Name: 遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶ 遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたライブカルシウムイメージング法で、ロタウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜におけるウイルス誘導パラクリン信号伝達と隣接細胞の機能障害を解析する手法です。

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この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK115507およびR01AI158683(PI:J. M. Hyser)の支援を受けました。研修生のサポートは、NIHの助成金F30DK131828(PI:J.T. Gebert)、F31DK132942(PI:F. J. Scribano)、F32DK130288(PI:K.A. Engevik)によって提供されました。オルガノイド維持培地を提供してくださったTexas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Coreに感謝します。

ウイルス感染ヒト腸管オルガノイド単分子膜のカルシウムイメージング

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<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

著者は、開示すべき競合する金銭的利害関係を有していません。

細胞質Ca2+レベルの変化は、上皮内の病状の原因と結果の両方である可能性があります10,16,17。細胞質カルシウムの増加は、カルシウム依存性塩化物チャネルの活性化を介して分泌を直接促進TMEM16A18,19。Ca2+に応答したTMEM16Aの活性化は、塩化物の頂端流出を可能にし、体液分泌を促進する浸透圧勾配を確立する20,21。さらに、腸内分泌細胞内のCa2+の増加は、セロトニンの放出を誘発し、これは、腸内神経系内の活動を調節することができる求心性感覚ニューロンを刺激する22。また、Ca2+シグナルはタイトジャンクションを調節してバリア機能に影響を与え23,24、腸管幹細胞の増殖を調節することができる25。したがって、Ca2+の調節不全は、広範かつ広範囲に及ぶ影響をもたらす可能性がある。
多くのウイルスは、細胞質のCa2+を操作して、複製を助長する細胞環境を作り出します26。ロタウイルスは、腸上皮におけるこの典型的な例である27。ロタウイルス非構造タンパク質4(NSP4)は、小胞体から細胞質へのCa2+の流出を可能にするCa2+伝導チャネルである28,29。これはオートファジーを刺激し、外側のカプシド30,31,32の組み立てを助けます。また、ロタウイルス感染はADPの放出を誘発し、病因に寄与する細胞間Ca2+波を誘発する17。カリシウイルスとエンテロウイルスの両方を含む他の腸内ウイルスは、感染細胞内で同様のCa2+の調節不全を引き起こすCa2+伝導性ビロポリンをコードしている33,34。
ヒト腸オルガノイドの生細胞Ca2+ イメージングは、上皮内のウイルス誘導シグナル伝達を研究するための汎用性の高いプラットフォームを提供します。しかし、画像データから導き出された結論の強さは、HIOの健全性と質、適切な画像パラメータ、および健全な分析アプローチに密接に依存します。
レンチウイルスの効率的な形質導入は、新しいHIO株を樹立する際にはしばしば制限段階となりますが、高力価レンチウイルスと複数の形質導入は、十分な導入遺伝子発現を確保するのに役立ちます。重要なことは、形質導入時に細胞に重大なストレスがかかる可能性とのバランスを取る必要があるということです。これはほとんどの場合一時的なものであり、選択と複数の通過後に治まります。それにもかかわらず、GECIを発現するように操作されたHIOは、実験を開始する前に正常な増殖と増殖を示すことが重要です。同様に、3次元のHIOを分散させ、単層として改質させることも、細胞ストレスを誘発します。めっき後、単層が順応するまでに3日以上かかるのがベストプラクティスです。プレートをコラーゲンIVでコーティングすることは、単層の完全性にとって重要です35,36。コラーゲンIVを分注し、使用の合間に-80°Cで保存することで、単分子膜の接着性を確保することができます。各HIOラインに最適な播種密度を決定することも、一貫性の向上に役立ちます。最後に、適切なコントロールを含め、それらを実験間で比較することは、観察が技術的な交絡因子ではなく、問題の変数に対する応答を表していることを確認するために不可欠です。
単層をスコアリングすると、望ましくない細胞損傷を引き起こす可能性がありますが、2D HIOのRV感染を大幅に増強します。 図2 は、ほとんどすべての感染細胞がスクラッチに直接隣接しているため、これを示しています。実験的証拠は、RVが腸上皮細胞の基底外側表面で最も効率的に感染することを示唆している37。したがって、単層をスコアリングすると、基底外側表面が露出することで感染力が高まることが予測されます。効率的な単層感染は、基底外側表面へのアクセスを可能にする培地を含むウェルに懸濁されたポリカーボネート膜にHIOをプレーティングすることによっても達成できます。しかし、プレートとポリカーボネート膜、ポリカーボネート膜自体、およびウェルの底部のプラスチック表面との間の距離が比較的長いため、落射蛍光イメージングには適していません。したがって、このプロトコルに記載されているスコアリング方法は、依然として好ましいアプローチです。スコアリング自体がシグナル伝達の摂動につながる可能性があることを考えると、感染していないスコアリングされたコントロールを含めることは、解釈にとって重要です。ヒトノロウイルスのように、頂端膜を介して効率的に感染するウイルスの場合、単層のスコアリングは不要である38。
他のライブイメージングシステムと同様に、光毒性はHIO単分子膜を用いた実験を簡単に混乱させる可能性があります。イメージング実験全体を通して、予期せぬ空胞化、膜ブレビング、またはストレスの他の形態学的指標を監視することが重要です39。これらの兆候のいずれかが検出された場合は、励起の持続時間、頻度、またはパワーを下げる必要があります。S/N比を上げると、細胞の長期的な健康状態が犠牲になることが多いため、経験的にパラメータを最適化することが重要です。光退色は、ベースラインの蛍光強度が経時的に低下することで示されるように、細胞ストレスの前触れであり、避けるべきです。
画像データの視覚性により、研究者は定量的分析よりも定性的分析を好むようになります。ただし、他のモダリティと同様に、再現性のある結論には定量化が必要です。定量的な画像解析は、1つの論文でカバーできるよりもはるかに複雑ですが、いくつかの重要なポイントを強調する価値があります。まず、一貫した定量には一貫した取り込みが必要です。特定の取得パラメータセットに対して開発された解析パイプラインは、異なる周波数、露光時間、レーザー出力、または波長で取得された画像に対しては効果的でない場合があります。第二に、感染の多さは、ウイルスによって誘発されたカルシウムシグナルの頻度に大きな影響を与えます。そのため、視野ごとの感染細胞数を評価し、治療条件全体で一貫性を確保することが重要です。あるいは、信号周波数を視野あたりの感染細胞数に正規化することで、誤差を減らすことができます。最後に、最近開発されたmNGベースのカルシウム指示薬(NEMO)は、細胞内の絶対Ca2+ 濃度を決定するための有望なアプローチを提供しますが40、ほとんどのバイオセンサーは生物学的システムに関する相対的な情報のみを伝えます。したがって、バックグラウンド減算、正規化、およびコントロールとの比較が重要です。
このプロトコルはウイルス感染時のカルシウムイメージングに焦点を当てていますが、一般的なアプローチはすぐに適応できます。ウイルス感染は、代替治療条件に簡単に置き換えることができ、多くの異なる細胞経路とプロセスをモニターするためのバイオセンサーの数が増え続けています。プロトコールの適応において、研究者は分析を最優先に考え、明確で定量化可能な結果で実験を設計する必要があります。
全体として、ライブイメージングは比類のない時間分解能を提供し、非常にダイナミックなプロセスの特性評価を強化します。オルガノイドをライブイメージング実験に組み込むことで、組織に忠実で生理学的に関連性のあるモデルでこれらのプロセスを観察することができます。ここで説明するプロトコルが実験デザインと最適化を容易にし、研究者が細胞や組織のシグナル伝達の新しい側面を明らかにする力を与えることを願っています。

