Name: 細胞外小胞のプロテオミクス分析におけるポリカーボネート超遠心チューブの再利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 36 s
Description: 学ぼう、ポリカーボネート超遠心チューブの洗浄・再利用プロトコルを用いた細胞外小胞のプロテオミクス分析手法。心血管組織の石灰化メカニズム研究において、コスト削減と廃棄物低減を実現する持続可能な実験室手法を確立する。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01HL147095、R01HL141917、R01HL136431、興和株式会社、およびMarie Skłodowska-Curie助成金契約第101023041号(R.Cahalane)に基づく欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムからの研究助成金によって支援されました。 図 1 は Biorender.com を使用して作成されました。現在の洗浄プロトコルは、国際細胞外小胞学会 2023 Education Day (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) で発表された推奨チューブ洗浄プロトコルを変更して開発されました。頸動脈組織のEVサンプルを提供してくれたUniversity Health Network(カナダ、トロント大学)のKathryn Howe博士とSneha Raju博士に感謝します。

1.チューブのクリーニング
注:EVの分離手順では、キャップ付きとキャップなしの両方のポリカーボネートUCチューブを使用します(詳細は以下を参照)。キャップ付きチューブとキャップなしチューブの両方で同じ手順に従いました。キャップ付きチューブの場合、蓋の部品は個別に洗浄され、乾燥および事前保管後に再組み立てされました。
<ol><li>ポリカーボネートチューブを最初に使用し、サンプルを取り除いた後、すぐにUCチューブを水道水に浸して、サンプルがチューブの側面に乾燥しないようにします。</li>
	<li>チューブを0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に移し、水道水に10分間浸します。</li>
	<li>一度に1本のチューブで、チューブからSDS溶液のほとんど(すべてではない)をデカントし、綿棒を使用してEVペレットが配置されていたチューブの領域を完全に拭きます。 注意: 毛のあるものは使用しないでください。このプロトコルでは、通常の綿棒を使用しました。ただし、チューブの洗浄には、特殊な糸くずの少ない綿棒を使用できます。</li>
	<li>熱い水道水(~50°C)で少なくとも3回すすいでください。チューブを完全に充填してデカントしてください。</li>
	<li>スプレーボトルまたは狭口洗浄ボトルを使用して、脱塩水で1回すすぎます。</li>
	<li>スプレーボトルを使用して、70%エタノールで1回すすぎます。</li>
	<li>チューブを逆さまにして乾かします。 注:蛍光活性化細胞選別用のチューブラックは、UCチューブの乾燥に適しています。</li>
	<li>完全に乾いたチューブをきれいな瓶に入れます。それらは再利用の準備ができています。 注:現在、このプロトコルは最大2倍の再利用が検証されています。</li>
</ol>2. EVエンリッチメント
注:以下のEV単離およびプロテオミクスプロトコルは、元の組織EV単離、ならびにブランク(未使用)および洗浄されたチューブサンプルを得るために使用された「模擬サンプル」の両方に使用された。元のサンプルは、頸動脈内膜摘出術を受けた患者の頸動脈プラークから組織に閉じ込められたEVを再懸濁したものです。手術標本は、University Health Network(カナダ、トロント)から収集され、施設倫理委員会によって承認されました。すべての患者は、ヘルシンキ宣言に従って、サンプル収集とデータ分析についてインフォームドコンセントを提供しました。模擬サンプルは、真空チューブと洗浄チューブをEV分離サンプルと同じ溶液と処理手順で処理して得られた擬似ペレットでした。
<ol><li>EV サンプルまたは模擬サンプルを PBS on ice で解凍します。</li>
	<li>NTE緩衝液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0.137 M NaCl pH 7.4)と滅菌フィルターを作製します。</li>
	<li>サンプルを10,000 × g で4°Cで10分間遠心します。</li>
	<li>上清を1mLのオープントップポリカーボネートチューブに移します。</li>
	<li>上清を100,000×g で4°Cで1時間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含む滅菌ろ過NTEバッファー150 μLに再懸濁します。</li>
	<li>1.5 mLの微量遠心チューブに移し、NTEバッファーを添加して、総サンプル量が1.5 mLになるようにします。</li>
	<li>サンプルを氷の上に置いてください。</li>
</ol>3. 密度勾配の作製と密度勾配分離
注:このEVアイソレーションプロトコルは、Blaserらによって 以前に説明されています9。
