Name: 脳オルガノイドにおけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトームの生成とダウンストリーム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学ぶ脳オルガノイドのシングルセルおよびシングル核RNAシーケンス解析手法。iPS細胞由来のヒト脳オルガノイドを用いて、疾患モデリングのための分子メカニズムを解明する高度なトランスクリプトーム解析技術を習得できます。

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Miltenyi Neural Dissociationキットの元の指示を提供してくれたValeria Fernandez-Valloneに感謝します。また、NP40溶解バッファーのレシピと、このプロトコルの設定に関する貴重なアドバイスを提供してくださったMax Delbrueck CentrumのGenomics Technology Platformにも感謝します。また、研究室の組織的なサポートを提供してくださったMargareta Herzog氏とAlexandra Tschernycheff氏にも感謝します。

記載されているプロトコルは、マックス・デルブリュック分子医学センター(承認番号:138/08)のバイオセーフティレベル1の研究室で、研究における倫理に関するEUおよび国内の規則および要件に従って実施されます。
1. 人工多能性幹細胞(iPSC)からの前脳オルガノイドの作製
注:このプロトコルは、さまざまな企業のさまざまな幹細胞培地で培養したいくつかの異なるiPSC株について試験しました(表1)。前脳オルガノイドの作製は、高品質のiPS細胞に大きく依存し、プロトコール開始前に60%〜70%のコンフルエンスが必要です。ここでは、市販の細胞株を使用しました( 材料の表を参照)。
<ol><li>0日目:胚様体形成<ol><li>96ウェルプレートをプルロン酸溶液で処理するには、96ウェルU底プレートのウェルあたり80 μLの滅菌ろ過済み2%プルロン酸溶液を添加します。室温(RT)または37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。 注:プルロニック処理プレートは、4°Cで最大2週間保存でき、胚様体形成のための洗浄手順なしで直接使用できます。</li>
		<li>細胞を播種する前に、アスピレーターまたはマルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから多元的溶液を取り出します。</li>
		<li>開始する前に、1つの96ウェルプレート用に次の試薬を準備します:15 mL遠心チューブと5 mLの予熱済みDMEM:F12培地。11 mLの幹細胞培地に50 μM Y-27632を添加した多元処理プレート(上記の通り)。</li>
		<li>60-70%コンフルエントiPS細胞の6ウェルプレートの1ウェルから培地を吸引します。PBSで細胞を一度洗浄します。トリプシンベースの試薬500 μLを添加し、37 °Cで2〜6分間インキュベートします。 注:トリプシンベースの試薬で細胞を適切に剥離するためのインキュベーション時間は、細胞密度と各iPS細胞株の細胞マトリックス接着特性によって異なります。過剰消化を避けるために、トリプシンベースの試薬と2分間インキュベートした後、明視野顕微鏡を使用して細胞の形態を調べることをお勧めします。</li>
		<li>1000 μLピペットを使用して細胞を分離し、DMEM:F12培地を使用して事前に調製した15 mL遠心チューブに移して解離を停止します。</li>
		<li>細胞懸濁液を300 x gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを保持します。50 μM Y-27632を添加した幹細胞培地1 mLに細胞を再懸濁します。</li>
		<li>セルカウンターを使用して細胞をカウントし、50 μM Y-27632を添加した幹細胞培地に希望数の細胞を加えます。単一の胚様体の生成には、細胞株にもよりますが、3,000〜12,000個の細胞が必要です。</li>
		<li>10 mLピペットを使用して、細胞懸濁液をマルチチャンネル試薬リザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液の100 μL/ウェルを、以前にプルロン処理した96ウェルプレートにプレートします。</li>
		<li>96ウェルプレートをインキュベーターに37°C、5%O2 および5%CO2で置きます。胚様体形成時の乱れを避けるため、プレートの移動はお控えください。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目:胚様体形成検査<ol><li>胚様体形成を、明視野顕微鏡の10倍対物レンズを用いて調べます。胚様体は、明確なエッジと最小限の細胞死を示す必要があります。</li>
