Name: クライオ電子顕微鏡サンプル調製のためのストレプトアビジン-アフィニティーグリッド作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 学ぶストレプトアビジン-アフィニティーグリッド作製法。クライオ電子顕微鏡サンプル調製におけるタンパク質変性と配向バイアスを低減し、構造生物学研究の品質向上に貢献する革新的なプロトコルです。

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T.C.は、米国国立総合医学研究所の分子生物物理学研修助成金GM-08295および米国国立科学財団大学院研究フェローシップ(助成金番号DGE 2146752)の支援を受けました。R.G.とB.H.は、R.G.とB.H.に授与された国立衛生研究所の助成金R21-GM135666の支援を受けました。この研究は、E.N.E.N.に授与された国立総合医学研究所の助成金R35-GM127018によって部分的に資金提供されました。

クライオ電子顕微鏡構造研究のためのストレプトアビジンアフィニティーグリッドの作製

<ol><li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlaeser%2C+RM+%22Single-particle+Cryo-EM+of+Biological+Macromolecules.+IOP+Publishing%22">Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing</a>. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+cryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Williams, R. C., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+carbon+support+films+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrathin carbon support films for electron microscopy.</a> Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+shelf-life+streptavidin+support-films+suitable+for+electron+microscopy+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+biotinylated+protein+complexes+bound+to+streptavidin+monolayer+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals.</a> Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).</li>
<li>Domínguez-Martín, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li>
<li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393(2021).</li>
<li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638(1988).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
</ol>