カルシウムは広く保存されているセカンドメッセンジャーであり、細胞生理機能の調節に重要な役割を果たしています1。カルシウムは、その強い電荷、小型、および生理学的条件での高い溶解性を考えると、タンパク質のコンフォメーションの理想的なマニピュレーターです。これにより、カルシウムは電気化学的シグナルを酵素的、転写的、または転写後の変化に変換する強力な手段になります。小胞体(ER)と原形質膜を横切る厳密なカルシウム濃度勾配は、細胞質カルシウム濃度の急速な変化を可能にする高い駆動力を生み出します。バッファリングとアクティブトランスポートの両方を含む複数のメカニズムが、この勾配を厳密に維持します。正常な細胞機能には必要であるが、この維持はエネルギー的に高価であり 、ストレス状態において特に影響を受けやすい2。
このように、細胞質内のカルシウムの調節不全は、多くの種類の細胞ストレスのほぼ普遍的なシグナルです。代謝障害、毒素、病原体、機械的損傷、遺伝的摂動はすべて、カルシウムシグナル伝達を混乱させる可能性があります。刺激に関係なく、細胞レベルでは、細胞質カルシウムの持続的で制御不能な上昇は、アポトーシスを促進し、最終的には壊死を促進する可能性があります3,4。しかし、低振幅または高頻度の細胞質カルシウムレベルの変化は、さまざまな影響を及ぼします2。同様に、カルシウム変動の結果は、変動が発生する空間的ミクロドメインによって異なる可能性があります5。したがって、カルシウムレベルをモニタリングすることで、動的シグナル伝達プロセスに関する洞察を得ることができますが、そのためには比較的高い時間分解能と空間分解能でのサンプリングが必要です。
遺伝子コードされたカルシウム指標(GECI)は、生細胞システムでの連続サンプリングのための強力なツールです6。最も広く使用されているGECIには、GCaMPとして知られるGFPベースのカルシウム応答性蛍光タンパク質があります7。標準的なGCaMPは、環状に順列されたGFP(cpGFP)、カルモジュリン、およびM136の3つの異なるタンパク質ドメインの融合です。カルモジュリンドメインは、カルシウムの結合時にコンフォメーション変化を起こし、M13との相互作用を可能にします。カルモジュリン-M13相互作用は、cpGFPの立体構造変化を誘発し、励起時の蛍光発光を増加させます。そのため、カルシウム濃度の上昇はGCaMP蛍光強度の増加と相関します。これらのセンサーは、細胞質である場合もあれば、特定の細胞小器官を標的とする場合もある8。
ほとんどの組織と同様に、カルシウムは消化管上皮内のさまざまな機能を調節します。腸上皮は栄養素と体液の吸収に不可欠ですが、病原体の侵入や有毒な侮辱を避けるために、タイトなバリアと免疫インターフェースを形成する必要があります。カルシウム依存性経路は、これらの生命機能のほぼすべてに影響を与えます9,10,11。しかし、腸上皮内のカルシウムシグナル伝達は未開拓のフロンティアであり、治療標的として有望な可能性を秘めています。in vivoでの腸上皮内のカルシウム動態のモニタリングは引き続き課題となっていますが、ヒト腸オルガノイド(HIO)は実験に適応可能なex vivoシステムを提供します12。HIOは、ヒト腸管幹細胞に由来する3次元(3D)スフェロイドであり、分化すると、天然の腸上皮の細胞多様性の多くを再現する12。
このプロトコールでは、GECIを発現するHIOを設計し、生細胞カルシウムイメージング用の単層として設計されたHIOを調製するための包括的な方法について説明します。カルシウムシグナル伝達を破壊する病理学的操作の例としてウイルス感染を提供し、これらの変化を定量化するための分析的アプローチを提供します。

