Name: マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶマウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡法。蛍光標識鉄酸化物ナノ粒子の脳腫瘍への薬物送達メカニズムをリアルタイムで可視化し、血脳関門を越えた治療戦略の最適化に貢献します。

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このプロジェクトに機器とインフラを提供してくださったStanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service、Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging(SCi3)小動物イメージングセンター、NIH S10 Shared Instrumentation Grant(S10RR026917-01、PI Michael Moseley, Ph.D.)、およびポータードライブのStanford Preclinical Imaging Facilityに感謝します。この研究は、国立成育医療研究所(助成金番号R01HD103638)の助成金によって支援されました。スタンフォード大学のシュニッツァー・グループに感謝します。サンタクルス大学のZuoラボ。ボストン大学ボストンフォトニックセンターの神経血管イメージング研究所では、2光子イメージングと頭蓋窓モデルに関する教育的議論を行いました。

2P-IVMを用いた脳腫瘍内ナノ粒子のマウスリアルタイム追跡

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

頭蓋窓を通る2P-IVMを使用して、蛍光標識酸化鉄NPの腫瘍送達を評価するためのリアルタイムin vivoNP 追跡方法を紹介します。この手術の手術技術には、安定した手と高度な実験的手術技術が必要です。生きた動物の体験に進む前に、死骸やファントムを使って練習することをお勧めします。代替案として、Hoeferlinらは、熱損傷を減らし、手術技術のばらつきを最小限に抑え、手術を標準化するためにロボットドリルを実装しました22。
ウィンドウのサイズは、別の重要なパラメーターを表します。ウィンドウが大きければ大きいほど、2P-IVMで腫瘍のより大きな部分を画像化できる。文献では、3〜7 mmのサイズが記載されている23。しかし、大きな窓は脳の湾曲に対応できず、局所圧の上昇につながる可能性があります24。この制約を克服するために、いわゆる「ガラスの頭蓋骨」を代わりに使用することができます25。従来のガラス窓と比較して、この方法は曲面ガラスを使用して脳の湾曲に対応し、皮質への焦点圧を軽減しながらより大きな窓の作成を可能にします。このタイプの曲面ガラスは市販されておらず、曲面が反射アーチファクトを引き起こし、画像化できる窓の領域が制限されるため、2P-IVMでの用途は限られています。別の代替は、シリコンベースのウィンドウ24である。一方では、この方法では、作成するウィンドウのサイズと形式に関して柔軟性が高まります。さらに、窓の故障と炎症率の点で、従来のガラス窓に匹敵する結果が報告されています。一方、ポリマーベースの窓の2光子イメージング品質は、ガラス窓よりも速く低下することが示されており、長期的なアプリケーションには適していません26。薄くなった頭蓋骨の頭蓋窓は、別の選択肢を表しています。従来のガラス窓よりも侵襲性が低い一方で、ここで説明したのと同じ技術を使用したGBM細胞移植はできません。さらに、一貫した頭蓋骨の厚さを達成することは困難であり、その結果、これは2P−IVM27において重大なアーチファクトを引き起こす可能性がある。
移植される細胞株とGBM細胞の量は、研究タイムラインを計画する際の他の重要な考慮事項です。C6ラット神経膠腫細胞株は、GBM研究で最も広く使用されている細胞株の1つです。ラットおよびマウスでは、頭蓋内移植27,28,29,30,31について、5 x 104および5 x 10 6の間の細胞数が報告されています。原則として、より多くの細胞を移植すると、より速い腫瘍増殖が期待されます。このプロトコルでは、1 x 105細胞を移植し、移植後11日目と12日目にイメージングを行いました。Xinらは、BALB/cヌードマウスに1 x 105 C6細胞を移植し、移植後7日目にMRIで進行性膠芽腫を検出し、15日後に死亡率が上昇したことを報告した30。比較すると、Jiaらは、より多くの細胞数(1 x 106)および同じマウス系統を使用し、7日目にMRIで、わずかに破壊された血液脳関門(BBB)を伴う小さな腫瘍塊を検出した。14日目には、エバンスの青色の染色が7日目よりも強く、BBBが非常に破壊されたことを示しています。次に、腫瘍の成長は、動物を実験にどれだけ長くとどめることができるかにも影響します。これは、縦断的画像研究における動物福祉の重要な考慮事項です。慢性頭蓋窓は、移植後最大6か月間の画像診断に適していると報告されています26。
このプロトコルで使用されるナノ粒子は、酸化鉄と蛍光色素成分で構成されています。考えられるアプリケーションには、新規治療薬の腫瘍送達の調査、細胞治療、および腫瘍血管系および腫瘍微小環境への介入が含まれます。さまざまな薬剤候補や併用療法を細胞レベルや分子レベルで評価することができます。NPの酸化鉄成分は、2P-IVMに加えて、MRIや磁性粒子イメージングによるマルチモーダルイメージングを可能にします。MRIは臨床的に関連する画像診断法であるが、その解剖学的分解能は生体内顕微鏡検査の解剖学的解像度よりも劣っている33。
この方法にも一定の制限があります。マウス脳アトラスによる脳座標は、C57BL/6Jマウスで標準化されており、マウス系統、性別、年齢に応じて調整する必要があります。さらに、2光子イメージングでは、約450μmの限られた深さにしかアクセスできません9。 したがって、2P-IVMでは腫瘍の部分的な特徴付けしかできず、腫瘍の特徴の地域差を見逃す可能性があります。さらに、NP投与後の2つの時点のみを組み入れた。静脈内投与後のより多くの時点を含む将来の研究により、腫瘍微小環境におけるNPの時空間挙動のより詳細な分析が可能になります。
結論として、膠芽腫のマウスモデルにおいて、2P-IVMを用いた蛍光標識酸化鉄ナノ粒子の腫瘍送達を評価しました。この手法は、さまざまな研究分野に合わせて簡単に変更でき、神経科学の分野における in vivo 脳イメージングの重要なツールとなっています。