		<li>できるだけ多くの培地を吸引し、100 μL/ウェルの幹細胞培地と交換します。(クリティカル)胚様体は、培地交換中にウェルから簡単に取り出されます。それらを取り除かないように注意して、吸引後に培地を監視してください。</li>
	</ol></li>
	<li>3日目:神経外胚葉導入<ol><li>できるだけ多くの培地を吸引し、120μL/ウェルの誘導培地と交換し、プレートを37°C、20%O2 、5%CO2に置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>6日目:埋め込み<ol><li>iPS細胞株にもよりますが、神経外胚葉の創発を誘発するのに3〜4日かかります。胚様体を定期的に監視します。エッジが明るくなると、胚様体を埋め込む準備が整います。以下に説明するように、胚様体の埋め込みに使用できる2つの異なる方法のいずれかを使用する24。</li>
		<li>埋め込み方法1:Cookieの埋め込み<ol><li>希釈されていない細胞外マトリックスゲルのアリコートを氷上で1〜2時間解凍します(重要)固まらないように、常に細胞外マトリックスゲルを氷上に保管してください。解凍時間と繰り返しの解凍サイクルを最小限に抑えるために、事前にアリコートを準備してください。</li>
			<li>クローニッパーを使用して200 μLピペットの先端を切断し、1.5 mLの微量遠心チューブ1本に16〜32個の胚様体を採取します。</li>
			<li>培地67 μL中の胚様体を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。カットした200 μLのピペットチップを使用して100 μLの細胞外マトリックスゲルを加え、穏やかに混合します。</li>
			<li>胚様体を6cmの皿に均等に分散させ、プレートを5〜10分間置いて細胞外マトリックスゲルを固化させます。</li>
			<li>約4 mLの分化培地を加え、37°C、20%O2 および5%CO2でインキュベートします。翌日、皿をオービタルシェーカー(84 rpm)に置きます。すべての胚様体が底部から分離していることを確認します。そうでない場合は、カットしたピペットチップとメディアを使用して、そっと取り外します。</li>
		</ol></li>
		<li>埋め込み方法2:液体の埋め込み<ol><li>希釈されていない細胞外マトリックスゲルのアリコートを氷上で1〜2時間解凍し、分化培地を氷上に置きます。(クリティカル)細胞外マトリックスゲルを添加する際、培地は氷のように冷たくなければなりません。</li>
			<li>培地が冷えたら、細胞外マトリックスゲルを最終濃度の2%まで加えます。クローニッパーを使用して200 μLピペットの先端を切断し、最大24個の胚様体を6ウェルプレートの1ウェルに移します。</li>
			<li>余分な培地をすべて取り除き、約4 mLの2%細胞外マトリックスゲル/分化培地を6ウェルプレートの1ウェルに加えます。すぐにプレートをオービタルシェーカー(84 rpm)に置きます。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>9-20日目:3-4日ごとに分化メディアを使用して完全なメディア交換を行います。</li>
	<li>21-30日目:オルガノイドを成熟培地に移し、3-4日ごとに完全な培地交換を行います。</li>
	<li>オルガノイドの解離:単一核および細胞の解離には、高品質のオルガノイドを使用してください。過剰な細胞死を避けるために、オルガノイドを定期的に切断して壊死性コアの蓄積を防ぎ、オルガノイドを2週間回復させてから、さらなる分析のためにオルガノイドを解離させます。</li>
</ol>2. オルガノイドからのシングルセルの誘導
注:シングルセル解離は、機械的および酵素的解離を使用するNeural Tissue Dissociation Kit(表2)を使用して行われます。ここでは、手動の機械的解離について説明します。別の方法として、解離機を使用することができます。
<ol><li>氷上にSTOP溶液と0.04%BSAを調製します。酵素ミックス1と2、および0.04%BSAをPBSで調製し、氷上に置きます。</li>
	<li>6ウェルプレートの1ウェルに最大5つのオルガノイドを採取し、余分な培地を吸引し、PBSで1回洗浄して培地を除去します。オルガノイドをウェルの中央に置き、メスを使用して、オルガノイドを徹底的にミンチします。</li>
	<li>酵素ミックス1を加え、37°C、20%O2 、5%CO2で、90rpmで10〜15分間振とうします。</li>
	<li>1000 μLのピペットチップを使用して、最大10回ピペッティングしてオルガノイドを再懸濁します。酵素ミックス2を加え、1000μLのピペットチップを使用してピペッティングしてよく混合します。37°C、20%O2 、5%CO2に置き、90rpmで10〜15分間振とうします。</li>