<ol><li>ヨウ素密度勾配培地の5つの溶液(10%、15%、20%、25%、30%)を調製し、NTEバッファーを希釈剤として使用します。</li>
	<li>5つの密度溶液を、下部に30%、上部に10%のキャップ付き超遠心チューブに順番に層状にします。</li>
	<li>チューブのキャップを固定し、室温で1時間、安定した水平位置にゆっくりと移動します。</li>
	<li>1時間後、チューブを氷上で30分間ゆっくりと垂直位置に移動し、勾配を冷却します。</li>
	<li>調製した密度勾配チューブの上部に、サンプルまたは模擬サンプル(NTEバッファー)1.5 mLを加えます。</li>
	<li>超遠心チューブを250,000 × g で40分間、4°Cで。</li>
	<li>密度勾配(2.4 mL)の上部画分をキャップなしの超遠心チューブに除去します。滅菌ろ過したNTEバッファーで9mLまで充填します。</li>
	<li>EVを100,000 × g で4°Cで1時間超遠心分離してペレット化します。 注意: 目に見えるEVペレットの位置または予想される位置をマーカーで丸で囲みます。これにより、綿棒で直接ペレットの領域をきれいにすることができます。</li>
	<li>チューブを逆さまの位置に3分間移動させながら、上清を吸引します。チューブの右側を上に向ける前に、綿棒で残りの液滴を取り除きます。</li>
	<li>EVペレットを、参照キット内の12 μLの溶解バッファーに再懸濁します。</li>
</ol>4. プロテオミクスのためのペプチド調製
注:プロテオミクスサンプル調製は、キットプロトコルに従って行い、低存在量のタンパク質サンプルを社内で修正しました。変更されたプロトコルは次のとおりです。
<ol><li>サンプルを溶解、変性、還元、アルキル化するには、溶解バッファー中で95°Cで10分間加熱します。</li>
	<li>Lys-C/トリプシン消化液を用いて、サンプル中の溶解液10 μLと消化液10 μLを用いて、37°Cで2時間サンプルを分解します。</li>
	<li>キット溶液を使用して、親水性および疎水性の汚染物質を洗い流し、精製されたペプチドから溶出することにより、カートリッジを介してペプチドを精製します。</li>
	<li>精製したペプチドを45°Cの高速真空で45分間、または乾くまで乾燥させます。 注:ペプチドの過乾燥は避けてください。</li>
	<li>サンプルは、質量分析シーケンシングの時まで-80°Cで保存してください。</li>
	<li>乾燥ペプチドに17 μLのLC負荷溶液を加えます。</li>
	<li>サンプルを氷の上に1時間放置します。</li>
	<li>サンプルを短時間ボルテックスし、次いで超音波水浴中で5分間超音波処理する。</li>
	<li>LC負荷サンプルを16,000 × g で1分間遠心分離し、上から15 μLを吸引し、新しいチューブに分離します。</li>
</ol>5. 液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析シーケンシング
<ol><li>2 μLのLCロードペプチド溶液を質量分析計に注入します。</li>
	<li>デュアルカラムセットアップを使用してペプチドを分画します。</li>
	<li>カラムを45°Cの一定温度で加熱します。</li>
	<li>分析グラジエントを300 nL/minで5%から21%溶媒B(アセトニトリル/ 0.1%ギ酸)で60分間実行し、続いて21%から30%の溶媒Bを10分間実行し、さらに10分間95%〜5%ジグソー洗浄します。</li>
	<li>MS1 の分離度を 120 K(最大注入時間、25 ms)に設定し、上位のプリカーサーイオン(サイクルタイム 3.0 秒以内)を HCD 分離幅 1.2 m/z に、動的排除が有効(60 秒)に設定し、MS2 の分離度を 60 K(最大注入時間、自動、正規化コリジョンエネルギー、24%、26%、28%)に設定します。</li>
	<li>MS1とMS2の捕捉範囲をそれぞれ400 m/z-1,200 m/zと120 m/z-1,200 m/zに設定します。</li>
</ol>6. ペプチド/タンパク質の同定
<ol><li>取得したペプチドスペクトルを、市販の検索アルゴリズムを用いてプロテオミクス検索ソフトウェアでヒトuniProtデータベースに対して検索します。</li>
	<li>消化酵素をトリプシンに設定し、最大2つの切断を逃します。</li>
	<li>プリカーサートレランスを10ppmに、フラグメントトレランスウィンドウを0.02Daに設定します。</li>
	<li>メチオニン酸化とN末端アセチル化を可変修飾として設定し、システインカルバミドメチル化を固定修飾として設定します。</li>
	<li>Percolator アルゴリズムによって計算された 1.0% の偽発見率(FDR)しきい値に基づいてペプチドをろ過します。</li>
	<li>特定のタンパク質群に割り当てられ、他のタンパク質群では検出されないペプチドのみを一意と見なし、さらなる分析に使用します。</li>
	<li>分析には、各タンパク質に少なくとも 2 つの固有のペプチドのみを含めます。</li>
	<li>プリカーサーイオン検出でIDを最大化します。</li>
	<li>最大保持時間シフトが 10 分、質量許容誤差が 10 ppm、シグナル対ノイズ比が最小 5 のクロマトグラフィーアライメントを実行します。</li>
	<li>ペプチド存在量を総ペプチド量で正規化します。</li>
</ol>

