されていない明確な機会を示しています。このビデオでは、M. pyrifera による「グリーン グラベル」技術を紹介しており、修復の培養段階における既存の慣行を簡素化および一元化して、さまざまなフィールド環境における成功と限界に対処する研究を支援する貴重なリソースです。
「グリーングラベル」技術では、成体植物でのより一般的な移植アプローチと比較して、成功の確率を高める可能性のあるスケールで、多くの小さな個々の砂利ユニットを播種することができます。ただし、この技術のスケーラブルな重要な側面は、水面からの単純な展開であり、ボートによる広い領域の復元を容易にすることができます。小さい砂利の配置が適していない分野の設定のために、このプロトコルは、より大きな砂利や小さな岩、天然または展開された水中アンカーに結ぶことができるストリング、またはより露出した条件で海底に海洋エポキシを使用してボルトで固定または接着できるタイルなど、幅広い基質に M.ピリフェラ を移植するために適応させることができます。これらの導入適応は、 M. pyrifera の培養に必要な施設を変更するものではありませんが、その後の展開コストを増加させます。
人為起源の撹乱と気候変動は、現在、自然個体群の適応能力を克服しています。これは、生態系を歴史的な状態に戻す伝統的な保全活動に大きな課題を提起します58、59、60、61、62、63。したがって、保全の枠組みは、回復力と適応能力を考慮した予測的管理を含むように拡大した64。森林生態系の樹種に対しては、気候変動に対処するための予測的管理が実施されており65、アウトプラントの進化的可能性を高めるためのさらなる回復努力が提案されている66,67。これらの戦略は本質的に陸上環境での操作が容易であるが、いくつかの研究が海洋環境での応用を模索し始めている62,68,69,70。たとえば、サンゴ礁は、前例のない減少をもたらした多数の人為的ストレス要因によって脅かされています71,72。これらの重要な基盤種の喪失に対応して、残っているサンゴ礁とそれに関連する機能を保護するための積極的な回復と適応支援技術がますます提唱されています62,73,74。1つの手法は、熱ストレスに対する耐性を高めるために、現在の種の分布範囲内に個体を移動させることである75。樹冠を形成する昆布の復元に関して、「緑の砂利」は、回復力のある遺伝子型の脆弱な地域への転座、交雑などの非遺伝的操作、または個体の環境ストレスへの順応などの適応支援技術を探求するためのカスタマイズ可能なフレームワークを持っています62。
昆布の生態系保全の成功を維持するためには、地元の支援を活用して回復の取り組みを強化することが不可欠です。地元の利害関係者を巻き込むことで、回復ニーズに対する地元の賛同を高め、沿岸の管理を促進し、その結果、資金の増加と昆布の生態系保護の寿命を延ばすことができます。他のすべての昆布再生方法論と同様に、多様な生態学的、社会経済的、保全目標を統合した構造化された意思決定の枠組みは、昆布の生態系とそれらがサポートするコミュニティにとって最適な結果を達成するのに役立ちます11。

林冠を形成するケルプ(Laminariales目の褐色大型藻類)は世界的に重要な基盤種であり、温帯海と北極海の沿岸の岩礁を支配しています1。これらの昆布は、昆布の森として知られる構造的に複雑で生産性の高い生物起源の生息地を形成し、分類学的に多様な海洋群集を支えています2。世界中の昆布の森は、商業漁業生産、炭素と栄養素の循環、レクリエーションの機会など、人間に多くの生態系サービスを提供しており、年間5,000億米ドルの推定価値があります3。
昆布の森は、その価値が高いにもかかわらず、多くの地域で人為的な圧力の高まりに直面しています3。気候変動は、長期的な海洋温暖化と気温異常の頻度の増加により、昆布にとって最も重大な脅威の1つとなっています3,4,5,6,7。海水温の上昇は栄養塩の制限と関連しており8、生理学的閾値を超える熱ストレスへの曝露は死亡率9をもたらす可能性がある。地域的なストレス要因7の変動と相まって、昆布の個体数は世界的に年間約2%ずつ減少しており10、特定の地域では大幅な減少と代替のコミュニティ国家への持続的な移行が続いています6,11,12,13,14。昆布個体群の自然回復だけでは、現在および予測される損失の程度を逆転させるのに十分ではない可能性があり15,16,17,18、積極的な回復の重要性を強調しています。
現在の昆布の回復活動では、これらの重要な基盤種を沿岸の岩礁に再建するために、さまざまな方法論を組み合わせることができます3,19。サイト固有の懸念に対処するために選択される方法論は、地理的な状況、昆布の回復に対する特定の障害、および社会生態学的状況によって異なります11。社会生態学的システムのつながりと相互依存を理解することが鍵であり、地元の機関を巻き込み、地域社会からの支援を集める介入は、修復努力が成功する可能性を高めます20。
気候変動に加えて、草食動物の圧力または種間競争が回復を促進、減少、または抑制する(例えば、ウニ13、草食魚21,22、芝藻9,23、または侵略的藻類24)。修復は、これらの生物的ストレッサーの除去に焦点を当てるかもしれないが、これらの方法は相当な資源と継続的なメンテナンスを必要とする11。昆布種の回復を促進するために、例えば、繁殖力のある昆布の刃で満たされたメッシュバッグと、遊走子を環境に放出する底生生物の重さを量るなど、直接的な播種アプローチに向けた取り組みが行われてきた26。ただし、この方法は時間がかかり、水中での技術的な設置と取り外しが必要です。他の症例は、大量の成体ドナー植物の移植に焦点を当てており、これは密接に関連した脆弱なドナー集団を危険にさらす可能性があり、継続的な移植に依存しているため、小規模に限定されることがよくあります27。
昆布の胞子の限界が生息地の分断により昆布の森の回復を妨げている可能性がある地域では、「グリーングラベル」技術と呼ばれる比較的新しい昆布再生アプローチが導入されました。この技術は、ノルウェー南部のFlødevigen研究所で成功裏に試行され28、費用対効果と拡張性により、修復のための有望な選択肢となりました。この技術のワークフローは次のとおりです:(1)胞子溶液は、野外で生殖可能な成体の昆布から収集された肥沃な組織から作成され、砂利などの小さな基質に播種されます。(2)初期段階の昆布は、基質上で実験室で管理された非生物的条件で飼育されます。(3)胞子体が目に見える基質は、胞子体が成長し続ける 「緑の砂利」 として特定のサンゴ礁に展開されます。成人の典型的な移植作業は、ダイバーによる手間とコストのかからない水中設置を必要とし、「グリーングラベル」技術は、水面からの単純な展開を使用することに留意されたい28。