	<li>細胞溶液を10mLの冷たいSTOP溶液に再懸濁することにより、解離プロセスを停止します。70 μMセルストレーナーを使用したセル溶液のろ過。ろ過した細胞溶液を300 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、ペレットを形成します。</li>
	<li>培地を吸引し、細胞ペレットを残し、細胞を4 mLの冷たくした0.04% BSAに再懸濁します。40 μMセルストレーナーを使用して細胞溶液をろ過し、セルカウンターを使用して細胞をカウントします。</li>
	<li>細胞溶液を300 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 BSA溶液を吸引し、細胞ペレットを残します。マイクロ流体ベースのsnRNA-seqキットマニュアルに従って、NSB+培地で細胞を再懸濁します。</li>
</ol>3. オルガノイドからの単一核の単離
<ol><li>オルガノイドを冷やしたPBSに移し、各オルガノイドを4つに切断します。オルガノイドを冷やしたPBSで2回洗浄します。</li>
	<li>1000 μLピペットのピペット先端をハサミで切断し、オルガノイド片を2 mLのダウンサーに移します。PBSを完全に吸引し、NP40溶解バッファー1 mLを添加します。</li>
	<li>オンス乳棒Aで3倍、ドンス乳棒Bで3倍、懸濁液を15mLの遠心分離チューブに移します。ダウンサーを1 mLのNP40溶解バッファーで洗浄し、15 mLの遠心チューブに移します。室温で5分間インキュベートし、続いて懸濁液を500 x gで5分間遠心分離します 。</li>
	<li>上清を吸引し、50μLの上清を残します。ペレットを乱さずにNSB+1 mLを加えます。インキュベーション5分後に再懸濁します。</li>
	<li>Percollグラジエントの上に層懸濁液を上に置く(下層:NSB +1 mLとPercoll 250 μL、中層:NSB+1 mLとPercoll 188 μL、最上層:NSB+1 mLとPercoll 125 μL)。(クリティカル)レイヤーの混合を避けるために、非常に慎重にレイヤー化を行ってください。</li>
	<li>500 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引し、NSB+に再懸濁します。40 μMセルストレーナーを使用して核溶液をろ過します。</li>
	<li>DAPIとノイバウアーチャンバーを使用して核を染色し、カウントします。マイクロ流体工学に基づくscRNA-seqキットのマニュアルに従って核を再懸濁します。</li>
</ol>4. ライブラリの調製とシーケンシング
<ol><li>10,000個の細胞と核をマイクロ流体システムにロードし、マイクロ流体ベースのscRNA-seqキットのマニュアルに従ってライブラリを生成します(Table of Materials)。</li>
	<li>snRNA-seqライブラリあたり推定6 x 108 リード、scRNA-seqライブラリあたり1.6 x 108 リードでライブラリをシーケンシングすると、snRNA-seqデータセットのシーケンシング飽和度は87%、scRNA-seqデータセットのシーケンシング飽和度は36%になります。</li>
</ol>5. 分析
<ol><li>scRNA-seqおよびsnRNA-seqのデータ解析パイプラインを用いてシーケンシングの解析を行い、ヒトGRCh38ゲノムに照らし合わせる。このパイプラインによって生成されたカウント行列を、RパッケージSeurat(バージョン4.1.1)25を使用してさらに分析します。</li>
	<li>少なくとも 5 つの細胞で表される遺伝子を考慮し、少なくとも 300 個の遺伝子を含む細胞を組み込んで、Seurat オブジェクトを作成します。scRNA-seqデータセットでは1000個以上4000個未満の遺伝子を含む細胞を保持し、snRNA-seqデータセットでは核あたり800個以上4000個未満の遺伝子を含む細胞を保持することにより、追加の品質管理フィルタリングを実行します。データセット、細胞、および核のミトコンドリアリードが 5% を超えるものを除外します。</li>
	<li>両方の方法間のバッチ効果を軽減するには、フィルタリングされた両方のデータセットを統合し、UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)を使用して正規化および視覚化します。低 Unique Molecular Identifier (UMI) と遺伝子数を示すクラスター 1 を省略します。その後、クラスターについて、既知のマーカー遺伝子とAna Uzquianoらの30日前のオルガノイドデータセットに基づいて細胞のアイデンティティを割り当てます。al. (Supplementary Coding File 1)18.</li>
</ol>