2光子生体内顕微鏡(2P-IVM)は、生体組織1の可視化を可能にする蛍光イメージング技術です。
1990年代に初めて開発された2P-IVMは、網膜2、腎臓3、小腸4、蝸牛5、心臓6、気管7、脳のin vivo解析にさまざまな前臨床モデルで使用されています8,9。神経科学の分野では、2P-IVMは、覚醒動物の健康な脳のリアルタイムイメージング10や、アルツハイマー病11、パーキンソン病12、神経膠芽腫(GBM)13、14、15、16などの神経系疾患の研究技術として重要性を増しています16。
2P-IVMは、膠芽腫の発症中に腫瘍微小環境を研究するための洗練されたソリューションを提供します。以前の研究の中には、in vitro17 と ex vivo モデル18 に焦点を当てたものもあれば、GBM を調べるために in vivo モデル19 と異方性20 を実装したものもあります。Maddenらは、マウスモデル13においてCNS-1ラット神経膠腫細胞株のネイティブイメージングを行った。同所性GL261-DsRedマウスモデルを用いて、Ricardらは、2P-IVM14の腫瘍領域の血管を増強するために蛍光色素の静脈内投与を行った。 
ここでは、GBMの同所性マウスモデルにおける蛍光標識酸化鉄ナノ粒子(NP)の腫瘍送達を追跡するために2P-IVMを適用します。この手法では、頭蓋窓を用いて、脳内のNPのリアルタイム時空間分布を詳細に調べることができます。