「グリーングラベル」技術は、現在、さまざまな環境といくつかの層状昆布種にわたる多数の国際ワーキンググループ29のメンバーによって試されています。このプロトコルでは、ジャイアントケルプであるMacrocystis pyriferaを使用してこの修復技術を野外に展開する前に、組織の収集、胞子形成、播種、飼育条件、定期的なメンテナンス、および初期段階の昆布のモニタリングに必要な施設、材料、および方法について説明します。このプロトコルは、さまざまなフィールド設定でのM.ピリフェラを使用したこの方法の成功と限界についての洞察を提供しようとしている研究者、管理者、および利害関係者にとって貴重なリソースです。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SCGPS05RE</td><td>天然海水殺菌</td></tr><tr><td>1 Lガラス瓶</td><td>アマゾン</td><td>B07J6JP4D1</td><td>天然海水殺菌</td></tr><tr><td>1 & マイクロ;mフィルター(水+空気)</td><td>アマゾン</td><td>B01M1VWUWL</td><td>天然海水滅菌</td></tr><tr><td>1 '' PVC 90度エルボー</td><td>ホームデポ</td><td>203812125</td><td>オプション2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>10 & マイクロ;mフィルター</td><td>アマゾン</td><td>B00D04BG56</td><td>天然海水滅菌</td></tr><tr><td>20&micro;mフィルター</td><td>アマゾン</td><td>B082WS9NPH</td><td>天然海水滅菌</td></tr><tr><td>3x5mmチューブ</td><td>アマゾン</td><td>B0852HXPN6</td><td>オプション1 スモールスケール-インキュベーター</td></tr><tr><td>4x4インチ 滅菌ガーゼ</td><td>アマゾン</td><td>B07NDK8XM3</td><td>胞子形成</td></tr><tr><td>4x6mmチューブ</td><td>アマゾン</td><td>B08BCRV1FY</td><td>オプション1 スモールスケール-インキュベータ</td></tr><tr><td>ー5 & マイクロ;mフィルター</td><td>アマゾン</td><td>B082WS9NPH</td><td>天然海水滅菌</td></tr><tr><td>50mLファルコンチューブ</td><td>アマゾン</td><td>B01M04HGPJ</td><td>胞子形成</td></tr><tr><td>8x10mmチューブ</td><td>アマゾン</td><td>B01MSM3LLZ</td><td>オプション1 スモールスケール-インキュベーター</td></tr><tr><td>エアフィルター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MTGR85010</td><td>オプション1 スモールスケール-インキュベーター</td></tr><tr><td>アルコールランプ</td><td>アマゾン</td><td>B07XWD9WWC</td><td>胞子形成</td></tr><tr><td>アンモニウム鉄(II)硫酸塩六水和物ACS試薬、99%</td><td>シグマ</td><td>215406-100G</td><td>プロバソリを作成するための化学物質メディア強化のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>水族館グレード砂利</td><td>アマゾン</td><td>B07XRCKFBJ</td><td>オプション1小規模-インキュベーター</td></tr><tr><td>ビオチン粉末、BioReagent、細胞培養に適した、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、99%</td><td>シグマ</td><td>B4639-100MG</td><td>化学物質Provasoli 'を作成するメディア濃縮</td></tr>ホ<tr><td>ウ酸、99.8%、10043-35-3、MFCD00011337、BH3O3、61.83、500g</td><td>サーモフィッシャー</td><td>5090113707</td>化学薬品のための濃縮海水(PES)とビタミン<td>Provasoli 'メディア濃縮カルシウム</td></tr><tr><td>D-パントテン酸カルシウム、ge98.0%(T)、C9H17NO5,137-08-6,25g、D-パントテン酸カルシウム塩、P0012-25G 1 / EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>P001225G</td><td>Provasoliを作成するための化学物質のための濃縮海水(PES)とビタミンメディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>チェックバルブ</td><td>アマゾン</td><td>B08HRZR4MM</td><td>オプション1 小規模 - インキュベーター</td></tr><tr><td>クリアチューブ 3/8インチ - 10フィート</td><td>アマゾン</td><td>B07MTYMW13</td><td>オプション 2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G、警告 - カリフォルニア州 - ガンハザード、93-2749-100G 1/EA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>5090114752</td><td>Provasoli'を作成するための化学物質s メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>カメラ付き複合顕微鏡</td><td>OMAX</td><td>M83EZ-C50S</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>培養フラスコ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>07-250-080</td><td>オプション1 小規模 - インキュベーター</td></tr><tr><td>カルチャーライト</td><td>Amazon</td><td>B07RRRPJ63</td><td>オプション1 スモールスケール - インキュベーター</td></tr><tr><td>カルチャーストッパー</td><td>Amazon</td><td>B07DX6J7QD</td><td>オプション1 小規模 -インキュベータ</td></tr><tr><td>ー排水コネクタ</td><td>Amazon</td><td>B00GUZ6CV0</td><td>オプション 2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>EDTA CAS 番号: 6381-92-6 分子式: C10H14N2O8Na2- 2H2O 分子量: 372.2</td><td>サーモフィッシャー</td><td>50213299</td><td>プロバソリを作成するための化学薬品メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>Eisco Safety Pack メスシリンダーセット クラスA、ASTM、容量:10 mL、25 mL、50 mL、目盛り:0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、ホウケイ酸3.3ガラス、オートクレーブ可能:はい、クラス:クラスA、目盛り付き:はい、許容範囲:0.10 mL、0.17 mL、0.25 mL</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS81273</td><td>Provasoliを作成するための化学物質s 濃縮海水(PES)と培地濃縮用ビタミン</td></tr><tr><td>Eisco Safety Pack メスシリンダーセット クラスA、ASTM、容量:50 mL、100 mL、250 mL、目盛り:1.