Name: 透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚への腫瘍異種移植の簡便・迅速な方法。CM-Dil染色とフローサイトメトリーにより細胞生存と病態負荷を評価し、血液がん研究の新たな治療法開発に貢献する。

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この作業は、NIHの助成金R37AI110985とP30CA006927、ペンシルベニア州、白血病リンパ腫協会、およびビショップ基金からの予算によって支援されました。この研究は、Fox Chaseの中核施設であるCell Culture、Flow Cytometry、Laboratory Animal施設からも支援を受けました。FCCCのゼブラフィッシュとマイクロインジェクション施設を維持してくださったJennifer Rhodes博士に感謝します。

ゼブラフィッシュ幼生の効率的なIn vivo腫瘍研究への活用

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著者は、競合する利益を宣言しません。

ゼブラフィッシュの異種移植は、マウス研究に代わる迅速で堅牢で費用対効果の高い方法として浮上しています12。ゼブラフィッシュの異種移植にはいくつかのアプローチが報告されていますが、私たちの適応は大幅な改善をもたらしました。これらの改善は、手技に関するパラメータを標準化することに加えて、腫瘍注射の実施速度を加速することに特に焦点を当てているため、研究群あたりの動物数の増加が可能になり、腫瘍標識を使用して注射の質と注射後の行動をモニタリングすることができます。 
ここで説明するこの方法の改善は大きな可能性を秘めていますが、この戦略を成功裏に実行するには、熟練した実務家と特定のアプリケーションの最適化が必要です。白血病細胞を用いた。その結果、固形がんの使用はさらなる課題をもたらす可能性があります。このような腫瘍は凝集しやすい場合があり、これにより細胞ボーラスの送達にばらつきが生じる可能性があります。ただし、そのような状況でも、RFPラベリングにより、ボーラスの適切な注射後品質管理が可能になるはずです。これは、自家蛍光によって不明瞭になるGFP標識や緑色染料よりも優れています。最後に、成功に影響を与えるほとんどのパラメータ(胚の健康、水産養殖温度、針の開口部、注入圧力など)をここで標準化することで、このプロセスの変動性を最小限に抑えることができます。 
ゼブラフィッシュの異種移植実験で考慮すべき主要な事項は、注射部位です。ここでは、卵黄への注射が、ペリビテリン腔34、キュビエ管35、および心内注射(心室)36のような他のより技術的に困難な部位と比較して非常に容易であることを示した。卵黄注射の欠点は、成長中の胚にとって重要な器官であるため、注射の外傷によって胚が死なないように、針の直径と圧力が慎重に制御されるように注意する必要があることです。ここで説明するアプローチは、怪我を最小限に抑え、明らかな怪我や死亡を1 dpiで破棄することで、これらの問題は腫瘍の成長に関連しないため、この懸念を軽減します。注射部位に関する最終的な考慮事項は、異なる微小環境が異種移植腫瘍の増殖をサポートする能力が多かれ少なかれある可能性があるということです。したがって、おそらく、より困難な同所性注射に進む前に、まず卵黄注射を行うことができるでしょう。卵黄注射の主な利点は、正確な胚の病期分類を必要としないため、より多くの胚をより迅速に注入できるため、胚の健康をよりよく維持し、移植された腫瘍細胞の挙動の違いを解決するための統計的検出力が向上することです。
注射後の疾患進行のモニタリングは、通常、Kaplan-Meier分析37を使用して生存への影響を通じて評価されます。しかし、疾病負荷検査も非常に有益です。注射部位に残存する移植細胞については、腫瘍細胞の標識方法が自家蛍光29によって不明瞭にならない場合、腫瘍負荷は種々の顕微鏡法を用いて定量化することができる。CM-Dil染色は容易に分解され、自家蛍光の影響を受けないため、限局細胞の腫瘍負荷を定量化するのに適しています。この課題は、腫瘍細胞が注射部位に残らず、播種しない場合に発生します。このような場合、フローサイトメトリーは、赤色蛍光タンパク質を用いた消えない遺伝子マーキングと相まって、ゼブラフィッシュ細胞とは異なる種特異的な染色物を用いて標識腫瘍を解析できるため、標準化された胚の疾患負荷をモニタリングする非常に効果的な方法です。CM-Dilの欠点の一つは、細胞分裂によって希釈されることである38。したがって、RFPまたはmCherryを使用した腫瘍の遺伝的マーキングを使用した適応には、大きな利点があります。mCherryの発現は、腫瘍特異的抗体と組み合わせることで、宿主のゼブラフィッシュ細胞が提供する複雑なバックグラウンドシグナルのパターンの中で、移植された細胞を確実に同定することができます。 
これらを総合すると、本研究で用いた最適化されたゼブラフィッシュ異種移植アプローチと解析法は、すでに強力な実験プラットフォームに大幅な改善をもたらします。