<table><tbody><tr><td>高度なDMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン EDTA&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0.05%トリプシンEDTA&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>1.5mL 微量遠心チューブ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>15mL コニカルチューブ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>ギブコ</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>ギブコ</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>25ゲージ針</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>トクリス</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>シグマ-アルドリッチ&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, ガラス底部, 10コンパートメント</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>フルオロブライト</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>ヒト上皮成長因子</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス</td><td>VectorBuilder</td><td>(可変)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 細胞培養処理 24 ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>TR1003G SB202190</td><td></td></tr><tr><td>シ</td><td>グマ アルドリッチ</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLEの表現の酵素、フェノール赤い</td><td>サーモフィッシャーの科学</td><td>的な12604013</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Worthingtonの生化学</td><td>的なNC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

カルシウムシグナル伝達は、ほぼすべての組織に不可欠な調節因子です。腸管上皮内では、カルシウムは分泌活動、アクチン動態、炎症反応、幹細胞増殖、その他多くの特徴不明の細胞機能の調節に関与しています。そのため、腸上皮内のカルシウムシグナル伝達動態をマッピングすることで、恒常性細胞プロセスに関する洞察が得られ、さまざまな刺激に対する独自の応答が明らかになります。ヒト腸管オルガノイド(HIO)は、腸上皮を研究するためのハイスループットなヒト由来モデルであり、カルシウム動態を調べるための有用なシステムです。この論文では、遺伝子コードカルシウムインジケーター(GECI)を用いてHIOを安定的に形質導入し、ライブ蛍光顕微鏡法を実施し、イメージングデータを解析してカルシウムシグナルを有意義に特徴付けるためのプロトコルについて説明します。代表例として、3次元HIOをレンチウイルスで形質導入し、緑色蛍光タンパク質をベースとした細胞質GECIであるGCaMP6sを安定的に発現させました。次に、操作されたHIOを単一細胞懸濁液に分散させ、単層として播種しました。分化後、HIO単層をロタウイルスに感染させ、および/またはカルシウム応答を刺激することが知られている薬剤で処理しました。温度制御され加湿されたライブイメージングチャンバーを備えた落射蛍光顕微鏡は、感染した単分子膜や薬物処理された単分子膜の長期イメージングを可能にしました。イメージングに続いて、取得した画像は、無料で入手できる解析ソフトウェアImageJを使用して解析されました。全体として、この研究は、HIOにおける細胞シグナル伝達を特徴付けるための適応可能なパイプラインを確立するものである。