ヒト脳オルガノイドからのシングルセルおよび核抽出

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著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

単一細胞および単一核のトランスクリプトーム解析は、複雑な組織内の遺伝子調節メカニズムを理解するための極めて重要なツールとして浮上しています。どちらの方法も、脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究を可能にします。実験を全体的に成功させるためには、出発物質の品質が重要性が高いことが大切です。したがって、壊死性コアの形成を防ぐために、オルガノイドを定期的に切断する必要がある26。この問題は、気液界面培養27によっても解消すること可能である。オルガノイドの不均一性によるバッチ効果を低減するために、抽出ごとに少なくとも4つのオルガノイドを使用することをお勧めします。あるいは、個々のオルガノイドの複数のシーケンシングランを実施することが可能であり、これにより、同じバッチ17内の変動性をさらに調べることができる。scRNA-seqとsnRNA-seqの両手法を並行して使用する場合、オルガノイドを2つに切断し、それぞれの方法で分割することで、オルガノイドの不均一性による差をさらに減らすことができます。
個々の細胞または核の高品質なトランスクリプトームプロファイルを得るためには、全処置中、細胞膜または核膜が無傷のままであることが重要です。したがって、酵素濃度と酵素消化のタイミングの両方を最適化することが重要であり、オルガノイドの年齢とサイズに合わせて調整する必要があります。さらに、正しい温度と遠心分離速度を使用し、過酷なピペッティングを避けることが不可欠です。生存率が低い場合は、オルガノイドを単一細胞に解離した後、死細胞除去キットを使用することができます。補完的に、核の単離のためには、オルガノイドをPBSで慎重に洗浄し、ダウンサーによるストローク数をオルガノイドサイズに適合させることが重要です。また、レイヤーの乱れを避けるために、Percollグラデーションを慎重にレイヤー化することも重要です。単離後に損傷した核が残る場合は、蛍光活性化細胞ソーティング22によるソーティングステップを実施することが推奨される。全体として、RNAse阻害剤の使用は、各細胞または核の高品質RNAを保存するために、サンプルの解離からライブラリ生成までのすべてのステップに不可欠です。
この研究では、scRNA-seqはより多くの細胞を産出し、細胞集団のより広範な概要を得ることができました。さらに、細胞はより多くのRNAを含んでおり、核と比較して表面マーカーを介して特定の細胞タイプに濃縮するのが容易です。しかし、シングルセル解離は、ストレス関連RNAの転写を誘導することができる酵素プロセスに依存している19,28。特にストレス反応の増加に関連する疾患では、これは解離誘発性アーティファクト20をもたらす可能性があります。さらに、単一細胞の単離は、感受性細胞集団の喪失をもたらすことが示されました3,29。この研究では明らかではないかもしれませんが、細胞の多様性が高いことを特徴とする古い脳オルガノイドを使用した場合、結果として考えられるものです。
どちらのデータセットも同じ細胞集団を取得するため、単離方法の選択は、研究課題、組織取得、時間管理に大きく依存します。解離後、脳オルガノイドからの単一細胞のメタノール中での固定と保存は十分に確立されているが30、凍結した脳オルガノイドからの単一核の単離には、まだ最適化が必要である。
全体として、当社のプロトコルは、脳オルガノイドの個々の細胞および核のトランスクリプトームプロファイルを調査するための多用途で適応性の高いプラットフォームを提供し、in vitroヒト脳モデルにおける発生および疾患関連の問題の詳細な調査への道を開きます。