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、ホウケイ酸3.3ガラス、オートクレーブ可能:はい、クラス:クラスA、目盛り付き:はい、許容範囲:0.25 mL、0.50 mL、1.0 mL</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS81275</td><td>Provasoliを作成するための化学物質メディアエンリッチメントのための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>Eisco Safety Pack容量フラスコセット - クラスA、ASTM、容量:10 mL、25 mL、50 mL、ホウケイ酸3.3ガラス、オートクレーブ可能:はい、クラス:クラスA、クロージャー材質:ガラス、クロージャーサイズ:ストッパー番号:9、9、13、クロージャータイプ:ペニーストッパー、卒業:Ye</td><td>Thermo Fisher</td><td>S81271</td><td>Provasoliを作成するための化学薬品s 濃縮海水(PES)とビタミン(培地濃縮用</td></tr><tr><td>) フィルターホルダー</td><td>Amazon</td><td>B07LCKBKCT</td><td>天然海水滅菌</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドのメスシリンダー、容量:500 mL、目盛り:5 mL、ホウケイ酸ガラス、オートクレーブ可能:はい、エラーの制限:+/-4.0 mL、推奨アプリケーション:教育、細分化:5 mL、S63460 1/EA</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS63460</td><td>Provasoli'を作成するための化学物質メディアエンリッチメントのための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>FLEXACAM C1カメラ</td><td>ライカ</td><td>FLEXACAM C1</td><td></td></tr>モニタリング <tr><td>葉酸, C19H19N7O6, CAS番号59303, ビタミンm, プテロイルグルタミン酸, ビタミンb9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, 葉酸, 葉酸, 25g, 100781, CHEBI:27470, 黄色からオレンジ, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AAJ6083314</td><td>Provasoli'を作成するための化学物質メディアエンリッチメントのための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>フリースタンディング20ガロンユーティリティシンク</td><td>アマゾン</td><td>B094TLH19L</td><td>オプション2-中規模-ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>二酸化ゲルマニウム99.99 10GR</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AC190000100</td><td>プロバソリを作成するための化学薬品メディア濃縮ガラス</td></tr><tr><td>メスシリンダー、クラスAラウンドベース、Eisco、使用対象:測定液体、容量:1000mL、目盛り:10mLホワイト、CH0344OWT 1 / EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>S88442</td><td>Provasoliを作成するための化学薬品メディアエンリッチメントのための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>アマゾン</td><td>B00L1S93PS</td><td>オプション 2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>グリセロール リン酸 二ナトリウム 塩水和物 異性体混合物</td><td>シグマ</td><td>G6501-100G</td><td>プロバソリを作成するための化学薬品s 濃縮海水(PES)とビタミン 培地濃縮用</td></tr><tr><td>成長容器 -3.4 Qt- 3.25 Lt 透明容器 透明蓋付き</td><td>コンテナストア</td><td>#10014828</td><td>オプション 2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>成長光</td><td>アマゾン</td><td>B086R14MFW</td><td>オプション 1 小規模 - インキュベーター</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>アマゾン</td><td>B07TJQDKLJ</td><td>胞子形成</td></tr><tr><td>ヒンジ付きプラスチック瓶</td><td>SKSボトル&包装</td><td>40280125.01S</td><td>オプション 1 小規模 - インキュベーター</td></tr><tr><td>イノシトール研究グレード、USP/NF 細菌学用。光学的に非アクティブです。組織培養への適合性について試験済み。