ポリカーボネート超遠心チューブのプロテオミクス用効率的なリサイクル(英語)

<ol><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, e854347(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+proteins+enriched+in+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273(2022).</li>
<li>van Herwijnen, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteomic+analysis+of+human+milk-derived+extracellular+vesicles+unveils+a+novel+functional+proteome+distinct+from+other+milk+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).</li>
<li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li>
<li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419(2015).</li>
<li>Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles">https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles</a> (2014).</li>
<li>R&D & Technology Department chemical resistance of polycarbonate products. PALRAM. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf">http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf</a> (2015).</li>
<li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li>
<li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermcidin%3A+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li>
<li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CSTA%2C+encoding+Cystatin+A%2C+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li>
<li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li>
<li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li>
<li>Gläser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+protein+psoriasin+%28S100A7%29+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li>
<li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+dust+in+seven+Danish+offices%5BTitle%5D)+AND+%22Atmospheric+Environment%22%5BJournal%5D)">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li>
<li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

ここでは、EV濃縮およびプロテオミクスアプリケーション用のポリカーボネートUCチューブを洗浄するためのプロトコルについて説明し、検証します。この質量分析取得プロトコルの検出限界を下回る洗浄された疑似ペレット分析と比較して、以前のUCチューブサンプルからの残留タンパク質の除去に成功したことを実証し、洗浄されたUCチューブ疑似ペレットと比較して、ブランクの未使用UCチューブのプロテオミクス類似性を示しました。
まず、タンパク質がポリカーボネートの内側壁に不注意に吸着するのを防ぐために、UCチューブを直ちにH2O10に沈めました。ポリカーボネートUCチューブの手洗いは、メーカー11によって推奨されています。Lipsolなどの他の洗剤は注意して使用する必要があります。.これは、界面活性剤、界面活性剤、およびキレート剤を中性でないpHで混合した独自の実験用洗剤です。したがって、このステップでは、質量分析適合界面活性剤である0.1%SDSを使用し、洗浄を10分以上行わなかった11。私たちの経験では、毛のクリーニングツールを使用すると、注意を払わないとチューブに傷がつく可能性があります。残留タンパク質の貯蔵庫となる可能性のある潜在的な引っかき傷を軽減するために、EVペレットの形成領域に焦点を当てて、綿棒を使用してポリカーボネートチューブの内側を拭きました。オートクレーブを繰り返すと、ポリカーボネートチューブの寿命が短くなる可能性があります11。代わりに、3回の短時間のお湯のすすぎが行われました。また、メーカーは非熱滅菌方法を提案していますが、避けるべき特定の温度は説明されていないことにも注意してください。チューブは、メーカーの推奨に従って、再利用する前に、変形やひび割れの兆候がないか常に検査する必要があります。可燃性物質は、稼働中の遠心分離機の近くで使用することは推奨されません。したがって、最後の70%エタノールリンスステップの後、チューブを一晩乾燥させます。
クロマトグラムの手動評価では、重大なポリマー汚染は観察されませんでした。SDSはポリカーボネートを分解するとは予想されておらず、熱水(<60°C)に短時間暴露しても効果はありませんが、長時間暴露では効果があります12。さらに、以前の研究では、ポリカーボネート種は、アセトニトリル勾配に基づいて、収集前の保持時間に溶出することが示されています13。ポリマーが存在しないとは確信できませんが、当社の取得法では、プロテオームに実質的な影響がないと確信しています。
ラボウェアをラベルフリープロテオミクス実験に再利用する場合は、以前の使用で残ったタンパク質汚染物質を特に考慮する必要があります。さらに、EVプロテオミクスは、非常に低収量のサンプルで実施されることが多く、<100 ngの範囲のタンパク質量が得られることもあります。これらの量の出発タンパク質は質量分析に適していますが、少量の残留タンパク質でもプロテオーム全体への影響が大幅に増加します。質量分析シーケンシングの進歩の感度を考えると、人間の取り扱いや製造による汚染物質が特定されます。このプロトコルでは、洗浄後に同定されたタンパク質の数が98%大幅に減少することを示しています。残りのタンパク質は、ほとんど使用されていないブランクチューブとクリーンチューブの間でほぼ独占的に共有されました。これらの結果は、同定されたタンパク質がプロテオミクス調製物自体からの汚染物質であるか、チューブ製造からの残留要素であり、以前の使用からのキャリーオーバーではないことを示唆しています。ブランクチューブと洗浄チューブで圧倒的に多く同定された3つのタンパク質は、毛髪や皮膚に見られるヒトケラチンI型(KRT1、KRT10、KRT9)で、これらのタイプの製剤では一般的に人間の取り扱いによる汚染物質として認識されています(https://www.thegpm.org/crap/)。共有された18個のタンパク質のうち9個は、他のケラチンでした。また、ヒトの汚染物質として認識されているのは、ヒトの汗に含まれるタンパク質であるデルムシジン(DCD)です14。他の同定されたタンパク質は、表皮(CSTA15、HRNR16、FLG217)にも見られ、または以前にチリダニ(S100A7、S100A8、S100A9)で同定された18,19。「塵」の実質的な構成要素は、人間の皮膚20であることに留意すべきである。洗浄されたチューブで同定された2つのユニークなタンパク質は、どちらもEVに関与しているが、同定された他のEVタンパク質1,21と比較すると非常にマイナーである。サンプルで同定されたタンパク質は調製物と一致しており、ブランクチューブと洗浄チューブの間に非常に明確な重なりがあることを示しており、再利用を支持しています。
EVは、細胞間コミュニケーションや生物学的ミネラル化の形成など、生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。EVは人体のいたるところにあり、バイオマーカー、治療法、および(病態)生理学に関する情報源としての可能性を秘めているため、基礎科学の分野で急速に成長しています。差動UCを使用した実験のためにこれらの粒子を濃縮するには、特殊なポリカーボネートチューブが必要です。これらの熱可塑性プラスチックの使い捨てと廃棄は、実験用消耗品のコストの上昇と世界的なプラスチック汚染の負担の一因となっています。ここでは、ポリカーボネートUCチューブを洗浄して再利用し、プロテオミクス実験に適したEV分離を実行するためのプロトコルを提示し、検証しました。最終的には、EVラボから発生する廃棄物が削減され、そのような実験に関連するコストが削減されます。