ここ数年で、オルガノイド技術は臓器様組織を培養するための有望なツールとして浮上してきました1,2,3。特に、人間の脳など、簡単にアクセスできない臓器の場合、オルガノイドは発生や疾患の発現に関する洞察を得る機会を提供します4。このように、脳オルガノイドは、発達疾患、精神疾患、さらには神経変性疾患など、さまざまなヒトの脳障害を調査するための実験モデルとして広く使用されてきました4,5,6。
シングルセルトランスクリプトームプロファイリング技術の出現により、初代ヒト組織や複雑なin vitroモデルを前例のない粒度で研究できるようになり、健康や疾患における細胞亜集団レベルでの遺伝子発現変化に関するメカニズム的な洞察が得られ、新たな推定治療標的に関する情報を得ることができるようになった7,8,9.オルガノイド分野は、脳オルガノイド技術10,11,12の細胞組成、再現性、および忠実度を評価するために、シングルセルトランスクリプトームプロファイリングを利用することによって進歩してきた。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)により、疾患オルガノイドの細胞分類と遺伝的調節不全の同定が可能になりました13,14。重要なことは、オルガノイド組織の複雑さが、個々の細胞のプロファイリングを可能にする技術の実装を必要とすることです。バルクトランスクリプトームプロファイリング(バルクRNAシーケンシング)などの方法を用いたオルガノイドの特性評価は、複雑な組織内のすべてのタイプの細胞で平均化されるマスクされた細胞の不均一性および遺伝子発現プロファイルをもたらし、最終的に健康および疾患におけるオルガノイド開発中の進行中のプロセスの理解を制限する15,16,17.scRNA-seq法が進歩し続けるにつれて、Allen Brain AtlasやUzquianoらによるヒト脳オルガノイドのシングルセルアトラスなどのリソースに代表されるように、ますます多くのアトラスが作成されています18。
脳オルガノイドからのscRNA-seqを成功させるには、無傷の細胞の効果的な単離と捕捉が必要です。個々の細胞を得るための脳オルガノイドの解離は酵素消化に基づいているため、ストレスや細胞損傷を誘発することにより遺伝子発現パターンに影響を与えることができる19,20。したがって、組織を個々の細胞に解離させることが最も重要なステップです。別のアプローチは、単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)であり、これは新鮮組織と凍結組織の両方から核を酵素なしで抽出することを容易にする21,22。しかし、組織からの核の単離には、目的の細胞の種類の濃縮や、細胞と比較して核のRNA含有量が低いなど、他の課題があります。
脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究は、一般的にscRNA-seq 10,18,23を用いて行われます。しかし、単一核の単離は、オルガノイドのトランスクリプトームプロファイルを調査するための直交的かつ補足的な方法を提供する可能性があります。ここでは、脳オルガノイド用のscRNA-seqおよびsnRNA-seqのツールボックスを紹介し、最高品質のシーケンシングデータを取得するための重要なポイントについて説明します。