当社のプロトコールでは、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの作成方法と使用方法、およびストレプトアビジン回折シグナルを含むデータの処理方法を説明しています。プロトコルには、特別な注意が必要ないくつかの重要なステップがあります。
グリッドバッチの失敗は、いくつかの一般的なエラーにまでさかのぼることができます。エラーの最も一般的な原因は、古い試薬や低品質の試薬を使用することです。ビオチン化脂質溶液は、プロトコールに記載されているとおりに調製することが特に重要です。さらに、実験器具の界面活性剤の残留物や皮膚に自然に存在する油分などの不純物は、ストレプトアビジン結晶の品質、ひいては得られる画像の品質に影響を与える可能性があります。したがって、最初の炭素蒸発の前にグリッドの洗浄サイクルを3回実行して、グリッドメーカーから界面活性剤汚染の可能性を除去することをお勧めします(ステップ2.1)。さらに、ひまし油の汚染または不純物は、グリッド上の結晶形成を妨げることが観察されています。
脂質単層を作って拾う作業は、少量の脂質の感触をつかむために数回練習する必要がある作業です。ネガティブ染色されたグリッドに見られるストレプトアビジン結晶の品質に最終的に反映されるように、適切な脂質単分子膜が生成される前に、このステップが最初の2〜3回失敗することは珍しくありません(図4C)。
グリッド製造プロセス(ステップ3.12-3.20)中にグリッドの裏側(金側、脂質側)を濡らさないことが重要です。裏面が濡れた場合は、グリッドを廃棄することをお勧めします。これにより、画質を損なう大きな脂質小胞が出現する可能性があります(図5D)( 表1の行3)。脂質単層を塗布した後の洗浄が不十分なために、脂質小胞が観察されることもあります(ステップ3.13)。ストレプトアビジンを添加する前に、脂質単層に触れた後、結晶化緩衝液を使用したその後の3回の洗浄が推奨されます。
炭素の薄い層がトレハロース包埋グリッド上に蒸発した後、格子品質を損なうことなくグリッドの裏側を濡らすことができます。例えば、サンプルバッファーに最小限の界面活性剤が含まれている場合でも、裏面の濡れが頻繁に観察されます。サンプルによる裏面の湿潤化は、サンプルが裏面の薄い炭素膜に非特異的に結合する可能性があり、粒子が空気と水の界面に拡散するのを防ぐ効果や、オングリッド精製戦略のためのアフィニティー結合の使用の有効性を低下させます。可能であれば、界面活性剤なしでサンプルをグリッドに追加します。洗剤やその他の添加剤は、グリッド洗浄ステップ中に後で追加することも、ガラス化前の最終ステップで追加することもできます。これは、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用に対する1つの制限です。ただし、優先配向を改善することが目的である場合、界面活性剤を含むバッファーを使用したサンプル前処理は正常に実行されています11。
エラーの一般的な原因は、両方の炭素蒸発ステップ(ステップ2.3とステップ3.21)に対するグリッドの年齢にまでさかのぼることができます。このプロトコルでは、クライオ電子顕微鏡にストレプトアビジングリッドを使用する前に、裏面炭素蒸発後5〜7日間の待機期間が推奨されています。製造後すぐにグリッドを使用すると、格子と脂質単層がグリッドの穴から移動することが観察されています。グリッドが古すぎて6か月後に使用した場合も、同様の観察を行うことができます(図5A)(表1の行1)。この観察は、脂質単層とストレプトアビジン結晶を安定化させるために適用される炭素バッキングの疎水性の変化によって説明されるという仮説を立てています。さらに、ストレプトアビジン格子は、第1の炭素蒸発層(ステップ2.3)が十分に経年変化していないグリッドに単層を適用すると、モザイク状(図5B)(表1の行3)に現れ、ネガティブ染色とクライオ電子顕微鏡の両方で壊れることがあります。
その他の一般的なエラーの原因は、ストレプトアビジン結晶性単層の脆弱性に起因します(脂質単分子膜自体が流動的であり、可逆的に膨張または圧縮する可能性があります)。裏面炭素蒸着(ステップ3.21)は、サンプルの吸着、洗浄、クライオ電子顕微鏡ブロッティングプロセスにおいて、単層とストレプトアビジン格子の両方に重要な安定性をもたらします。グリッドの裏側への炭素蒸発が十分でない場合、ブロッティング/凍結後にストレプトアビジン格子が断片化しているように見えることがよくあります(図5C)( 表1の行2)。このプロトコルでは、片面ブロッティングに片面自動プランジフリーザーの使用を提案します。この方法により、凍結プロセス中にストレプトアビジン格子が保持され、サンプルアプリケーションとブロッティングパラメーターの合理化された最適化を可能にする、再現性の高いブロッティング条件が得られます。或いは、他の自動プランジ凍結装置が手動ブロッティングと組み合わせて使用されている。これを行うには、デバイスの設定で実際のブロッティング機能を無効にし、代わりに、吸い取り紙を保持したピンセットをサイドエントリに通してグリッドをブロットします。この方法は、片面ブロッティングおよびプランジ凍結装置なしでラボで高品質の結果を達成できます。ただし、グリッド間の再現性は困難です。
ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用には多くの利点がありますが、この方法にはいくつかの制限を考慮する必要があります。手順の性質上、通常、プロセス全体が完了するまでストレプトアビジン格子の品質を評価することはできません。サンプルを凍結する前に、ネガティブ染色によって各バッチの品質をすばやくスクリーニングすることをお勧めします。ストレプトアビジン格子が生の画像に寄与するシグナルのため、画像のみから十分な数の無傷の分散粒子があるかどうかを評価することが困難な場合があります。同じ理由で、データ取得中のクライオ電子顕微鏡データのオンザフライ処理は、ストレプトアビジンシグナルの減算手順がデータ前処理パイプラインに含まれていない限り不可能です。ストレプトアビジンシグナルは通常、フレーム自体ではなく、動き補正された画像から差し引かれるため、一般的なソフトウェアスイートで実装されているベイジアン研磨は、説明されている減算手順を使用すると失敗する可能性があります。それゆえ、データ処理の開始から粒子の動きを最小化するために、複数のパッチでモーション補正を行うことが推奨される16。
これらの制限にもかかわらず、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドには多くの利点があります。ストレプトアビジンアフィニティーグリッドが標準的なオープンホールクライオ電子顕微鏡グリッドよりも優れている2つの主な利点は、サンプルを空気と水の界面から保護し、グリッド上に低存在量(10-100 nM)のサンプルを濃縮する手段です。炭素や酸化グラフェンなどの他の支持層も、これらのサンプル調製のボトルネックを克服するための戦略として使用できます。一例では、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドは、架橋アプローチと互換性のないタンパク質-核酸相互作用の無傷の再構築を得るための唯一のソリューションでした。12名
ストレプトアビジンアフィニティーグリッドがもたらすもう一つの大きな利点は、炭素や酸化グラフェンなど、他の支持層に吸着し、目的のサンプルの3D再構成を得る能力を妨げる好ましい配向を持つサンプルに対するソリューションです。市販のキットを用いたサンプルのランダムビオチン化により、目的のサンプルをストレプトアビジン単分子膜にランダムに結合させることで、この課題を克服するためのより多くの潜在的な見解を得ることができます。
さらに、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドには、アフィニティーベースのグリッドに特有の利点があります。ストレプトアビジン-ビオチン相互作用の高い親和性と特異性により、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドと、ビオチンが関与する他のワークフローを結合して目的の複合体を精製することができます。発表された1つの例では、ストレプトアビジン親和性グリッド上の複合体を固定化し、未知の化学量論の結合パートナーを大量にインキュベートしました。結合していないタンパク質を洗い流した後、正しく組み立てられたスーパー複合体が得られ、クライオ電子顕微鏡11 ですぐに分析することができました。将来的には、ストレプトアビジン結合タンパク質タグ、Aviタグシステム、または近接標識アプローチをストレプトアビジンアフィニティーグリッドと組み合わせて、標準的な精巧な精製スキームを使用せずに、組換え体または内因性の供給源から直接単一のタンパク質および/またはタンパク質複合体を抽出することが考えられます。
このプロトコールを提供することで、ラボはストレプトアビジンアフィニティーグリッドの作製を容易に再現し、クライオ電子顕微鏡によるタンパク質複合体の構造解析に一般的に使用されるツールとして確立できるはずです。

クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)は、これまでX線結晶構造解析や核磁気共鳴1ではアクセスできなかった、大きくて柔軟で不均一なサンプルの高分子構造決定を可能にすることで、構造生物学の分野に革命をもたらしました。この方法は、溶液中の高分子を瞬間凍結してガラス質の氷の薄層を作成し、その後電子顕微鏡を使用して画像化することができます。近年、顕微鏡ハードウェアと画像処理ソフトウェアの大幅な進歩により、クライオ電子顕微鏡による高分解能構造決定に適した試料の種類がさらに拡大しています。
それにもかかわらず、薄いガラス化サンプルの調製は、クライオ電子顕微鏡による高分子構造決定において最も重要なステップの1つです。生体サンプルは動的で壊れやすく、変性しやすいことが多く、クライオ電子顕微鏡研究用に少量しか入手できないこともあります。ブロッティングプロセス中、これらの粒子は疎水性の空気-水界面と相互作用し、粒子が好む配向、壊れやすい錯体の分解、サンプルの部分的または完全な変性、および凝集を引き起こす可能性があります2,3,4。界面活性剤やその他の界面活性剤の使用、化学的架橋、および層を支持するためのサンプルの吸着は、凍結プロセス中に生物学的サンプルを保存するための一般的な戦略です。酸化グラフェン5,6,7やアモルファスカーボン8などの支持層も、サンプルが限られた量しか入手できない場合に、吸着によって粒子をグリッド上に濃縮する機能も備えています。しかし、これらの方法は一般的でも信頼性もなく、グリッド準備の最適化には非常に時間がかかるか、完全に失敗する可能性があります。
ストレプトアビジン親和性グリッド9,10は、これらの欠点を克服し、目的の複合体を隔離し、空気-水界面から保護するための穏やかで一般的に適用可能な方法を提供するために開発されました。これらのグリッドは、グリッド上のビオチン化脂質の単層上に成長した2次元(2D)ストレプトアビジン結晶格子を利用します。サンプル自体がビオチン化された後(多くの場合、まばらかつランダムに、つまり複合体ごとに平均して1つのビオチンを意味します)、ストレプトアビジンでコーティングされたグリッドに適用できます。サンプルの吸着は、ストレプトアビジンとビオチンの非常に高い親和性に依存しているため、これらのグリッドでは10 nMという低い濃度のサンプルを使用できます。市販のタンパク質用ビオチン化キットおよびDNA含有複合体用ビオチン化プライマーにより、目的のほとんどのサンプルに必要なビオチン部分を比較的容易に結合させることができます。ブロッティング中にサンプルを濃縮し、有害な空気と水の界面から遠ざけることに加えて、1つまたはわずか数個のリジン残基をランダムにビオチン化することで、クライオ電子顕微鏡グリッド上の目的分子の配向範囲を大幅に改善できることが、多くの研究で実証されています11。基礎となるストレプトアビジン結晶からのシグナルは生の画像に存在しますが、結晶からの鋭いブラッグ反射のフーリエフィルタリングを含むデータ処理スキームは、初期のデータ処理中に簡単に除去でき、最終的に目的のサンプルの高解像度再構成が可能になります11,12,13.ここでは、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの頑健な産生とその後のクライオ電子顕微鏡実験での使用のために、最適化された段階的なプロトコルが提供されています。提供されるプロトコルは、2週間で完了することが期待されています(図1A)。プロトコルの最初の部分では、試薬の調製、グリッドの前処理、および最初の炭素蒸発ステップについて説明します。次に、脂質単分子膜の調製およびEMグリッド上でのストレプトアビジン結晶の成長に関する説明を説明する。さらに、ネガティブ染色EMおよびクライオ電子顕微鏡実験におけるストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用に関する説明書も記載されています。最後に、クライオ電子顕微鏡データを取得したら、顕微鏡写真からストレプトアビジンシグナルを除去する手順を示します。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジパルミトイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)ナトリウム塩&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285P</td><td>粉末として提供されます。1&ndashの濃度で溶解します。10 mg/mL &nbsp;クロロホルム/メタノール/水溶媒中、65:35:8 V / V、および-80°Cで使い捨てアリコートに保存します。C</td></tr><tr><td>200プルーフ 純エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu;Lハミルトンシリンジ&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>87930</td><td>5 & マイクロ;L マイクロリットル シリンジ モデル 75 RN、小型取り外し可能針、26 G、2 インチ、ポイント スタイル 2</td></tr><tr><td>ひまし油</td><td>シグマ アドリッチ</td><td>259853</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿 未処理 (35 mm)</td><td>バイオ ベーシック</td><td>シ</td>リンジ SP22146 <td></td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-トレハロース二水和物、デンプンから、&ge;99%</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT アンチキャピラリーリバース(自己閉鎖型) ピンセット バイオロジーグレード</td><td>テッドペラ</td><td>510-5NM</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレード メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>ライカEM ACE600 高真空スパッタコーター</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカEM GP2 自動プランジフリーザー</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クアンティフォイル R2/1 AU300&nbsp;</td><td>クォンティフォイル</td><td>Q84994</td><td></td></tr><tr><td>ステプタビジン</td><td>ニューイングランド バイオサイエンス</td><td>N7021S</td><td>1 mg/mL 溶液として提供されます。結晶化バッファー中で最終濃度0.5 mg /mLに希釈し、最終トレハロース濃度を10%にします。25&ndashで急速冷凍することができます。50 &mu;Lアリコート</td></tr><tr><td>タルカムパウダー&nbsp;</td><td>カロライナ</td><td>州896060</td><td></td></tr><tr><td>ワットマングレード1濾紙</td><td>Cytiva</td><td>1001-085</td><td></td></tr></tbody></table>