細胞外小胞(EV)は、タンパク質などの生物学的に活性な貨物を運ぶ細胞から放出される脂質二重層で区切られた粒子であり、細胞間コミュニケーションや生物学的石灰化の形成など、さまざまな生物学的プロセスに関与しています1。これらの粒子はすべての体液や組織に見られ、その生物学的活性と用途は急速に進化している科学研究分野です。これらのナノ粒子の単離と検証は、サイズが小さく、リポソームやタンパク質凝集体などの他の粒子との生物学的類似性のために、さまざまな課題を提示します。最新の国際細胞外小胞学会のガイドラインである Minimal information for studies of cellular sifles 2018 (MISEV2018) は、EV 科学研究の基準として認められています2.
EVの絶縁には、アップストリームのソースとダウンストリームのアプリケーションに応じて、さまざまな方法を併用する必要があります。2015年現在、EVの最も一般的な一次分離方法は示差超遠心分離(UC)2でした。原理的には、最初の低速遠心分離では、細胞や細胞の破片など、より大きく、より密度の高い不要な成分が分離され、EVは上清に残ります。その後、UCは非常に高い遠心力を使用してEVをペレット化し、より小さいまたは密度が低いが、高密度の非EV粒子を含む可能性のある他の粒子からEVを分離して精製します。ほとんどのプロトコルでは、多くの場合、何らかのステップでUCを使用して、EVを流体から分離します3。さらに、UCは、OptiprepTM ヨージキサノールなどの媒体と遠心力を使用して浮力密度4に従ってEVを分離する密度勾配超遠心分離(DGUC)など、EV分離の他の方法で使用されます。EV絶縁の方法は他にも存在します3。
EVが決定する生物学的プロセスと、バイオマーカーおよび病態生理学に関する情報としての可能性の理解が急速に進化していることを考えると、プロテオミクスなどの発見ベースの分析が勢いを増しています5,6,7,8。EVは小さく、供給源によっては、全組織または細胞溶解物と比較してタンパク質の収量が低くなります(<1μg)。プロテオミクス分析のためのEVの単離には、上流の液体または組織からの非EVタンパク質汚染物質の除去、単離プロセス中のEVタンパク質分解の考慮、ペプチド調製および質量分析と化学的に適合性のあるタンパク質溶液を生成する方法の利用など、特別な考慮事項が必要です。
研究室の消耗品は、多くの場合、プラスチックで使い捨てです。これらの使い捨て材料は、世界的なプラスチック汚染の危機と消耗品のコストの一因となっています。特殊なポリカーボネートおよびポリスチレンUCチューブは、実験室用途でEVをペレット化するために必要な高い遠心力に耐えるように設計されています。UCチューブを滅菌・消毒して再利用することは可能ですが、プロテオミクス解析、特にEVなどのタンパク質収量の低いプロテオミクス解析には特別な注意が必要です。以前の使用から残留タンパク質を十分に除去することが最優先事項であるだけでなく、質量分析法およびプラスチック由来のポリマー汚染との化学的適合性も考慮する必要があります。
ここでは、質量分析に適した界面活性剤を使用したポリカーボネートチューブの洗浄プロトコルを提示し、検出限界以下の残留タンパク質の除去に成功し、検出可能なポリマー汚染物質がないことを検証するための実験を行います。UCとDGUCの両方の目的を使用してEVプロテオミクスアプリケーションの洗浄プロトコルを検証するために、UCとDGUCを組み合わせたプロトコルを使用して、ヒト血管系組織EVの分離からチューブを取得しました。チューブは、記載されたプロトコルを用いて洗浄され、実験プロセスは、未使用のブランクUCチューブと洗浄されたUCチューブを比較するサンプルなしで繰り返された。最終的には、EVの濃縮に適したUCチューブ洗浄プロトコルの検証により、EVラボで発生する廃棄物が削減され、そのような実験に関連するコストが削減されます。

<table><tbody><tr><td>10 mLオープントップ厚壁ポリカーボネートチューブ</td><td>ベックマン・コールターライフサイエンス</td><td>355630</td><td>キャップなし超遠心チューブ&nbsp;</td></tr><tr><td>キャップ付き10.4mLポリカーボネートボトル</td><td>ベックマン・コールターライフサイエンス</td><td>355603</td><td>キャップ付き超遠心チューブ&nbsp;</td></tr><tr><td>高い評価を得ている PepMap 100 C18 HPLC カラム、75 &micro;メートル x 70 mm;EASY-Spray HPLCカラム、75 &micro;m x 250 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164946 and ES902</td><td>デュアルカラムセットアップ</td></tr><tr><td>クリティカルスワブ スワブ、コットンヘッド</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td>コットンスワブ</td></tr><tr><td>Exploris 480 EASY-Spray Source付き、Easy-nLC1200 HPLCポンプとの組み合わせ。</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BRE725533</td><td>質量分析計</td></tr><tr><td>ヒト UniProt データベース (101043エントリ、2022年1月更新)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ヒトデータベース</td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PreOmics iST キット &nbsp;</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>市販タンパク質サンプル調製キット&nbsp;</td></tr><tr><td>プロテオームディスカバラー &nbsp;パッケージ (PD, Version 2.5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>プロテオミクス探索ソフトウェア</td></tr><tr><td>SEQUEST-HT 探索アルゴリズム&nbsp;</td><td>NA</td><td></td><td>NA検索アルゴリズム</td></tr>ド<tr><td>デシル硫酸ナトリウム(20%)</td><td>ボストンバイオプロダクツ</td><td>BM-230</td><td>洗剤</td></tr></tbody></table>