in vivoでの遺伝子改変または薬物治療に応答した腫瘍の挙動の解析は、がん研究の重要な要素である1,2,3,4。このような研究は、ほとんどの場合、免疫不全マウス(Mus musculus)モデルの使用を伴います5。しかし、マウスでの異種移植研究は、限られた容量、長期にわたる期間、多額の費用、および内部腫瘍の進行を監視するための高度な画像装置の必要性など、多くの点で制限されています6,7。対照的に、ゼブラフィッシュモデル(Danio rerio)は、より大きな容量、より短い期間、より低い費用を可能にし、そしてその透明性により、疾患の進行を簡単に監視することができます8,9。
ゼブラフィッシュは、子宮外で発生し、繁殖力が高い、よく発達した脊椎動物モデルシステムであり、個々のメスは100個以上の胚を産生します10。また、ゼブラフィッシュの胚は透明であるため、レポーターなどの蛍光関連技術を用いて発生過程を容易に可視化することができます。最後に、重要な発生過程の保存は、移植された悪性細胞の挙動を含む多くの種類の研究にとって理想的なモデルとなる11,12。野生型のゼブラフィッシュの胚はメラノサイトを発達させ、生後2週間までに光学的に不透明になりますが、これはキャスパーの胚(roya9;MITFAW2)は、生涯を通じて透明なままです13。その光学特性により、キャスパーゼブラフィッシュは移植された腫瘍細胞14,15,16の理想的なレシピエントです。ゼブラフィッシュへの腫瘍細胞の異種移植は、過去20年間で重要性を増しています17,18,19,20,21。ゼブラフィッシュの胚は自然免疫を持っています。しかし、幼虫期には適応免疫がないため、機能的に免疫不全になり、移植された腫瘍異種移植片の効果的な宿主として機能することができます22。
ゼブラフィッシュの胚だけでなく、多くの異なる変数23,24,25,26,27を考慮した成体における腫瘍生着のためのプロトコルが開発されています。これらは、卵黄、ビテリン周囲腔、心臓、およびさまざまな発生段階におけるゼブラフィッシュの腫瘍沈着の多数の部位を調査してきました16,28。ゼブラフィッシュのゼノグラフトの水産養殖の周囲温度も重要で、ゼブラフィッシュの飼育は通常28°Cで行われ、哺乳類の細胞は37°Cで増殖します。 したがって、魚が許容しながら腫瘍の成長をサポートする妥協的な温度を採用する必要があり、34°Cは両方の目標を達成するように見えます29。異種移植後の腫瘍の挙動と進行の分析は、もう一つの主要な焦点領域であり、これには、生存分析30だけでなく、さまざまな画像診断法の使用が含まれます。ゼブラフィッシュモデルの主な利点の1つは、腫瘍の挙動に関するin vivo研究に計り知れない統計的検出力を提供するために、多数の研究動物を利用できることです。しかし、以前のアプローチでは、注射のための面倒な取り付け手順が必要なため、この可能性は大幅に制限されていました。
ここでは、透明な キャスパー ゼブラフィッシュ系統を使用して、高スループットと注入品質のモニタリングを可能にする、胚をステージングするためのシンプルで迅速な方法を開発することで、この制限に対処します。これは、受精後2日(dpf)に キャスパー ゼブラフィッシュ胚の卵黄嚢に異種移植片を注入することを伴う。異種移植後の胚の生存を腫瘍挙動解析の一環として観察します。さらに、異種移植後の疾患負荷の評価を、シングルセル懸濁液を作製し、フローサイトメトリーで解析する方法を示します(図1)。

<table><tbody><tr><td>1-フェニル 2-チオ尿素 (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>70ミクロンセルストレーナー</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>90 mm シャーレ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S43565</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Apex バイオリサーチ</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>APC APC 抗マウス CD45.2 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSymphony A5</td><td></td></tr><tr><td>キャリブレーション キャピラリー</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P1424-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>セルトラッカー CM-dil 色素</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>Collageanse IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 鉗子番号 55</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>モデルSMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細血管(ホウケイ酸)</td><td>世界の精密機器</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>ヘリックス NP</td><td>ブルー バイオレジェンド</td><td>425305</td><td></td></tr><tr><td>インスタントオーシャン シーソルト</td><td>インスタントオーシャン</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>モデルSMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>シグマ</td><td>M9140-100G</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー (細胞を敷設するための長い先端)</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>P1000マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter instruments</td><td>model P-97</td><td></td></tr><tr><td>PM 1000 cell microinjector</td><td>MicroData Instruments, Inc. (MDI)</td><td>PM1000</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)</td><td>ゼイグラー</td><td>388763</td><td></td></tr></tbody></table>