サイズ - 100G 保存条件 - +15 C TO +30 C カタログ番号 - 26310.01 CAS 87-89-8</td><td>サーモフィッシャー</td><td>50247745</td><td>プロバソリを作成するための化学薬品メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>インスタントオーシャン - 50 G</td><td>アマゾン</td><td>B000255NKA</td><td>オプション 1 小規模 - インキュベータ</td></tr>ー<tr><td>倒立顕微鏡 ライカ DMi1</td><td>ライカ</td><td>DMi1</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>鉄 (III) 塩化物六水和物 ACS 試薬、97%</td><td>シグマ</td><td>236489-100G</td><td>プロバソリを作成するための化学薬品メディアエンリッチメントのための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>Licor Ligth Meter データロガー</td><td>Licor</td><td>LI-250A</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>光/温度 HOBOデータロガー</td><td>Amazon</td><td>B075X2SWKN</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>ライト 150W</td><td>Amazon</td><td>B0799DQM9V</td><td>オプション2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>硫酸マンガン一水和物はUSPテスト仕様を満たしています</td><td>シグマ</td><td>M8179-100G</td><td>はProvasoli'を作成するための化学物質メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>中型岩2-3インチ、20ポンド</td>ホーム<td>デポ</td><td>206823930</td><td>オプション2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>ニコチン酸、99%、C6H5NO2、CAS番号59676、ダシル、アペラグリン、アシダムニコチン、アコチン、3カルボキシピリジン、ナイアシン、3ピリジンカルボン酸、ニコチン酸、ペラグリン、ワンポキャップ、250g、109591、CHEBI:15940、1.4、2004410、293度。C (559 度F)、123.11、</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AAA1268330</td><td>ケミカルズプロバソリを作成するためにメディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr>p<tr><td>-アミノ安息香酸99.82%4-アミノ安息香酸、C7H7NO2、CAS番号:150-13-0、25g、0210256925 1 / EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>ICN10256925</td><td>Chemicalsを作成してProvasoli 'メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>PCVセメント</td><td>アマゾン</td><td>B001D9WRWG</td><td>オプション2-中規模-ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>プラスチックウォーターバルブ</td><td>アマゾン</td><td>B0006JLVE4</td><td>オプション2-中規模-ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>プラスチックウォーターバルブ</td><td>アマゾン</td><td>B07G5FY7X1</td><td>オプション2-中規模-ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>精密スケール1mg</td><td>アマゾン</td><td>B08DTH95FN</td><td>Provasoli'を作成するための材料メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>ろ過された空気のためのポンプ</td><td>アマゾン</td><td>B0BG2BT9RX</td><td>オプション1 小規模-インキュベーターPVC</td></tr><tr><td>チューブ 1x24''</td><td>ホームデポ</td><td></td><td>202300505オプション2 -中規模-ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>量子光度計</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>冷蔵インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15-103-1566</td><td>オプション 1 小規模 - インキュベーター</td></tr><tr><td>ラバーグロメット</td><td>アマゾン</td><td>B07YZD22ZP</td><td>オプション 1 小規模 - インキュベーター</td></tr><tr><td>塩分屈折計</td><td>ATC</td><td>B018LRO1SU</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>シェードメッシュ 6x50 ft</td><td>ホーム デポ</td><td>316308418</td><td>オプション 2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>硝酸ナトリウム ge 99.0% 硝酸ナトリウム、ナトリウム塩、NNaO3、CAS 番号: 7631-99-4、500g、1/EA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BP360500</td><td>ケミカルズがProvasoliを創設s 濃縮海水(PES)とビタミン メディア濃縮用</td></tr><tr><td>エアレーション開口部のはんだ付け</td><td>Amazon</td><td>B08R3515SF</td><td>オプション2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>スプレーイスポロピルアルコール</td><td>Amazon</td><td>&lrm;B08LW5P844</td><td>Sporulation</td></tr><tr><td>ステンレス鋼はさみ</td><td>Amazon</td><td>B07BT4YLHT</td><td>Sporulation</td></tr><tr><td>ステンレス鋼トレイ</td><td>Amazon</td><td>B08CV33YXG</td><td>Sporulation</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ツイザー</td><td>Amazon</td><td>B01JTZTAJS</td><td>Sporulation</td></tr><tr><td>攪拌棒</td><td>Amazon</td><td>B07C4TNKXB</td><td>Provasoli を作成するための材料メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>水中循環ポンプ 400 