<table><tbody><tr><td>0.9% 塩化ナトリウム注入液</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>Luer-Lok シリンジ、REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp;FBS</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーCytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>2光子顕微鏡</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol applicators, 70%</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, spray bottle</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>レイノルド ブランド</td><td>レイノルド ラップ ノンスティック アルミ ホイ</td><td></td></tr><tr><td>ル 麻酔器</td><td>パターソン サイエンティフィック</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>麻酔モニタリング&nbsp;</td><td>ケント・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. げっ歯類 Pulsoxymeter</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬 (100x)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン アプリケーター</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ、5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Size 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine sustained release</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1.0 mg/mL</td><td>ジェネリック医薬品を代わりに使用できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>C6ラット神経膠腫細胞株</td><td>ATCC(American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>カニューレ</td><td>BD</td><td>16 G、1.1 / 2 "、30 G、1"</td><td></td></tr><tr><td>カルプロフェン</td><td>ファイザー&nbsp;</td><td>リマジル、50 mg / ml</td><td>代わりにジェネリック医薬品を使用できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>セファゾリン</td><td>エージェント ファーマシューティカル</td>ズ <td>25021-101-10、1 g/バイアル</td><td>ジェネリック医薬品を代わりに使用できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>セルストレーナー、40 & マイクロ;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター、6インチ&nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>デンタルセメントキット、透明、2成分</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>ビメダ</td><td>138RX、2 mg/mL</td><td>ジェネリック医薬品を代わりに使用できます。&nbsp;</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>リカバリー、72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>ドレープ&nbsp;</td><td>カーディナルヘルス</td><td>バイオシールドラップ</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>Saeyang Microtech</td><td>エスコートプロ、B08350</td><td></td></tr><tr><td>ドリルのヒント&nbsp;</td><td>ヘイガー&Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>サイズ 005、米国 1/4</td></tr><tr><td>フィジー イメージング分析ソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>鉗子</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>フィッシャー ヘルスケア</td><td>滅菌綿ガーゼ パッド、4 x 4 インチ、22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>ゲルフォーム&nbsp;</td><td>株式会社エチコン&nbsp;</td><td>サージフォーム吸収性ゼラチンスポンジ、1972</td><td></td>年</tr>モデル <tr><td>ジャーミネーター&nbsp;</td><td>セルポイント・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>Germinator 500, No. 11688</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ、直径5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel カバーガラス&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手袋、非滅菌</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>ニトリルパウダーフリー健康診断用手袋</td><td></td></tr><tr><td>手袋、滅菌</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>教会 &ドワイト</td>・<td>ネール ヘアリムーバーローション&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>ハミルトンカンパニーインク</td><td>ガスタイト#1701、10 & マイクロ;L</td><td></td></tr><tr><td>CaなしHBSS、Mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドバー</td><td>Hongway</td><td>5 mm 内径 O リング</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>げっ歯類ウォーマーX2</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器Exel</td><td>International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2&プライム;</td><td></td></tr><tr><td>酸化鉄ナノ粒子</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>フェラヘム フェルモキシトール注射液 510 mg/17 mL 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>NSG, ひずみ005557</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡(手術)</td><td>ザイラーメディカル</td><td>ザイラー IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>ナノ粒子</td><td>カスタム</td><td></td><td>フルオレセインイソチオシアネートで標識された酸化鉄ナノ粒子(フェルモキシトール)</td></tr><tr><td>オフタルミック軟膏</td><td>主要医薬品</td><td>ルブリフレッシュ P.M.夜間軟膏、203964</td><td></td></tr><tr><td>酸素</td><td>リンデガス &イクイップメント株式会社&nbsp;</td><td>高圧鋼Kスタイルシリンダー、249CF、2000PSIG、CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックカップ</td><td>Georgia-Pacirif消費者製品</td><td>ディキシーポーションカップ、2オンス、プラスチック、透明、PK2400</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr>スケール <tr><td></td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>インテグラミルテックスステンレス鋼使い捨てメス</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-804-18</td><td></td></tr><tr><td>シーラント</td><td>ヘンケル株式会社</td><td>ロックタイト4014</td><td></td></tr><tr><td>シングルユースラボガウン</td><td>ハイテクコンバージョン</td><td>17-444-081</td><td></td></tr><tr><td>定位フレーム</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>滅菌真空ボトルトップろ過システム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S2GPU05RE、ミリポアシグマ NO.:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>発泡スチロールボックス</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>手術用手袋</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>外科用接着剤、3M Vetbond ティッシュ接着剤</td><td>3M アニマルケア製品</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>テール静脈キャテザー</td><td>カスタム</td><td></td><td>シリコンチューブに接続された2つの30Gカニューレで構成されています&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), no phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolett torch</td><td>Spring sunshine technology</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