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

腫瘍の挙動に関するin vivo研究は、がん研究の定番です。しかし、マウスの使用には、コストと時間の面で大きな課題があります。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生を移植モデルとして紹介しますが、これはマウスモデルに比べて取り扱いの容易さ、低コスト、実験期間の短縮など、多くの利点があります。さらに、幼虫期には適応免疫系がないため、免疫不全株を作製して使用する必要がなくなります。ゼブラフィッシュの胚における異種移植のための確立されたプロトコルが存在しますが、ここでは、より迅速な移植のための胚の病期分類、生存分析、および疾患負荷を評価するためのフローサイトメトリーの使用を含む改善された方法を紹介します。胚は、幼虫の卵黄への迅速な細胞注入と、注入された細胞ボーラスの一貫性を監視するための細胞マーキングを容易にするためにステージングされます。注射後、胚生存分析は注射後7日まで評価されます(dpi)。最後に、転写された細胞を蛍光タンパク質で標識し、フローサイトメトリーで解析することにより、疾患負荷も評価されます。フローサイトメトリーは、ゼブラフィッシュの胚から細胞懸濁液を調製する標準化された方法によって可能になり、ゼブラフィッシュ細胞の初代培養の確立にも使用できる可能性があります。要約すると、ここで説明する手順により、研究群あたりの動物数が多いin vivoでの腫瘍細胞の挙動をより迅速に、より費用対効果の高い方法で評価できます。