細胞外小胞のプロテオミクス分析におけるポリカーボネート超遠心チューブの再利用

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

使い捨ての実験用プラスチックは、汚染の危機を悪化させ、消耗品のコストの一因となります。細胞外小胞(EV)の単離では、ポリカーボネート製の超遠心分離機(UC)チューブを使用して、関連する高い遠心力に耐えます。EVプロテオミクスは進歩的な分野であり、これらのチューブの検証済みの再利用プロトコルが不足しています。低収率のタンパク質単離プロトコルやダウンストリームプロテオミクスに消耗品を再利用するには、遠心チューブ由来の合成ポリマー汚染がなく、残留タンパク質を十分に除去するなど、質量分析法による取得と試薬の適合性が必要です。
このプロトコルは、EVプロテオミクス実験で再利用するためにポリカーボネートUCチューブを洗浄する方法を記述し、検証します。洗浄プロセスでは、タンパク質の乾燥を防ぐためにUCチューブをH2Oに直ちに浸し、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤で洗浄し、熱い水道水、脱塩水、および70%エタノールですすいでください。下流のEVプロテオミクスに対するUCチューブの再利用プロトコルを検証するために、UCと密度勾配分離の差を用いて心血管組織からEVを単離する実験を行った後、使用済みのチューブを入手しました。チューブを洗浄し、実験プロセスをEVサンプルなしで繰り返し、未使用のブランクUCチューブと洗浄されたUCチューブを比較しました。単離手順から得られた疑似EVペレットを溶解し、少量のタンパク質サンプル用に修正した市販のタンパク質サンプル調製キットを使用して、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析用に調製しました。
洗浄後、疑似ペレットで同定されたタンパク質の数は、同じチューブからの以前のEV分離サンプルと比較して98%減少しました。洗浄したチューブとブランクチューブを比較したところ、両方のサンプルにごく少数のタンパク質(≤20)が含まれ、86%の類似性がありました。洗浄したチューブのクロマトグラムにポリマーのピークがないことを確認しました。最終的には、EVの濃縮に適したUCチューブ洗浄プロトコルの検証により、EVラボで発生する廃棄物が削減され、実験コストが削減されます。