クライオ電子顕微鏡サンプル調製のためのストレプトアビジン-アフィニティーグリッド作製

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

ストレプトアビジンアフィニティーグリッドは、サンプルの変性や気水界面によって発生する可能性のある優先配向など、クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)で一般的に遭遇する多くのサンプル調製の課題を克服するための戦略を提供します。しかし、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドは、市販されておらず、慎重な製造プロセスを必要とするため、現在、クライオ電子顕微鏡ラボで利用されているものはほとんどありません。2次元ストレプトアビジン結晶は、ビオチン化脂質単分子膜上に成長し、標準的な穴あき炭素クライオ電子顕微鏡グリッドに直接塗布されます。ストレプトアビジンとビオチンの親和性が高い相互作用により、クライオ電子顕微鏡サンプル調製中に空気-水界面から保護されたビオチン化サンプルのその後の結合が可能になります。さらに、これらのグリッドは、限られた量で入手可能なサンプルを濃縮し、目的のタンパク質複合体をグリッド上で直接精製するための戦略を提供します。ここでは、クライオ電子顕微鏡およびネガティブ染色実験で使用するストレプトアビジンアフィニティーグリッドの頑健な作製のために、段階的に最適化されたプロトコルを提供します。さらに、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドの使用をより大きなクライオ電子顕微鏡コミュニティが利用しやすくするための、一般的に経験される課題に関するトラブルシューティングガイドも含まれています。