GPH</td><td>アマゾン</td><td>B07RZKRM13</td><td>オプション2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>水中球状量子センサー</td><td>ワルツ</td><td>US-SQS/L</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>温度ガン</td><td>赤外線温度計 749</td><td>B07VTPJXH9</td><td>モニタリング</td></tr><tr><td>チアミン塩酸塩BioReagentは、植物細胞培養に適した、昆虫細胞培養</td>に適した、Provasoli'を作成するための<td>化学物質Sigma</td><td>T1270-25G</td><td>に適していますメディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>チミン99%2、4-ジヒドロキシ-5-メチルピリミジン、C5H6N2O2、CAS番号:65-71-4、25g、157850250 1 / EA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>のAC157850250</td><td>プロバソリを作成するための化学物質メディアエンリッチメントのための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>透明アクリルシート24x48インチ</td><td>ホームデポ</td><td>202038048</td><td>オプション2-中規模-ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>チューブ水循環1''x10フィート</td><td>アマゾン</td><td>B07ZC1PSF3</td><td>オプション2-中規模-ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>自然海水滅菌のためのUVライトアマゾン</td><td></td><td>B018OI7PYS</td><td>天然海水滅菌</td></tr><tr><td>バカムポンプ</td><td>アマゾン</td><td>B087XBTPVW</td><td>天然海水滅菌</td></tr><tr><td>ビタミンB12バイオ試薬、細胞培養に適した、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、98%</td><td>シグマ</td><td>V6629-100MG</td><td>化学物質を作成してProvasoli 'を作成しますメディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>容積フラスコ、クラスAガラス、Eisco、ポリプロピレンストッパー付き、目盛り付き、ホワイトプリントマーキング、容量:1000 mL、CH0446IWT 1 / EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>S89446</td><td>Provasoliを作成するための化学薬品メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>容積フラスコ、クラスAガラス、Eisco、ポリプロピレンストッパー付き、目盛り付き、ホワイトプリントマーキング、容量:500mL、CH0446HWT 1 / EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>S89445</td><td>Provasoliを作成するための化学薬品メディア濃縮のための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr><tr><td>ウォーターチラー 200-600GPM</td><td>アマゾン</td><td>B07BHHP71C</td><td>オプション2 - 中規模 - ウォーターバスシステム</td></tr><tr><td>4x6mmチューブ用Yスプリッター</td><td>アマゾン</td><td>B08XTJKFCH</td><td>オプション1 小規模 - インキュベーター</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛七水和物バイオ試薬、細胞培養に適しています</td><td>シグマ</td><td>Z0251-100G</td><td>Provasoli'を作成するための化学物質メディアエンリッチメントのための濃縮海水(PES)とビタミン</td></tr></tbody></table>

樹冠形成ジャイアントケルプの野外採集と実験室でのメンテナンスによる修復促進

Field Collection and Laboratory Maintenance of Canopy-Forming Giant Kelp to Facilitate Restoration

樹冠を形成する昆布は、生物多様性を支え、年間5,000億米ドル以上の価値がある生態系サービスを提供する重要な基盤種です。気候変動による生態学的ストレス要因によるジャイアントケルプの森の世界的な減少は、革新的な回復戦略の必要性を浮き彫りにしています。「グリーングラベル」として知られる新しい修復技術は、水中での大規模な労働力なしに広い範囲に若い昆布を播種することを目的としており、費用対効果と拡張性から有望な修復ツールとなっています。このビデオ記事では、ジャイアントケルプ( Macrocystis pyrifera)を培養するためのプロトコルとツールを紹介します。また、現場でのこの方法の成功と限界に対処するためのさらなる研究のためのリソースも提供します。「グリーングラベル」技術を使用して、生殖組織を収集し、胞子を胞子し、接種し、飼育し、維持し、および監視するためのフィールドおよび実験室ベースの方法を概説します。このプロトコルは、この分野における現在の修復慣行を簡素化および一元化し、研究者、管理者、および利害関係者が昆布保護の目標を達成するのをサポートします。

「グリーングラベル」の修復技術はまだ試験段階にあり、他の種のアウトプラントの生存データは限られており28、 Macrocystis pyriferaの公開データはまだありません。このプロトコルで概説されている野外採集と実験室でのメンテナンスを使用して、仮想的な 「グリーングラベル」 の展開の前に、2つの異なるドナーケルプ個体群のサイト固有の飼育条件の重要性をテストしました(図5)。米国カリフォルニア州において、寒冷なK1(北緯36.60167度、西経121.88508度)と温暖なK4(サンディエゴ、北緯32.85036度、西経-117.27600度)の個体群から昆布組織を採取し、(1)12°C(海藻養殖の標準養殖温度、K1の冬季平均海面水温)、(2)20°C(K4の夏季平均海面水温、 K1)の4°Cの熱波)。昆布のライフステージの発達をモニタリングするスライドガラスには、すべて標準化されたグリッドを付し、このグリッドを基準として高解像度の画像を撮影し、倒立顕微鏡とカメラ(N=5枚/サンプル、2.479mm×1.859mm)による定時的な視野の観察を可能にしました。