洗浄プロトコル(図1)を検証するために、2つの実験を行いました。まず、洗浄したチューブからの「模擬サンプル」のプロテオームを、チューブの最初の使用による組織EVサンプルのプロテオームと比較して、同定されたタンパク質のキャリーオーバーを決定しました。代表的なクロマトグラムは、チューブの洗浄後にピークの不均一性が低下していることを示しています(図 2)。最初のEV単離では、806のタンパク質が2つ以上の固有のペプチドで同定されました。洗浄後、同定されたタンパク質の数は98%減少し、19個のタンパク質になりました。12個のタンパク質が両方で共有され、7個のタンパク質は洗浄されたチューブに特異的でした(図3A)。文献レビューを使用して、特徴的なEVタンパク質のリストを以前に発表された9としてまとめました。元のサンプルで同定された24の特徴的なEVタンパク質のうち、洗浄後に同定されたのは1つだけでした(表1)。共有タンパク質のうち、特徴的なEVタンパク質であるMFGE8は、EVサンプルの中で最も差益なタンパク質でした。比較すると、2つの汚染物質タンパク質、KRT14とKRT5は、洗浄後のサンプルで最も異なる濃縮度を示しました(図3B)。
洗浄後のチューブからのタンパク質の除去を確認するために、SDS-PAGEゲルを1 μg(EV分離収率の典型的な下限)から16.5 ngまでのBSA標準曲線で行い、次にブランクにしてチューブの「模擬」EVペレットを3回洗浄しました。すべての検量線バンドは見えましたが、サンプルは見えず、タンパク質の少なくとも98%が洗浄除去され、ブランクチューブと洗浄チューブの間に観察可能な差が見られなかったことを示しています(図4A)。洗浄したチューブで同定された特定のタンパク質を、未使用のブランクチューブと比較してさらに評価するために、直接比較を行った(N = 4、群)。ブランクチューブと洗浄チューブのクロマトグラムは非常に類似していました(図 4B)。未使用のブランクチューブから、19種類のタンパク質が同定された。同様に、洗浄したチューブでは、20のタンパク質が同定され、18のタンパク質が2つのグループ内で共有されました(図4C)。すべてのタンパク質を存在量でランク付けすると、汚染物質のケラチンタンパク質KRT1、KRT9、およびKRT10は、両方のグループで最も豊富です(図4D)。洗浄したチューブでは、特徴的なEVタンパク質の1つであるラクタドヘリン(MFGE8)が同定されました。各 5 分間の保持時間ビンでのトリガー MS2 シーケンシングイベントの数(図 4E)、シーケンシングされたペプチドの数、およびシーケンシングの信頼性(図 4F)、およびペプチド間の大きな重複(図 4G)において、クリーンチューブとブランクチューブの間に高い類似性がありました。まとめると、これらの結果は、この洗浄プロトコルによるチューブの再利用がプロテオームに与える認識可能な影響がないことを示しています。
ポリカーボネートのモノマーは254.3MH1+であり、MS1取得範囲を下回っています。クロマトグラムは、検出されなかった単一荷電二量体および三量体の存在について評価した(データは示さず、N = 4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig01.jpg"> 図1:ポリカーボネート超遠心チューブ洗浄プロトコルの概略図。 略語:UC =超遠心分離機;SDS = ドデシル硫酸ナトリウム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig02.jpg"> 図2:以前のEVサンプルプロテオームと、洗浄したチューブの「模擬サンプル」(N = 2)の代表的な比較。 略語:EV =細胞外小胞;TIC-MS = 全イオンクロマトグラフィー質量分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig03v2.jpg"> 図3:EVサンプルで同定されたタンパク質と、洗浄したチューブから得られた「模擬」サンプルと の比較 (A)ベン図以前のEVサンプルプロテオームにおけるタンパク質同定と、洗浄したチューブからの「模擬サンプル」(N = 2)。