ステップ 3.21 の炭素蒸発後(通常は 1 週間後)、ステップ 4 および 5 で説明した手順に従って、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドをクライオ電子顕微鏡またはネガティブ染色サンプル調製に使用できます。 図 4A は、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドで凍結したビオチン化サンプルを、拡大率 81,000 倍、ピクセルサイズ 1.05 Å の titan Krios の K3 検出器で撮影した代表的な顕微鏡写真です。格子形成の成功は、画像の背景に現れる連続したグリッドパターンによって観察されます。これは、 図4A (右)に示す高速フーリエ変換(FFT)に現れる回折パターンによってより簡単に観察できます。データ収集後、本プロトコルのステップ6で概説した手順に従って、ストレプトアビジン格子によって画像に寄与するシグナルを計算的にマスクして、後続のデータ処理ステップに用いることができる減算顕微鏡写真(図4B)を生成することができる。 図4B (右)のFFTは、 図4A (右)で観察された回折パターンが元の画像から正常に除去されたことを示しています。
図4C は、ストレプトアビジンアフィニティーグリッドに結合し、ギ酸ウラニルでネガティブ染色したビオチン化サンプルを、ピクセルサイズ1.6 ÅのTecnai 12顕微鏡で倍率49,000倍で撮影した顕微鏡写真の例を示しています。グリッドは、このプロトコルのステップ4で概説された手順に従って準備され、より厚い染色の膜が残りました。
ストレプトアビジングリッド作製手順が失敗した場合の一般的な観察結果がいくつかありますが、これらについては、考察のセクションおよび表1で詳しく説明します 。 図5 は、これらの観察結果の例をいくつか示しています。 図5A は、6ヶ月以上経過したバッチから使用したネガティブ染色のストレプトアビジンアフィニティーグリッドの顕微鏡写真を示しています。単層は、量子箔グリッドの炭素箔の穴から動員され、グリッドの穴と同様の寸法で観察されます。 図5B は、高いモザイク性を有するストレプトアビジン結晶の例を示しており、サンプル調製手順中に容易に摂動されます。 図5C は、ステップ3.21の炭素蒸発が薄すぎるか省略されているストレプトアビジンアフィニティーグリッドの代表的な顕微鏡写真を示しています。ストレプトアビジン格子は、クライオ電子顕微鏡サンプル調製プロセス中に断片化しています。 図5D は、脂質小胞による汚染がある陰性染色のストレプトアビジンアフィニティーグリッドを示していますが、これはおそらく、ステップ3.13で洗浄が不十分であったか、ステップ3.13-3.20でグリッドの金側が濡れたことが原因です。これらの一般的な問題を克服するための戦略については、ディスカッションセクションと 表1 を参照してください。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> 図1:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製手順の概略図。 (A)ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製手順の概要タイムライン。手順全体は2週間で完了でき、2つの炭素蒸発ステップと、炭素が十分に熟成するまでの各ステップの後に1週間が必要です。(B)ストレプトアビジンアフィニティーグリッドのグリッド正方形を拡大し、金の延べ棒と穴の開いた炭素膜を備えた標準的なクライオ電子顕微鏡グリッド、第1蒸発炭素層、脂質単分子層、2D-ストレプトアビジン結晶、裏面蒸着炭素支持層など、製造プロセス完了後にグリッドを構成する層を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> 図2:脂質単分子膜とストレプトアビジンの結晶化(A) タルカムパウダーを利用してヒマシ油の境界を作り、脂質単分子層を形成しながら一定の表面圧を生み出す小さなペトリ皿内で脂質単層をうまく形成する方法を示す画像。(B)ストレプトアビジン結晶をクライオ電子顕微鏡グリッド上に成長させる方法を示す画像。まず、グリッドの炭素側を脂質単層に接触させ、続いて結晶化バッファーで3回連続して洗浄します。ストレプトアビジンを添加し、グリッドを加湿チャンバー内で2時間インキュベートします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> 図3:顕微鏡写真からストレプトアビジン格子減算を行うためのprocess_subtraction.cfgファイルのパラメータ例(ステップ6)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> 図4:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製の成功例。 (A)自家製ストレプトアビジンアフィニティーグリッドで調製したビオチン化タンパク質/ヌクレオソーム複合体のクライオ電子顕微鏡写真。FFTは右に示されており、ストレプトアビジン結晶の回折パターンを示しています。(B)パネルAと同じ顕微鏡写真を、元の画像から2Dストレプトアビジン結晶からのシグナルを除去するための格子減算手順に続いて示している。(C)ストレプトアビジン親和性グリッドに結合したビオチン化サンプルのネガティブ染色から得られた顕微鏡写真の例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> 図5:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製に失敗した代表的な結果。 (A)グリッドが6ヶ月以上経過している場合のグリッドホールからのストレプトアビジン単分子膜の動員を示す顕微鏡写真。(B)クライオ電子顕微鏡とネガティブ染色の両方のサンプル調製手順で損傷しやすい高いモザイク性を持つストレプトアビジン格子を示す顕微鏡写真。(C)ステップ3.21の炭素蒸着層が薄すぎるか省略されている場合のクライオ電子顕微鏡試料調製中のストレプトアビジン格子のフラグメンテーションを示す顕微鏡写真。(D)ステップ3.13の洗浄が不十分であるか、ステップ3.13-3.20でグリッドの金面が濡れたことが原因である可能性が高い脂質小胞で汚染された代表的な顕微鏡写真。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
表1:ストレプトアビジンアフィニティーグリッド作製に失敗した際に遭遇する一般的な課題を克服するためのトラブルシューティングガイド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル1:lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル2:process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル3:process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル4:bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル5:bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル6:bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル7:bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル8:ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル9:WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル10:WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ストレプトアビジンアフィニティーグリッドを作製するためのステップバイステップのプロトコルは、クライオ電子顕微鏡法による困難な高分子サンプルの構造研究で使用するために提供されています。