図1A は、GCaMP6を安定に発現するように形質導入された3次元ヒト腸管オルガノイドを含むBMMドームを示しています。 図1B は、播種後24時間、48時間、72時間で単層として再播種したオルガノイドの同じラインを示しています。GCaMP6sの機能を検証するために、単分子膜を蛍光顕微鏡で2秒ごとに4分間イメージングし、~20秒後に100 nM ADPを培地に添加しました。各露光で 488 nm チャネルで検出された蛍光強度を 図 1C にプロットします。このトレースは、ベースラインの蛍光強度が安定しており、ADPを添加すると急激に増加し、ベースラインに向かって徐々に回復していることを示しています。応答が真のシグナル伝達イベントであり、培地の添加から生じる可能性のある蛍光強度の変化だけではないことを確認するために、ビヒクルコントロールが含まれています。
HIO単分子膜をスコアリングすることで、ロタウイルス感染の効率が高まります。スコアリングの手法はさまざまですが、 図2Aに示すように、単層の長さに沿って単一のスコアを使用して一貫した感染を得るのが最も簡単です。蛍光タンパク質を発現するロタウイルスの組換え株を使用すると、ライブイメージング中に感染を確認できます(図2B)。マーカーを発現しない菌株を用いると、イメージング後に免疫蛍光法により感染を検出することができます。HIO単分子膜における細胞の運動性を考えると、単一の感染細胞を経時的に追跡することはしばしば困難です。代わりに、感染を検証し、感染の多重度が視野間で一致していることを確認する方法としてエンドポイント染色を使用します(図2C)。
HIOの細胞間カルシウム波は、 図3Aに示すように定性的に観察することができます。しかし、特定の視野におけるカルシウム波の周波数を決定するには、定量的な分析が必要です。上記のプロトコルのステップ6で説明したように、セグメンテーションを成功させる手順を 図3Aに示します。図は、生の画像(図3Ai)、前のフレームのピクセル強度を差し引いた後の画像(図3Aii)、次にセグメント化されたカルシウム波(図3Aiii)を示しています。
イメージングの過程でカルシウム波をセグメント化し、視野ごとに定量化した後は、さまざまな条件にさらされた単層の波の周波数を比較することが有益であることがよくあります。 図3B のストリップチャートは、模擬単層およびロタウイルス接種単層における視野あたりのカルシウム波の総数を示しています。この例には、ヒトロタウイルス株(Ito HRV)とmRubyを発現するサルロタウイルスSA11組換え株(SA11-mRuby)の2つのRV株が含まれています。模擬感染対照をベースラインカルシウム波動頻度とし、未処理のロタウイルス感染単層を陽性対照とし、ロタウイルスに感染して処理した単分子膜を実験条件とします。ADP受容体阻害剤であるBPTUを含む薬物で処理された模擬感染およびRV感染の単層は、一元配置分散分析によって両方の対照条件と比較できます。このデータは、BPTUが細胞間カルシウム波の頻度を効果的に減少させることを示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> 図1:空腸ヒト腸管オルガノイドにおけるGCaMP6s発現の検証。 (A)レンチウイルス形質導入後、GCaMPを発現するHIOは、直近の継代から7日後に選択および複数回継代を行った。488 nmレーザーで刺激すると、3次元スフェロイド(Ai)として15 μLの基底膜マトリックスに播種された形質導入HIOでGCaMP6sの発現が明らかになります。20倍の対物レンズを使用して50%のレーザー出力で50msの露光を取得し、次いでつなぎ合わせて地下膜マトリックスドーム全体を可視化しました。同様のプロセスを4msの明視野露光(Aii)を用いて実施した。明視野画像では、ドームの中央にある暗いHIOは、培養物が通過する準備ができていることを示しています。(B)HIOを酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、IVコラーゲンでプレコートしたイメージングボトムプレート(直径5mm)をウェルあたり150,000細胞の密度で再播種しました。播種後72時間までに、単分子膜はコンフルエントになり、下流のアプリケーションの準備が整いました。GCaMP の機能を検証するために、488 nm フィルターセットを使用して、50% のレーザー出力で 50 ミリ秒の露光を 2 秒ごとに 4 分間行い、画像を取得しました。 (C) ここに示したトレースは、イメージングの過程で最初の取得に正規化された全視野蛍光強度を表しています。