異種移植 図1には、胚産生から生存率による疾患進行の評価、フローサイトメトリーによる疾患負荷解析まで、実験と解析の全体像が示されています。このアプローチにより、異種移植の再現性とスケーラビリティを向上させるいくつかの改善がもたらされるだけでなく、疾患の負担を評価する新しい方法が追加されます。これらの実験の成功は、移植された細胞の健康に大きく依存しており、健康でなく、対数期にある細胞は移植時に増殖できません。インジェクションセッションの期間も重要なパラメータです。腫瘍細胞を調製した後、3〜4時間以内にゼブラフィッシュへの注射を完了することが重要です。この研究で使用されたアプローチでは、アガロースプレート上で直接胚を横向きにステージングし、卵黄に注入するという単純な変更により、この時間枠内により多くの胚を注入することができます(図2C、D)。さらに、十分な細胞(400〜600細胞)が注入され、オリフィスが胚が損傷するほど大きくならないように、最適な針オリフィスを選択することが不可欠です。もう一つの考慮事項は射出圧力です。12〜13 psiを超える圧力が胚の卵黄を破壊し、死を引き起こすことがわかりました。最後に、この手順に固有の別の変動性は、注射の一貫性です。注入する細胞は注射針の端に落ち着くため、注射ボーラスの正確な制御が困難になります。細胞を異種移植すると、すべての胚が同じ注入ボーラスを受ける可能性がありますが、実際にはそうではありません(図3)。移植される細胞の数は、腫瘍細胞の挙動(凝集など)とオペレーターのスキルレベルによって大きく異なります。私たちは、CM-Dil染色/mCherry標識を通じてこの不確実性に対処し、これにより、適切で一貫性のある細胞ボーラスを投与された動物と劣ったボーラスを投与された動物を注射後に分類することができます。CM-Dil染色は、蛍光タンパク質によるより効果的なマーキングですが、顕微鏡またはフローサイトメトリーによる疾患進行のモニタリングを容易にするという追加の利点があります(図4および図5)。
腫瘍挙動解析 腫瘍の進行は、RFPに焦点を当てた単純な蛍光顕微鏡を使用して簡単に監視できます(図4A)。同様に、従来の生存モニタリングは、Kaplan-Meier分析(Log-rankおよびWilcoxon検定)によって実行できます(図4B)。印象的なことに、マウスベースの異種移植研究では、通常、研究群あたり8〜10匹の動物がいますが、ここで説明したゼブラフィッシュ法を使用すると、それぞれ60匹を超える研究群を達成することは難しくありません(図4B)。これにより、 in vivo 研究の分解能が著しく向上します。最後に、フローサイトメトリーを使用した疾患負荷解析のための別のアプローチを実装しました。これには、同数の胚を破壊し、得られた単一細胞懸濁液の腫瘍細胞含有量をフローサイトメトリーによって分析することが含まれます。腫瘍特異的な細胞表面マーカーと蛍光タンパク質インジケーターを組み合わせることで、異種移植されたマウス/ヒト細胞を、疾患負荷を評価するアプローチとしてフローサイトメトリーで自信を持って同定できます(図5)。この目的のためには、緑色蛍光タンパク質は宿主ゼブラフィッシュ細胞の自家蛍光よりもシグナルを提供できなかったため、赤色蛍光タンパク質が優れています。ここでは、mCherryは、CD45とともにFACS分析のための異種移植の過程を通じて、細胞の標識とモニタリングに使用されました。二重標識により、良好なボーラス接種と劣ったボーラス接種との間の腫瘍負荷の違いを測定することができました(図5B、C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig01.jpg"> 図1:異種移植および注射後の分析手順全体の概略図(A)繁殖セットアップ、胚収集、および受精後2日(dpf)の形態が図式化されています。(B)ゼブラフィッシュ胚の卵黄における異種移植のための白血病細胞の調製、染色、および注射。(C)生存およびフローサイトメトリーを含む異種移植後の分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig02.jpg"> 図2:注射に使用した器具の代表的な画像 (A)ペトリプレートで針を引っ張った状態。(B)胚の病期分類用のアガロースプレート。(C,D)胚ローディングプレートに注入するための胚のステージアップを示すプレート(パネルCの代表図とパネルDの実際の胚(赤丸部分))。パネルDの右下隅にある挿入図は、ステージングされた胚の高倍率のビューを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig03.jpg"> 図3:異種移植された胚の代表的な画像。 1 dpiでの casper 胚の卵黄中のCM-Dil染色(赤)陽性細胞の明視野および免疫蛍光画像を示しています(クラッチ画像)。下ボーラスの胚は黄色の矢印で示され、形態が乱れた胚はアスタリスクで示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig04.jpg"> 図4:蛍光イメージングと生存解析による疾患進行の評価。 (A)4dpiおよび7dpiでの異種移植胚の代表画像。(B)遺伝的に異なる2つの白血病系統を持つ胚の生存分析を示すKaplan Meierプロット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66164/66164fig05.jpg"> 図5:異種移植ゼブラフィッシュにおける疾患負荷のフローサイトメトリー解析(A)細胞懸濁液およびフローサイトメトリー解析の調製の概略図。簡単に説明すると、4 dpiの胚は、トリプシンとコラゲナーゼを使用してシングルセル懸濁液に分解され、続いてフローサイトメトリーが行われます。(B)フローサイトメトリー解析の代表的なプロットで、各パネルの左の画像がFSC-A v/s SSC-Aプロット、右の画像がCD45 v/s mCherryシグナルです。(C)CD45 v/s mCherryプロットから得られた異種移植細胞の細胞統計を示す棒グラフ(各反復(n = 3)ごとにn=45、40、および40;p値*≤0.05、GraphPad Prism 9のウェルチ補正による対応なしt検定を使用して計算)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66164/66164fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

透明ゼブラフィッシュ胚の卵黄への異種移植のプロトコルについて、シンプルで迅速な病期分類法によって最適化されています。注射後の解析には、生存率と、フローサイトメトリーによる異種移植細胞の疾患負荷の評価が含まれます。

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

私たちは、正常造血と悪性造血の制御に関する分子的な洞察を得て、その洞察を活用して血液がんの治療のための新しい治療法を開発することを目指しています。腫瘍異種移植片は、遺伝子の変化や治療が腫瘍の挙動に与える影響を評価するために不可欠なツールです。しかし、マウス異種移植片は高価で時間がかかり、範囲が限られています。ゼブラフィッシュを腫瘍異種移植に使用すると、これらすべての欠点が克服されます。このプロトコルでは、異種移植の簡単で迅速なマウントプロセスを実証し、スループットを向上させます。さらに、細胞染色を用いて接種物の品質を把握し、フローサイトメトリーを用いて疾患負荷を評価または定量化することで腫瘍の進行を評価します。このアプローチを使用して、ヒトの癌の大部分を引き起こすRas/MAPキナーゼカスケードの機能を遮断する新しい方法を特定する予定です。そして、それはRas/MAPキナーゼカスケードの触媒活性をブロックしようとするのではなく、それが修飾するがんを引き起こす基質をリン酸化する能力を防ぐことによって行われます。

a-simple-rapid-effective-method-for-tumor-xenotransplantation

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透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

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