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

クライオ電子顕微鏡には、画像の全体的な品質を向上させる顕微鏡ハードウェア自体の進歩や、クライオ電子顕微鏡画像を処理するために使用されるソフトウェアの開発など、近年多くの技術的進歩があり、多くのサンプルに存在する大量の不均一性に対処できるようになりました。サンプル調製は、クライオ電子顕微鏡における最大のボトルネックの1つです。サンプル量は限られている可能性があり、タンパク質はガラス固化中に疎水性の空気と水の界面に吸収される傾向があります。これにより、サンプルの変性、より大きなタンパク質複合体の分解、およびクライオ電子顕微鏡画像に存在する好ましい粒子配向につながる可能性があります。これらのグリッドは、ストレプトアビジンとビオチンの親和性の高い相互作用を利用して、ビオチン化サンプルをつなぎ合わせ、疎水性の気水界面から保護します。非常に少ないサンプル量で作業でき、サンプルのランダムなビオチン高揚感は、他の担体層を使用する場合に観察される可能性のある優先配向の問題を克服するための戦略を提供します。

streptavidin-affinity-grid-fabrication-for-cryo-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual...

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

ここでは、クライオ軟X線断層撮影法(SXT)で凍結保存細胞全体の超構造を25nmハーフピッチの分解能で画像化するために必要なサンプル調製およびデータ収集ステップを説明するプロトコルを提示する。...

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

ここで提示されるプロトコルは、液体クライオゲンのガラス化の前に最低90ミリ秒混合する自己ウィッキング、ナノワイヤーグリッドに関心のある2つのサンプルを提供するために、新しいロボットシステムであるSpotitonを使用することを説明しています。...

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

この論文は、クライオEM実験のために急落凍結する前に、70°Cという高い温度でサンプルグリッドを準備するための詳細なプロトコルを提供します。...

クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

ここでは、クライオ電子線トモグラフィー用の細胞サンプルの調製をガイドするための3D相関集束イオンビームミリングのパイプラインを紹介します。目的の蛍光タグ付きタンパク質の3D位置は、まずクライオ蛍光顕微鏡で決定され、次にミリングの標的となります。このプロトコルは、哺乳類、酵母、および細菌細胞に適しています。...

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

ピールブロット法は、多層および濃縮された生物学的サンプルを単層に分離して、厚さを減らし、サンプル濃度を高め、画像処理を容易にするクライオEMグリッド調製法です。...

ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法

哺乳類細胞の in situ クライオトモグラフィーのためのサンプル調製

ここでは、単分子膜のグラフェンを電子顕微鏡グリッドに塗布するためのプロトコールと、クライオ電子顕微鏡の構造決定に使用するための調製方法について説明します。...

クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製

このプロトコールは、 Methanocaldococcus jannaschii...

極低温電子顕微鏡のためのサンプル調製の最適化

学ぶストレプトアビジン-アフィニティーグリッド作製法。クライオ電子顕微鏡サンプル調製におけるタンパク質変性と配向バイアスを低減し、構造生物学研究の品質向上に貢献する革新的なプロトコルです。

クライオ電子顕微鏡サンプル調製のためのストレプトアビジン-アフィニティーグリッド作製

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