Name: 生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ 初代海馬ニューロンの軸索輸送における病理学的タンパク質の影響を生細胞イメージングで測定する方法。マウス胎児組織を用いた神経変性疾患のメカニズム解明に有用です。

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<meta charset="utf8"></head><body>生細胞イメージングによる初代海馬ニューロンのタンパク質の可視化

<ol><li>Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+in+tauopathies%3A+disease+relevance+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms.</a> Front Neurosci. 11, 572(2017).</li>
<li>Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+axonal+transport+misregulation+in+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Tau and axonal transport misregulation in tauopathies.</a> Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+defects+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport defects in neurodegenerative diseases.</a> J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).</li>
<li>Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+extruded+axoplasm+from+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon.</a> Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).</li>
<li>LaPointe, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminus+of+tau+inhibits+kinesin-dependent+axonal+transport%3A+implications+for+filament+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity.</a> J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+forms+of+tau+inhibit+kinesin-dependent+axonal+transport+through+a+mechanism+involving+activation+of+axonal+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases.</a> J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+in+the+amino+terminus+of+tau+prevents+inhibition+of+anterograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport.</a> Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).</li>
<li>Pigino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+fast+axonal+transport+is+a+pathogenic+mechanism+for+intraneuronal+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+huntingtin+inhibits+fast+axonal+transport+by+activating+JNK3+and+phosphorylating+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fast+axonal+transport+by+pathogenic+SOD1+involves+activation+of+p38+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase.</a> PLoS One. 8 (6), e65235(2013).</li>
<li>Combs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontotemporal+lobar+dementia+mutant+tau+impairs+axonal+transport+through+a+protein+phosphatase+1gamma-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).</li>
<li>Christensen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphomimetics+at+Ser199%2FSer202%2FThr205+in+tau+impairs+axonal+transport+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons.</a> Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. (65), 3634(2012).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Cox, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+isoform-specific+tau+aggregates+suggests+a+common+toxic+mechanism+involving+similar+pathological+conformations+and+axonal+transport+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition.</a> Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).</li>
<li>Tiernan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophosphorylation+of+tau+at+S422+enhances+SDS-stable+dimer+formation+and+impairs+both+anterograde+and+retrograde+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport.</a> Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).</li>
<li>Mueller, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau%3A+a+signaling+hub+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tau: a signaling hub protein.</a> Front Mol Neurosci. 14, 647054(2021).</li>
<li>Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+maintenance+of+the+axon+initial+segment+and+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity.</a> J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).</li>
<li>Basu, H., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuoVadoPro%2C+an+autonomous+tool+for+measuring+intracellular+dynamics+using+temporal+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance.</a> Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.4% トリパンブルー</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>DOT</td><td>RN1700-GMT</td><td></td></tr><tr><td>2.5% トリプシン</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>3 mL シリンジ 21 G 針付き</td><td>Fisher</td><td>14-826-84</td><td></td></tr><tr><td>10 mL プラスチックシリンジ</td><td>Fisher</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>14 G 針</td><td>Fisher</td><td>14-817-203</td><td></td></tr><tr><td>15 G 針</td><td>Medline</td><td>SWD200029Z</td><td></td></tr><tr><td>16 G 針</td><td>Fisher</td><td>14-817-104</td><td></td></tr><tr><td>18 G 針</td><td>Fisher</td><td>14-840-97</td><td></td></tr><tr><td>22 G 針</td><td>Fisher</td><td>14-840-90</td><td></td></tr><tr><td>32% パラホルムアルデヒド</td><td>Fisher</td><td>50-980-495</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td>RRID:AB_2535813</td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>アルーガ微小胚性カプセル鉗子、湾曲; 4"&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-5163</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50x)、無血清</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat 24 ウェル Poly D リジンプレート&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td>08-774-124</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>カストロビエホ 3 1/2インチ 長さ 8 x 0.15 mm 角度シャープハサミ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5658</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>細胞計数装置</td><td></td><td></td><td>自動または手動</td></tr><tr><td>生細胞チャンバーアタッチメント</td><td>付き共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点イメージングソフト</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (Worthington)</td><td>Fisher</td><td>NC9185812</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Fatal-Plus Solution</td><td>VortechPharmaceuticals, Ltd</td><td>NDC 0298-9373-68</td><td>ペントバルビタールナトリウム;他の承認された安楽死方法が使用できます&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン試薬溶液</td><td>Gibco</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>グルタミン代替品</td></tr><tr><td>ハンクスの平衡塩溶液</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ version 1.51n</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Life-Line version 2017 5月30日:https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>KymoAnalyzer (バージョン 1.01)</td><td>Encalada ラボ</td><td></td><td>パッケージには、6 つのマクロすべてが含まれています: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022050</td><td>P3000 トランスフェクション エンハンサー試薬と併用</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャー</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MES 水和物</td><td>シグマ</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ 3.5インチ ストレートシャープ/シャープ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5910</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>ニューロバサルプラス ミディアム</td><td>ギブコ A3582901</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニューロファシン (A12/18) マウス IgG2a</td><td>UC デイビス/NIH ニューロマブ</td><td>75-172</td><td>RRID:AB_2282826; 250 ng/mL;マウスニューロンではなく、ラットニューロンで機能します</td></tr><tr><td>Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG</td><td>Cell Signaling</td><td>15034</td><td>RRID:AB_2773024; 500 ng/mL;マウスニューロンで働き、ラットニューロンでテストしていません</td></tr><tr><td>新生児ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>16010-167</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>P3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022057</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、100 x 10 mm ガラス</td><td>フィッシャー</td><td>08-748B</td><td>解剖用; オートクレーブ</td></tr><tr><td>ペトリ皿、100 x 20 mm ガラス</td><td>フィッシャー</td><td>08-748D</td><td>子宮角を中に入れる。オートクレーブ</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P7886-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン円錐遠心分離管(15 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン円錐遠心分離管(50 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>ΣS5636</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸ナトリウム十水和物</td><td>VWR</td><td>MK745706</td><td></td></tr><tr><td>ストレートブレード操作はさみブラント/シャープ</td><td>フィッシャー13-810-2</td><td></td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>シリンジフィルター、0.22 & マイクロ;m</td><td>VWR</td><td>514-1263</td><td></td></tr><tr><td>親指ドレッシング鉗子、鋸歯状、4.5 "</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>&micro;-スライド4ウェルガラスボトム</td><td>Ibidi</td><td>80427</td><td></td></tr></tbody></table>