<table><tbody><tr><td>1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;43816-10ML</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml DNA低結合チューブ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td>微量遠心分離管</td></tr><tr><td>10x セルレンジャー パイプライン&nbsp;</td><td></td><td></td><td>分析パイプライン</td></tr><tr><td>15 ml Falcon</td><td>Falcon</td><td></td><td>遠心分離管</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (BME)</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Falcon Falcon</td><td></td><td>遠心分離管</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Bio Technologies</td><td>379762</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌剤溶液 (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ビタミンAを含まないB-27サプリメント</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、脂肪酸フリー(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8806-5G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Biogems</td><td>6099240</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Biogems</td><td>6099240</td><td></td></tr><tr><td>C-CHIP NEUBAUER IMPROVED</td><td>VWR</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 40 & micro;m</td><td>Neolab</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 70 & マイクロ;m(ホワイト) ナイロン</td><td>Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>クロムコントローラー &Next GEM Accessory Kit</td><td>10X Genomics</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>1000268</td><td></td></tr><tr><td>Complete &nbsp;EDTAフリープロテアーゼ阻害剤</td>カクテル <td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MERCK Chemicals</td><td>0000001722</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>Dounce ティッシュグラインダーセット 2 mL コンプリート</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>10536355</td><td></td></tr><tr><td>エッセンシャル E8 Flex Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>EVE Cell Countingスライド</td><td>VWR</td><td>EVS-050 ( 734-2676)</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清テトラサイクリンフリー (FBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3602</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free (コーティング)</td><td>Life Technologies</td><td>A1413302&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>解離maschine</td></tr><tr><td>GlutaMAXサプリメントライフ</td><td>テクノロジー</td><td>ズ35050038</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム細胞培養テスト済み</td><td>シグマ</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換えBDNF</td><td>ステムセルテクノロジー78005.3</td><td></td><td></td></tr>ヒト<tr><td>組換えGDNF</td><td>ステムセルテクノロジー78058.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン液 ヒト</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2643-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189 塩酸塩 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-106-540</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145-100ml</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 塩化マグネシウム (1M) RNAse フリー</td><td>サーモScientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td>幹細胞培地</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>幹細胞培地</td></tr><tr><td>N2 サプリメント&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Plus</td><td>Life Technologies</td><td>A3582901</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq500 system</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>Life Technologies</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>PBSダルベッコs</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (ペニシリン - ストレプトマイシン)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Th. Geyer</td><td>10668276</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic (R) F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443-1KG</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>岩石抑制剤(Y-27632二塩酸塩) SB</td><td>Biomol</td><td>Cay10005583-10</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542&nbsp;</td><td>Biogems</td><td>3014193</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム NaCl (5M), RNase-free-100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>A3349401</td><td>幹細胞培地</td></tr><tr><td>StemMACS iPS-Brew XF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-368</td><td>幹細胞培地</td></tr><tr><td>TC-Platte 96 まあ、丸底</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.500</td><td></td></tr><tr><td>TISSUi006-A</td><td>TissUse GmbH</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>T8154-20ml</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme, no phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>12604013</td><td>Trypsin-based reagent</td></tr><tr><td>UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5</td><td>Life Technologies</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Enzo Life sciences.</td><td>BML-WN100-0005</td><td></td></tr></tbody></table>

脳オルガノイドにおけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトームの生成とダウンストリーム解析

Generation and Downstream Analysis of Single-Cell and Single-Nuclei Transcriptomes in Brain Organoids

過去10年間で、シングルセルトランスクリプトミクスは大幅に進化し、個々の細胞の遺伝子発現プロファイルを同時に解析するための標準的な実験室法となり、細胞の多様性を捉えることが可能になりました。単離が困難な細胞タイプによる制限を克服するために、無傷の細胞ではなく単一の核を回収することを目的とした別のアプローチをシーケンシングに利用することができ、個々の細胞のトランスクリプトームプロファイリングを普遍的に適用できます。これらの技術は、脳オルガノイドの研究の基礎となり、発達中のヒト脳のモデルとして確立されています。脳オルガノイド研究におけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトミクスの可能性を活用するこのプロトコルは、オルガノイドの解離、シングルセルまたは核の単離、ライブラリ調製、シーケンシングなどの主要な手順を網羅したステップバイステップのガイドを提供します。これらの代替アプローチを実装することで、研究者は高品質のデータセットを取得でき、ニューロン細胞と非ニューロン細胞のタイプ、遺伝子発現プロファイル、および細胞系統の軌跡を同定できます。これにより、脳の発達を形作る細胞プロセスと分子メカニズムの包括的な研究が容易になります。