胞子形成後24日後、顕微鏡画像(60サンプルからN=300画像)から配偶体をカウントした。配偶体数の違いを検定するために、パッケージglmmTMB41の関数glmmTMB()を使用してポアソン分布で一般化線形混合効果モデルを採用し、Rのパッケージemmeans42のemtrends()を使用してペアワイズ比較を行いました。我々の結果は、熱変動に対する配偶体の応答がK1集団とK4集団(t = 2.7、p = 0.007)で異なっており、温度は暖かいK4集団には影響を及ぼさなかった(推定値 = -0.01、標準誤差[SE] = 0.01、信頼区間[CI] = [-0.03, 0.01])、低温のK1集団には効果があった(推定値= -0.06, SE = 0.02, CI = [-0.10, -0.03])(図6A)であり、熱耐性形質の適応的発散の可能性を示唆している。昆布配偶体は、しばしば抵抗段階43として描かれ、ストレス耐性があり、環境変動に比較的鈍感な万能表現型を生成することを意味します。しかし、これらの結果は、この初期段階では熱変動が大きな圧力を課すことを示しています。
胞子形成後32日後、約1mmを超える長さの目に見える胞子体を、2.5cm×7.5cmのスライドガラス(N = 72サンプル)ごとにカウントしました。目に見える胞子体数の違いを検定するために、パッケージglmmTMBの関数glmmTMB()を使用してポアソン分布で一般化線形混合効果モデルを採用し、Rのパッケージemmeansのemtrends()を使用してペアワイズ比較を行いました。我々の結果は、熱変動に対する胞子体の応答が、K1とK4の分化した集団(z = 0.92、p = 0.36)の間で類似しており、温度は暖かいK4集団(推定値 = -0.66、SE = 0.04、CI = [-0.74、-0.57])と低温のK1集団(推定値 = -0.85、SE = 0.13、CI = [-1.10, -0.60])に影響を与えたことを示しています(図6B)).20°Cで飼育したサンプルは、12°Cで飼育したサンプル(平均± SE = 82.4 ± 9.8)と比較して、目に見える胞子植物をほとんど成長させませんでした(平均±SE = 0.4 ± 0.2)。この結果は、胞子体産生は配偶体期よりも温度に敏感であり、プロトコルで概説されているように胞子体の発生を達成するためには、部位特異的な培養温度が15°Cを超えてはならないことを示唆しています。
<img alt="成長チャンバー内の植物成長実験のセットアップ。制御された雰囲気ジャー、チューブ、センサーが含まれます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:「 グリーングラベル」 インキュベーターシステムの図。 (A)配偶体培養物を栄養増量するための赤色光源。(B)外部コンセントにつながる電線およびチューブ用のアクセスポート。(C)赤色光部からフルスペクトル光を遮断する構造。(D) 「グリーングラベル」 養殖セクション。(E)フルスペクトル光源。(F)外部ろ過された空気源に接続されたチューブライン。(G)空気中の汚染を減らすためのチェックバルブ。(H)コンタミネーションを最小限にとどめる個別培養容器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="複数のタンクを備えた太陽熱淡水化プロセス図で、浄水セットアップを強調しています。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:「 グリーングラベル」 ウォーターバスシステムの図。 (A)水中ポンプ付きチラー( I)。(B)水浴用の20ガロンの浴槽。(C)排水して水浴を再循環させます。(D)ウォーターバスの再循環用バルブ。(E)光源。(F)透明な蓋と曝気口を備えた2.5L の「グリーングラベル」 容器。(G)曝気源。(H)水中ポンプを使用して水を再循環させるパイプ。(I)水中ポンプでチラーから浴槽へ/から水浴槽へ。(J)水浴の蒸発を最小限に抑えるためのアクリルカバー。(K)光の強度を調整するためのメッシュシェード。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ライフステージ同定図:遊走胞子の定着、発芽、配偶体、胞子体の発達。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3: Macrocystis pyrifera の発生。 実験室での成長試験からの Macrocystis pyrifera の発達生活史段階。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="120日を超える昆布の成長段階。圃場の成長への実験室の培養。逐次画像解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:Macrocystis pyriferaを播種した「緑の砂利」。 Macrocystis pyriferaを播種した「緑の砂利」は、胞子体が1〜2cmに達するまで実験室で培養され、「緑の砂利」が展開され、畑で成長し続けます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="12°Cと20°Cでの40日間の藻類成長の比較。間隔をあけて顕微鏡画像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5:実験時系列。 カリフォルニア州(米国)で収集され、2つの異なる温度で培養された2つの集団に由来する Macrocystis pyrifera 配偶体および胞子体の実験的成長と発達に続く時系列の例画像。K1 = サンタクルーズ、K4 = サンディエゴ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="配偶体と胞子体に対する温度の影響。K4、K1種の成長を比較した棒グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図6:代表的な結果 12°Cおよび20°Cの一定の温度条件で培養したK1サンタクルス、サンディエゴ、K4サンタクルス原産の個体群で観察されたMacrocystis pyriferaのライフステージ。 エラーバー、平均± 1 SE。 アスタリスク(*)は統計的に有意な差を示します(p &lt; 0.05)。(A)24日目の配偶体(N=60サンプルから合計300枚の画像)。(B)32日目の目に見える胞子体(N = 72サンプル、標準化された2.5 cm x 7.5 cmの領域内)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/Supplemental%20File_Calendar%20R2.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルでは、野外環境での「グリーングラベル」技術の成功と限界に対処するために、修復試験で使用するためにキャノピーを形成するジャイアントケルプを播種した基質の野外収集と定期的な実験室メンテナンスについて説明します。

Canopy-forming kelps are essential foundation species, supporting biodiversity and providing ecosystem services valued at more than USD$500 billion ...