(B)対数2倍変化によってランク付けされた共有タンパク質の差分濃縮。略語:EV =細胞外小胞、FC =倍率変化この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig03largev2.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig04.jpg"> 図4:未使用のブランクチューブと洗浄済みチューブの比較(A)SDS-PAGEゲルを1μgから16.5ngのBSA標準曲線で行い、次にブランクチューブと洗浄したチューブの「模擬」EVペレットを3重にしました。(B)ブランクチューブおよび洗浄チューブの代表的なクロマトグラム。(C)ブランクチューブおよび洗浄チューブからの共有タンパク質または固有のタンパク質のベン図(N = 4)。(D)各グループで同定されたすべてのタンパク質は、(i)ブランクチューブおよび(ii)洗浄チューブの存在量に応じてランク付けされました。中央値がプロットされます。(E)グループごとに合計された保持時間別のトリガーされたすべてのMS2イベントのヒストグラム(N = 4)。(F)信頼度の高いペプチドがグループ内一致ペプチドと区別され、同定の信頼度は低いが、他のスペクトルとのマッチングによって強化される信頼度による各グループのペプチドIDの数、平均/SD(G)グループ間で一意で共有されるペプチドの数。略語:EV =細胞外小胞;TIC-MS = 全イオンクロマトグラフィー質量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
表1:UCチューブ洗浄前と洗浄後の分析で見つかった特徴的なEVタンパク質。 略語:UC =超遠心分離機;EV =細胞外小胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/Table%201.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ポリカーボネート超遠心チューブを洗浄および再利用して、プロテオミクス実験に適した細胞外小胞分離を行うための詳細なプロトコルが提供されています。

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

私たちは心血管疾患、特に弁や血管などの心血管組織の病理学的石灰化における細胞外小胞の役割を研究しています。私たちのグループの研究者は最近、線維石灰性心血管組織から組織と閉じ込められた細胞外小胞を抽出して、それらのプロテオミクスプロファイルを決定する方法を定義しました。私たちのグループは、これらの細胞外小胞が疾患組織の石灰化を開始するための重要なタンパク質カーゴを含んでいることを示しました。細胞外小胞単離の超遠心分離ステップで使用される特殊なチューブは、再利用のために洗浄および滅菌することができます。ただし、プロテオミクス分析では、汚染が下流の結果に大きな影響を与える可能性があるため、特別な考慮が必要です。ここでは、消耗品、特に下流の低入力プロテオミクスアプリケーションに適した細胞外小胞分離用のポリカーボネート超遠心チューブを再利用するためのプロトコルを検証します。私たちのプロトコルはシンプルで効果的であり、研究者はこれらの分離プロトコルに通常関連する消耗品のコストと廃棄物の両方を削減できます。

polycarbonate-ultracentrifuge-tube-re-use-proteomic-analyses

Research

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細胞外小胞のプロテオミクス分析におけるポリカーボネート超遠心チューブの再利用

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