約 20 秒(矢印)で、10 回目の曝露後、100 nM のアデノシン二リン酸(ADP)を添加して、細胞質カルシウム(赤)のスパイクを誘発しました。同量の1x PBSを追加しても、有意な反応は得られませんでした(青)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> 図2:RV感染を促進するためのHIO単分子膜のスコアリング。 (A)図は、25G針を用いて単分子膜をスコアリングするための適切な技術を示す。(B)HIO単分子膜に、mRuby蛍光タンパク質(マゼンタ、矢印)を発現する組換えRV株を感染させ、感染細胞の同定を可能にした。あるいは、天然に存在するRV株を使用する場合、免疫蛍光法を用いて感染細胞を同定することができる。(C)示した画像は、固定、DAPI染色(青)、ロタウイルス抗原(マゼンタ)の抗体標識後の4つの異なるHIO単分子膜のものです。どちらの技術も、単層のスコアリング部分付近の優先的なRV感染を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> 図3:RV誘発性細胞間カルシウム波のセグメンテーションと定量。 GCaMP6 を発現する RV 感染 HIO の 488 nm 曝露を、プロトコルを使用して 1 分ごとに 16 時間取得しました。(A)図は、細胞間カルシウム波のセグメンテーションの過程を示す。まず、前回取得時の画素値(t-1)を各生画像(Ai)から差し引いて、蛍光強度の変化(Aii)を定量化します。次に、実験的に最適化された前のフレームからの強度の最小増加に基づくしきい値が適用されます。次に、細胞間カルシウム波(Aiii)を選択し、単一細胞のカルシウムシグナルを除外するために、画像が最小の連続したシグナル領域でフィルタリングされます。この処理により、各視野でのカルシウム波の定量化が可能になります。この実験では、単分子膜を模擬感染させるか、ヒトロタウイルス(HRV)のITO株に感染させるか、非構造タンパク質3の下流の遺伝子セグメント7(SA11-mRuby)にmRubyをコードする組換え株を感染させました。感染した単層は、ADP受容体阻害剤BPTUで処理するか、未治療のまま放置した。次に、単層を8つの異なる位置で画像化し、各視野のカルシウム波をこのプロトコルに記載されているパイプラインを使用して定量化しました。ストリップチャート上の点は、各位置で検出されたカルシウム波の数を示し、平均とSDをマークした棒グラフに重ね合わされています。 一元配置分散分析とそれに続くDunnettの検定は、RVのいずれの株も細胞間カルシウム波の頻度を非感染群のそれよりも増加させる一方で、BPTU処理はRVを介したカルシウム波の頻度の増加を防ぐことを示しています。**p<0.01、***p<0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td>伝達</td>
			<td>コントロール</td>
		</tr><tr><td>Y-27632(1 mMストック)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>ポリブレン(1 mg/μL ストック)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>レンチウイルス</td>
			<td>変数*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *注を参照</td>
			<td>400 μLまで</td>
			<td>400 μLまで</td>
		</tr></tbody></table>表1:レンチウイルス形質導入培地。 形質導入培地とコントロール培地は、それぞれ2列目と3列目に示した容量の試薬を組み合わせて調製します。細胞あたり10レンチウイルス形質導入単位の感染多重度(MOI)を目指します。社内でパッケージ化されたLVの場合、通常、25~50μLの濃縮LVが必要です。ほとんどの市販のLVの力価は、分析証明書とともに提供されます。
補足コーディングファイル1: バッチ処理によるカルシウム波動定量を可能にするImageJマクロスクリプト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルでは、ウイルスに感染したヒト腸オルガノイドでカルシウムイメージングを行うためのアプローチを説明し、分析へのアプローチを提供します。