scRNA-seqおよびsnRNA-seqを用いて脳オルガノイドの細胞型組成を調べるために、この段階では、中間前駆細胞と初期ニューロンに囲まれた前駆細胞からなる神経上皮ループをすでに示していたため、30日間の培養後に脳オルガノイドを回収した4,18。成長と培養全体を通じてオルガノイドの品質を監視することは、信頼性の高い単一細胞および単一核のデータを得るために不可欠です。
オルガノイドは、iPS細胞が胚様体に凝集することによって形成されます(図1B、C)。組み立て時には、これらの胚様体は、細胞の破片が最小限に抑えられた明確なエッジを示すことが期待されます(図1C)。神経外胚葉の誘導後、胚様体は表面の周囲が比較的暗くなり、観察可能な明るさを示し、神経誘導が成功したことを示しています(図1D)。その後の数週間で、オルガノイドは、主に神経上皮細胞で構成される、いわゆるループ、ニューロンのロゼット様構造を発達させます(図1E、F)。これらのオルガノイドは数ヶ月間培養に維持することができますが、サイズが大きくなると、栄養素と酸素の利用可能性が不足しているため、オルガノイドの内部で細胞死がそれに応じて増加し、最終的には壊死性コアが発達することに注意する必要があります。
シーケンシング解析を通じて皮質オルガノイド内の細胞の多様性を探るために、オルガノイドから単一細胞と核の両方を単離しました。脳オルガノイドの単一バッチに内在する不均一性のバランスをとるために、1つのバッチから4つのプールオルガノイドのシーケンシングを行いました。さらに、単離プロセス間の比較目的と、snRNA-seqとscRNA-seqライブラリー間のバッチ効果を除去するために、これらのオルガノイドを半分(合計8つ; 図 2)。個々の細胞を酵素的に単離した後、細胞が丸い形態を維持していることを観察しながら、細胞生存率が80%以上に保たれるようにすることが重要です(図3A、B)。同様に、個々の核を機械的に単離すると、検出可能な破片が最小限またはまったくない、さまざまなサイズの無傷の核が得られるはずです(図3C、D)。
シーケンシング解析の結果、核よりも多くの細胞が捕捉され、シーケンシングされていることが明らかになりました。どちらのデータセットも、細胞および核あたりの遺伝子数とUMI数が多く、ミトコンドリアの読み取り率が低いことから評価された品質が良好であることを示しました(図4A-C)。予想通り、scRNA-seqデータセットで回収された総リードに占めるミトコンドリアリードとリボソームリードの割合は、snRNA-seqデータセットと比較して高くなっています。scRNA-seqデータセットでは、ほとんどの細胞が30%未満のリボソームリードを含んでいましたが、snRNA-seqデータセットでは、大部分の核が5%未満のリボソームリードを含んでいました。さらに、scRNA-seqデータセット内に捕捉された細胞の大部分は、ミトコンドリアリードが5%未満です。ミトコンドリアのリードをろ過した後、約10,000個の細胞と3,000個の核が品質しきい値を超えました。
両方のデータセットの統合解析により、すべてのクラスターが両方のデータセットで表されていることが明らかになり、両方の方法で同じ細胞タイプが回復することを示しています(図5A、C)。データセットの注釈は、主要な細胞集団が放射状グリア、中間前駆細胞、皮質下前駆細胞、ニューロン、新生児深層投影ニューロン、およびCajal-Retzius、皮質裾、脈絡叢細胞などのあまり代表されていない細胞タイプで構成されることを示しています(図5B)。全体として、scRNA-seqとsnRNA-seqは、30日齢の脳オルガノイドに存在すると予想されるすべての細胞タイプを回収することができました20。
<img alt="胚様体の形成から成熟までのタイムライン。顕微鏡画像;細胞分化段階。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66225/66225fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:iPS細胞からの脳オルガノイドの生成。 脳オルガノイド生成の経時変化(A)。iPS細胞からの皮質分化の成功例(B)は、胚様体を形成し(播種後72時間)(C)、培養7日後に成功した神経誘導(D)を示す。オルガノイドは、15日目(E)と30日目(F)に明確なループを描いています。スケールバー:B-D 200 μm、E 400 μm、F 800 μm。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/66225fig01large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="単一細胞および核のRNA配列決定図。酵素解離,Percoll勾配法" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66225/66225fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:脳オルガノイドから単一細胞と単一核を取得するためのワークフロー。 オルガノイドの単一細胞への解離は、オルガノイドをメスでミンチし、その後酵素消化を行うことによって行われます(上)。核の単離は、機械的解離によって行われ、続いてPercoll勾配(下)による精製が行われます。シングルセルと核懸濁液をろ過し、マイクロ流体システムにロードして、ライブラリの生成とシーケンシングを行います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/66225fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="さまざまな細胞密度と染色パターンを示す細胞顕微鏡画像。方法には染色が含まれます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66225/66225fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:30日齢のオルガノイドから単離された細胞および核の代表的な結果(A)セルカウンターを用いて撮影されたトリパンブルー染色細胞の例示的な写真および(B)対応するクローズアップ。(C)DAPI染色核の明視野と蛍光写真の重ね合わせ、(D)対応するクローズアップ。スケールバー:100μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/66225fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="アイデンティティによるデータの変動性を示すバイオリンプロット。統計分析結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66225/66225fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:scRNA-およびsnRNA-seqの品質管理。 バイオリンプロットは、細胞(青)と核(ピンクパープル)の絶対UMI数(A)、遺伝子数(B)、ミトコンドリア(C)、およびリボソームリード(D)を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/66225fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="scRNAseqとsnRNAseqクラスタを示すUMAP図、神経細胞における遺伝子発現解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66225/66225fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5:scRNA-seqとsnRNA-seqは、30日経過したオルガノイドで類似の細胞集団を回収します。 30日経過したオルガノイドの統合埋め込みUMAPで、scRNA-seqの結果(青)とsnRNA-seqの結果(ピンクパープル)(A)、scRNA-seqとsnRNA-seqの統合および注釈付きおよび個々のプロファイル(B、C)を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/66225fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:細胞培養培地およびコーティング成分 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/Table%201_RE.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:scRNAおよびsnRNA-seq用の解離バッファー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/Table%202_RE..zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル1: scRNA-seqおよびsnRNA-seqのデータを解析するためのコーディングファイルです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66225/Code_file.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングを使用したヒト脳オルガノイドの生成およびダウンストリーム解析のための包括的なプロトコールを紹介します。