昆布の森は、気候による環境ストレス要因と栄養動態の変化により、前例のない損失に直面しています。このビデオでは、グリーングラベル技術を使用してジャイアントケルプ(Macrocystis pyrifera)を培養するためのプロトコルとツールを紹介し、さまざまな環境でこの方法の成功と限界に対処するためのさらなる試験のための貴重なリソースを提供します。昆布の養殖施設は、摂氏10度から15度の範囲の温度を制御し、毎秒0〜180マイクロモルの光子の範囲のフルスペクトル光を提供し、フィルター付き曝気を行える必要があります。コンセントが内蔵されているインキュベーターシステム、またはワイヤーやチューブ用のアクセスポートは、ライトと空気源で調整できます。インキュベーターシステムがプロジェクトの範囲、予算、または意図した規模に収まらない場合は、冷たい天然海水またはチラーで焼き戻したウォーターバスを使用できます。飼育温度は場所や季節によって異なります。増殖培地に温度計を置くか、温度ガンを使用して、温度が摂氏10〜18度であることを確認します。光源のタイミング設定を使用するか、プログラム可能なサイクルで光源をタイマーに接続することにより、フルスペクトルライトを12時間のライト、12時間の暗い写真期間に設定します。砂利の近くの表面下にあるPAR量子メーターで光強度を測定し、調光可能な光源を使用するか、光源の上にメッシュを重ねて調整します。曝気は、エアポンプを使用して培養物に追加されます。空気中の細菌汚染を減らすために、孔径02マイクロメートルのフィルターを使用してください。材料とステーションは、事前に滅菌して準備する必要があります。詳細については、テキストを参照してください。播種に使用される砂利は、配偶体が高粘度で基質に保持される可能性が高いため、テクスチャードのある、またはわずかに穴のある表面を持つ必要があります。水が透明になるまで砂利をこすり洗いしてすすぎ、ほこりや破片を取り除きます。砂利を10%希釈した漂白剤溶液に24時間以上浸し、ろ過滅菌した海水ですすいでください。培養容器のリフレッシュに必要なろ過滅菌海水の量を毎週計算し、それに応じてこのろ過および滅菌タスクをスケジュールします。ろ過滅菌された大量の海水は、摂氏8〜10度で最大6か月間暗い容器に保管できます。冷蔵できない場合は、暗くて涼しい場所に保管してください。孔径55〜1マイクロメートルの真空ろ過システムを使用して水をろ過します。フィルターの損傷を防ぐために、すべての水が引き込まれる前に真空源をオフにし、ろ過された水を専用の滅菌容器に注ぎます。大容量の場合は、フロースルーろ過システムを使用できます。たとえば、10マイクロメートル、5マイクロメートル、1マイクロメートルの3つのプリーツフィルターに海水を通し、孔径の大きいものから小さいものへと配置します。このフロースルーシステムは、水槽のUVライトに接続されています。ろ過された海水は、UV法やオートクレーブ法で滅菌します。濾過滅菌した海水に栄養素やビタミンを豊富に含ませることは、昆布の成長に不可欠です。一般的な濃縮オプションには、プロバソリ濃縮海水培地とF/2培地があります。詳細については、テキストを参照してください。現地の法律や規制を満たす昆布組織の収集に必要な許可を取得します。スキューバダイビングでは、2〜5メートルの間隔で目に見えるソリを持つ10〜15個の肥沃なMacrocystis pyrifera個体から3〜5枚の胞子葉を選択します。可能であれば、汚れや劣化がほとんどまたはまったくない、清潔で無傷の胞子葉を選択してください。胞子葉の刃は、この時点から親個体に応じて別々に保管してください。胞子葉は、成体の昆布のホールドファストの上の基部に密集したスカートで成長し、ガスで満たされた肺嚢胞がないことで識別できます。胞子葉の刃は、日光に過度にさらされないよう暗い収集袋に入れて輸送し、現場からの海水を最小限に抑えて湿った状態に保ち、培養スペースに到着するまで約12°Cのクーラーで保管します。サンプルが氷と直接接触していないことを確認してください。胞子葉は、他の場所に出荷することも、他の場所から出荷することもできます。ろ過滅菌した海水で胞子葉をすすぎます。1匹のMacrocystis pyrifera個体から採取したブレードを、ろ過滅菌した海水に浸した湿らせたペーパータオルで包み、再びアルミホイルで包み、光の侵入や追加の乾燥を防ぎます。この保存方法は、一般にブリトー法として知られています。これらのパッケージは、リサイクルされた気泡緩衝材や段ボールなどの保護バリア付きの氷を入れたクーラーボックスに入れます。クーラーボックスを翌日発送の準備をし、誰かが荷物を受け取り、パッケージを冷蔵状態に置いてくれることを確認してください。必要に応じて、胞子葉を冷蔵状態で12〜48時間保存すると、胞子組織からの胞子の放出が促進されます。保存するには、ブリトー法を使用します。オプションで保管する場合は、ペーパータオルに部分胞子形成の証拠を見つけて、肥沃な卵婆組織の存在を示します。ソラス組織は、周囲の組織よりもわずかに隆起し、色が濃いことがよくあります。熟した石部組織を選択し、滅菌ハサミを使用して25センチメートル四方のセクションにカットします。遺伝的多様性を促進するために、10〜15匹の昆布の親から1〜2つのきれいなソリセクションを選択します。洗浄するには、フィルター滅菌した海水で湿らせた滅菌ガーゼを使用して、皮膚組織の両側を一方向にのみ静かにこすります。必要に応じて、滅菌カミソリの刃で石部組織をそっとこすります。ソリ切片を淡水浴に30秒〜1分間浸し、ろ過殺菌した海水ですすいでください。滅菌済みの50ミリリットルのファルコンチューブ内で、摂氏10〜15度に焼き戻したフィルター滅菌海水に各ソリセクションを浸します。あるいは、ソリ切片は単一の滅菌容器内で胞子を形成することができます。チューブを摂氏4〜12度で暗闇に置き、最大4時間胞子を形成します。冷蔵庫がない場合は、暗い涼しい場所に保管してください。複合顕微鏡と血球計算盤を使用して、30分ごとに最大4時間ごとに3〜4サンプルの胞子密度を観察します。サンプル間でピペットチップを交換します。密度がミリリットルあたり少なくとも10, 000胞子の場合は、次のステップに進みます。