アルツハイマー病(AD)の神経モデルにおけるミトコンドリア関連小胞体膜(MAM)安定化の定量的解析

私たちは、アルツハイマー病を含むいくつかの神経変性疾患の病態生理学を調節する上で重要な、さまざまな厚さまたはギャップ幅のミトコンドリア関連小胞体膜の安定性を定量的に測定しようとしています。ミトコンドリア関連 ER 膜 (MAM とも呼ばれる) に関する最近の研究では、ミトコンドリア関連 ER 膜が AD の初期段階でアミロイド病変を開始する重要な要因の 1 つであると説明されています。この発見は、ADがもっぱらMAM関連疾患であることを示唆するMAM仮説と呼ばれる新しい仮説の開発につながりました。

私たちのプロトコルは、これまで困難なままであった生細胞におけるMAM安定化を測定するための定量的ツールを提供する最初のプロトコルです。私たちのプロトコルの最大の利点は、ミトコンドリアの固有の動的特性を使用して、生細胞のMAMギャップ幅を締めたり緩めたりしたときのMAM安定化の変化を定量的に測定することです。

当面の焦点は、最近開発されたアルツハイマー病薬スクリーニングプラットフォームを使用して、FDA承認の一連のMAMまたはMAM結合シグマワン受容体の合成または天然低分子モジュレーターをスクリーニングし、その作用機序を理解するために、最先端の生細胞イメージングおよびキモグラフィー技術を改善および採用することです。

[ナレーター]MAM安定剤で細胞をトランスフェクトするには、各ウェルで骨髄単核混合物を2ミリリットルの室温DMEM-F12培地に置き換えます。ヌクレオフェクター試薬とサプリメント1を4.5対1の比率で組み合わせます。100マイクロリットルのヌクレオフェクター試薬を混合物に加えます。次に、DNA溶液を渦に巻き込みます。処理ごとに1〜5マイクログラムのDNAを、トランスフェクションごとに別々の1ミリリットルマイクロ遠心チューブに追加します。細胞から既存の培地を吸引した後、細胞を10ミリリットルのPBSで1回洗浄します。PBSを吸引し、1ミリリットルのアキュターゼを細胞に直接加えます。細胞を摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。次に、皿の側面を軽くたたいて細胞を取り除きます。顕微鏡下で、細胞が緩んで自由に流れていることを確認します。10ミリリットルのDMEM-F12培地でアキュタントを中和し、細胞懸濁液を清潔な15ミリリットルのチューブに移します。次に、10マイクロリットルの懸濁細胞を取り、細胞計数チャンバーのA側に加えます。次に、充填されたチャンバーの側面Aをセルカウンターの前面にあるメインスロットに挿入します。を押して、ミリリットルあたりの細胞数を測定して記録します。必要な数の細胞を300 Gで5分間遠心分離します。次に、上清を注意深く吸引し、エレクトロポレーションごとにペレットを100マイクロリットルのヌクレオフェクター混合物に再懸濁します。次に、100マイクロリットルの再懸濁細胞懸濁液をDNAを含むチューブの1つに加えます。溶液を数回ピペッティングして混合します。次に、DNA細胞混合物をエレクトロポレーションキュベットに移し、付属の蓋で密封します。デバイス上の適切な核膜プログラムを選択します。滅菌ピペットを使用して、プレフィルドされた6ウェルプレートから約500マイクロリットルのDMEMをキュベットに直ちに追加します。一度穏やかに混合し、エレクトロポレーションされた細胞と培地を対応するウェルに移します。まず、細胞を含む6ウェルプレートを顕微鏡チャンバーに入れ、細胞が見えるようになるまで顕微鏡の焦点を調整します。赤色蛍光タンパク質シグナルを捕捉するには、594ナノメートルのレーザーを使用して蛍光色素を励起し、発光を570〜640ナノメートルに設定します。緑色蛍光タンパク質の場合は、510〜540ナノメートルの発光で励起するために488ナノメートルのレーザーを使用します。軸索の周囲に収まるようにスキャン領域をトリミングします。スキャン領域が小さいほど、処理時間が短縮され、キモグラフィーの生成が簡素化されます。間隔を 1 秒あたり 1 フレームに設定し、合計期間を 181 秒に設定します。[実行] をクリックしてプロセスを開始します。MAM 1X 標識 ER 結合ミトコンドリアの軸索速度は、遊離および MAM 9X 結合ミトコンドリアと比較して 50% 減少しました。MAM 1Xミトコンドリアの26.6%が可動性であったのに対し、遊離ミトコンドリアは53.82%、MAM 9Xミトコンドリアは44.79%でした。逆行性運動は、MITO-RFP ミトコンドリアおよび MAM 9X ミトコンドリアよりも MAM 1X ミトコンドリアの方が低かった。MAM 1X ミトコンドリアの順行性移動も、Mito-RFP と比較して減少しました。MAM 1Xミトコンドリアの定常率は、運動性の低下を反映して、MAM 9Xミトコンドリアよりも有意に高かったのに対し、MAM 1Xミトコンドリアの全体的な速度はMAM 9Xミトコンドリアよりも有意に低かった。