Over the past decade, single-cell transcriptomics has significantly evolved and become a standard laboratory method for simultaneous analysis of gene ...

私たちは、オルガノイドモデルを疾患モデリングに応用するために、オルガノイドモデルの開発と最適化を行っています。私たちの目標は、疾患の発症と進行の根底にある分子メカニズムを理解することであり、RNAが健康と疾患における遺伝子発現をどのように制御するかを理解するために、シングルセルおよび空間技術を開発および適用しているNikolaus Rajewsky研究室と緊密に協力して取り組んでいます。近年、脳オルガノイドは、患者特有の疾患を研究するための実験的およびトランスレーショナルプラットフォームとして登場しています。したがって、最近の開発が脳オルガノイドモデルの複雑さを改善することを目的としていることは驚くことではありません。例えば、脳領域特異的なオルガノイドを作製したり、脳オルガノイドをマルチオルガノイドアセンブリに利用したりすることもできるようになりました。また、脳オルガノイドに血管新生細胞や免疫細胞を導入するための様々な方法が実施されています。現在、この研究室で使用している最も研究が進んでいる技術の1つは、無傷の組織内の遺伝子発現の評価を可能にする空間トランスクリプトミクスです。これは、1つの組織内の異なる領域で、異なる細胞タイプの遺伝子発現プロファイルがどのように異なるかを理解する上で非常に重要です。また、最近ではシングルセルマルチオミクスが進歩しており、これにより単一細胞の複数のモジュールの解析が可能になり、これらの細胞の解析においてより包括的なアプローチが可能になりました。私たちは、脳オルガノイド、シングルセルおよび空間トランスクリプトミクス法を用いて、リー症候群や単純ヘルペス脳炎などのヒト疾患の根本的なメカニズムを理解しています。さらに、Open-STと呼ばれる高解像度で費用対効果の高い空間トランスクリプトミクス法を開発しました。私たちは、脳オルガノイド組織における細胞タイプの回収に関して、単一細胞と単一核のRNAシーケンシング法を比較および最適化しました。

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Research

JoVE Journal

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