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

これらの方法を使用して、野生型または疾患関連の形態のタウタンパク質の存在下での軸索輸送を特徴付け、疾患における病理学的タウ誘発性神経毒性の潜在的なメカニズムを調べました12,13。KymoAnalyzerソフトウェアは、特定のフォルダ内のすべてのキモグラフからさまざまなパラメータを計算し、プールします。輸送速度は、貨物が移動しているとき(セグメント速度)と、一時停止を含む全体的な速度(正味速度)のみが計算されます。貨物量は、総量、密度(#tracks/μm)、フラックス(#tracks μm-1・s-1)で算出します。ランレングスは、個別に計算されるか、または組み合わされて、一時停止間の平均移動距離を決定します。貨物の一時停止は、時間と頻度、および貨物が動いていない時間の割合(つまり、0.1 mm/s&lt;移動)によって特徴付けられます。ほとんどの測定値は、順行方向と逆行方向、および合計(両方向の組み合わせ)で計算されます。さらに、方向の反転の頻度とタイミングが計算されます。...

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal ...

using-live-cell-imaging-to-measure-effects-pathological-proteins-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。...

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは​​、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。...

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

このレポートでは、ニューロンの細胞膜に発現する外因性、pH感受性GFPタグ融合タンパク質の表面発現、輸送経路や人身売買の速度を決定するための生細胞イメージングと光退色技術の使用について説明します。...

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

BDNF、神経栄養因子の軸索輸送は、いくつかのニューロン集団の生存と機能に重要である。いくつかの変性疾患は、軸索の構造と機能の破壊でマークされています。私たちは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内のQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証した。...

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169...

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

ここで、脳にアミロイド β (a β) の初期の影響を調査するためのプロトコルが表示されます。 これは、a β がクラスリン依存性エンドサイトーシスと軸索成長円錐の崩壊を誘発することを示しています。プロトコルは有用性軸索成長円錐の a β...

軸索の成長円錐の破壊とマウスの培養神経細胞の初期のアミロイド β 効果の可視化

ここでは、巨大なアンキリンGがないために組み立て済みのAISを欠く海馬ニューロンの軸索初期セグメント(AIS)の組み立てと構造を定量的に研究するプロトコルについて説明した。...

主培養海馬ニューロンを用いた軸索初期セグメントの組み立て研究

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

トランスジェニック蛍光マウスを用いて、生きた動物における無傷の坐骨神経の運動軸索および感覚軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するための詳細なプロトコールが記載されている。...

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

ここでは、hSOD1G93Aラットモデルにおける筋萎縮性側索硬化症の病態生理に関する研究のために、細胞内Ca2+のタイムラプスビデオイメージングのために、ラット皮質からグリア細胞、アストロサイト、およびミクログリアの初代培養を調製する方法に関するプロトコルを紹介します。...

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

学ぶ 初代海馬ニューロンの軸索輸送における病理学的タンパク質の影響を生細胞イメージングで測定する方法。マウス胎児組織を用いた神経変性疾患のメカニズム解明に有用です。

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

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