4時間後に胞子が産生されない場合は、サンプルを廃棄します。胞子は放出後数時間以内に沈殿することがありますが、円を描くように泳いでいるのが観察されることがあります。ファルコンチューブから各ソリセクションを取り外します。得られた胞子溶液を単一の滅菌容器に混ぜ合わせ、最終的な合計密度を定量化します。培養容器内の1ミリリットルあたり500〜1, 000胞子の最終濃度の接種に必要な胞子溶液の最終量を計算します。詳細については、テキストを参照してください。培養容器内に滅菌スライドガラスを入れて、昆布の発育を観察します。十分なモニタリングのために、培養容器にランダムに分散した少なくとも30枚のスライドを含めます。計算された量の胞子溶液を、増殖培地に浸した基質を含む滅菌ピペットチップを使用して培養容器に接種します。容器を閉じ、静かにかき混ぜて胞子を分散させます。容器を培養システムに入れます。展開サイトの温度に基づいて、温度を摂氏 10 度から 15 度の間で設定します。水生植物用のフルスペクトルライトは、12時間の光、12時間の暗サイクルに設定され、光強度は1平方メートル毎秒0〜180マイクロモルの光子の範囲です。特定の光の状態のタイムラインについては、テキストを参照してください。1日後、ろ過された空気源で軽い曝気を行います。最初の2週間は、毎日少なくとも2枚、または1日おきにスライドガラスをランダムにモニターして、発達を評価します。2週間後、胞子体のサイズが1〜2センチメートルに達するまで、少なくとも2つのランダムなスライドガラスを週に1〜2回監視して、健全な成長と汚染を確認します。モニターするには、滅菌ピンセットでスライドを取り扱い、スライドガラスを沈めるのに十分な滅菌海水を含む清潔なペトリ皿に入れます。クロスコンタミネーションを避けるため、スライドガラスを除去した後は培養物に戻さないでください。複合顕微鏡、または倍率40〜400倍の倒立顕微鏡を使用して、初期段階の昆布を観察します。開発は、次のタイムラインをたどることが期待されています。沈降した胞子は0〜1日で観察されます。胞子は、生殖管の形成によって実証され、数時間以内に発芽する可能性があります。発芽は通常、1〜2日で観察されます。初期の配偶体は通常、1〜4日で観察されます。配偶子形成は、細胞が分裂と分化を経て雄と雌の配偶子を形成するプロセスであり、通常、最初の2週間以内に観察されます。女性の細胞は男性の5〜7倍の大きさです。雄の配偶体は細い糸状の枝を成長させますが、雌はより丸い、または卵形です。雌は通常、2〜3週間以内に卵を産みます。オスから放出された精子は卵子を受精させ、卵子は胚胞子体に発達します。胞子体は通常、2〜4週間以内に観察されます。受精卵は急速に細胞分裂し、約6〜8週間以内に1〜2センチメートルのブレードが成長します。毎週、成長培地を交換して、Macrocystis pyriferaの成長に必要な栄養素とミネラルを補充します。新鮮な培地を適切な温度に冷却します。このプロセス中、増殖培地が摂氏15度を超えないようにしてください。培養容器から培地を吸い上げて、播種された基質の乱れを防ぎます。容器がほぼ空になるまで培地を排出します。乾燥を最小限に抑えるために、メディアをすぐに更新します。補充するときは、培地が培養容器の側面を流れ落ち、基質の乱れを最小限に抑えるように、増殖容器を少し傾けてください。毎週の培地交換時に容器や槽の位置をランダムに再配置し、光の放射照度の違いを考慮します。Macrocystis培養の活動と期待を追跡するためのカレンダーのテキストを参照してください。これは、光と曝気の調整のタイミング、および毎週のメディアの変更を示します。6〜8週間の実験室培養の後、幼魚の胞子体は長さ1〜2センチメートルになり、展開の準備が整います。導入の24時間前に培養容器内の増殖培地をリフレッシュします。現地の法律や規制を満たす砂利の展開に必要な許可を取得します。緑の砂利を日陰のクーラーで最大6時間輸送します。展開は、直射日光が最も避けるようにタイミングを合わせる必要があります。展開プロセス中に直射日光を避けるために、ボートの日陰構造を利用してください。地表から下のサンゴ礁に緑の砂利を慎重に散布するか、新しい場所や小規模で試す場合はスキューバダイビングで散布します。緑色の砂利の復元技術はまだ学術段階にあり、他の種の外植生の生存データは限られており、Macrocystis pyriferaのデータはまだありません。それにもかかわらず、最近のパイロット研究では、現場での成功が観察されており、周囲の基質へのハプテラ付着と、野外での2か月後には1.2メートルまで成長する稚ケルプが示されています。このプロトコールで概説されている野外採集と実験室でのメンテナンスを使用して、摂氏12度と摂氏20度の2つの異なるドナーケルプ集団を培養し、Macrocystis pyriferaのミクロ段階の発達に対する温度依存的な影響を経時的に解明しました。24日後、顕微鏡画像から配偶体を数えた。気温は低温のK1集団には影響を与えたが、K4集団には影響しなかったことから、熱耐性形質の適応的分岐の可能性が示唆された。これは、サイト固有の飼育温度の重要性を浮き彫りにしています。32日後、目に見える胞子体を各スライドガラスでカウントしました。温度は、K1集団とK4集団の両方に同様の効果をもたらしました。摂氏20度で飼育されたサンプルは、摂氏12度で飼育されたサンプルと比較して、目に見える胞子体がほとんど成長しませんでした。この結果は、胞子体産生は配偶体期よりも温度に敏感であり、プロトコルで概説されているように、胞子体の発生を達成するためには培養温度が摂氏15度を超えてはならないことを示唆しています。この可視化されたプロトコルにより、世界中の研究者や管理者による貴重な海底昆布林の再生を拡大するために、グリーングラベル法によるさらなる試験を奨励したいと考えています。Macrocystis pyriferaとの緑の砂利の旅で幸運を祈ります。

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環境

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