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

私たちの研究を通じて、ウイルスが腸管上皮内のシグナル伝達をどのように破壊するかを理解することを目指しています。特に、ウイルスに感染した細胞が、隣接する非感染細胞の調節不全に陥り、病因に寄与する仕組みを理解することに関心があります。最近、ロタウイルスに感染した細胞がADPのパルスを放出し、それが隣接する非感染細胞の調節を低下させ、ウイルスの拡散を促進し、病気を悪化させることを発見しました。カルシウムイメージングは神経科学などの分野で非常に人気がありますが、上皮生物学やウイルス学の研究には広く使用されていません。このプロトコルは、カルシウムシグナル伝達と生きたウイルス感染上皮組織を研究するために、既存の技術とモデルシステムを適応させるアプローチを提供します。オルガノイドを操作して遺伝的にコードされたカルシウム指標を発現させることで、私たちのアプローチは、ヒト腸上皮の細胞多様性を再現するモデルシステムにおいて、一貫性のある再現性のある長期イメージングを可能にします。私たちは、ウイルス誘発性パラクリンプリン作動性シグナル伝達が宿主とウイルスの両方に及ぼす影響を理解することを目指しています。また、今後の研究で、この種のシグナル伝達が他のウイルス間で広く保存されているかどうか、また、その効果が類似しているかどうかも明らかにする予定です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

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学ぶ 遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたライブカルシウムイメージング法で、ロタウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜におけるウイルス誘導パラクリン信号伝達と隣接細胞の機能障害を解析する手法です。

遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング

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