脳腫瘍に対する静脈内投与されたがん治療薬の送達は、血液脳関門によって制限される。 in vivo における脳腫瘍における高分子の蓄積と分布を直接画像化する方法は、前臨床モデルにおける薬物送達を理解し、最適化する能力を大幅に向上させるでしょう。このプロトコルはglioblastoma (GBM)のマウス モデルの2光子のintravital顕微鏡検査(2P-IVM)の静脈内投与された蛍光標識されたnanoparticlesの生体 内の 追跡のための実時間方法を説明する。
プロトコルには、実験動物の麻酔と鎮痛、頭蓋窓の作成、GBM細胞の移植、ヘッドバーの配置、2P-IVM研究の実施、長期フォローアップ研究のための術後ケアなど、手順の多段階の説明が含まれています。代表的な2P-IVMイメージングセッションと画像解析を示し、この技術の長所と短所を検討し、潜在的なアプリケーションについて議論します。
この方法は、 in vivo 前臨床脳イメージングの分野におけるさまざまな研究課題に簡単に変更および適応できます。

ここでは、頭蓋窓手術を行い、GBMのNSGマウスモデル(n=5)にC6細胞を生着させました。窓の作成に関与するすべてのコンポーネント(図1A)を適切にシールすることで、長期間のイメージングに対する窓の耐久性が保証され、さらに罹患率が低下します。 in vivo 2P-IVMに適合したステージ(図2)を使用すると、麻酔下で最大2時間、大きなモーションアーチファクトなしで動物を画像化することができました。GBM担持マウスにナノ粒子を静脈内適用してから約10分後、2P-IVMは、FITC標識ナノ粒子の血管内局在と一致する、腫瘍領域の血管の緑色の蛍光シグナルを示します。血管の外側には少量の緑色蛍光シグナルのみが認められ、NPの血管外漏出が始まっていることを示しています(図3A)。血管外腔から発信されるFITCシグナルの増加が見られ、これは血管外漏出の進行と一致しています(図3B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> 図 1.頭蓋窓の配置、開頭術、移植、およびイメージング。 (A)頭蓋窓の解剖学的配置の断面。ヘッドバーはメタルフリーであるため、2光子生体内顕微鏡に加え、磁気共鳴画像法や磁性粒子イメージングを行うことが可能です。(B)開頭手術(左)、細胞移植(中)、2光子生体内顕微鏡(右)の概要(上段)と詳細図(下段)。頭蓋骨を開くと、表在性出血が発生し(左)、すぐに再吸収されます(中央)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> 図 2.ステージのコンピューター支援設計(CAD)。in vivo 2光子生体内顕微鏡に使用されるステージのCADで、バイトバー、ヘッドバーの安定化、高さと角度を調整するためのネジなどが含まれます。3D CAD ファイルは、補足コーディング ファイル 1 にあります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> 図 3. In vivo 2光子生体内顕微鏡画像。 (A)ナノ粒子の静脈内投与の10分後および(B)24時間後に取得した画像。GBM細胞は赤色のスペクトル(左)で蛍光シグナルを発しますが、脳組織のナノ粒子は緑色(右)で可視化されています。 # は血管外漏出NPを示し、 * は血管を示します。限られた数の粒子のみが血管外漏出を受けており、NP投与の10分後に腫瘍細胞の近傍に見られます。膠芽細胞の領域に豊富な粒子が見られ、NP投与後24時間での血管外漏出を示唆しています。ナノ粒子は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)と酸化鉄ナノ粒子(Ferumoxytol)で構成されています。スケールバーは100μmを表します。略語:2P-IVM:2光子生体内顕微鏡、RFP:赤色蛍光タンパク質、GBM:膠芽腫、FITC:フルオレセインイソチオシアネート、NP:ナノ粒子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル1:ステージの3D CADファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

マウスモデルにおける膠芽腫への蛍光標識酸化鉄ナノ粒子の腫瘍送達の2光子顕微鏡法の新しいアプローチを紹介します。

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

神経膠芽腫は最も一般的な原発性脳腫瘍の1つであり、急速な増殖と平均余命の短さと関連しています。膠芽腫の効果的な治療法の開発は、治療薬の提供が血液脳関門によって制限されているため、依然として大きな課題です。脳内の高分子の蓄積と分布を直接画像化する方法は、薬物送達を理解し、最適化する能力を大幅に向上させるでしょう。2光子顕微鏡は、神経膠芽腫の前臨床モデルにおけるナノ粒子のリアルタイム分布を研究するための洗練されたソリューションを提供します。この研究で使用したナノ粒子を改変することで、細胞レベルや分子レベルでさまざまな薬剤候補や併用療法の送達を調べることができます。2光子生体内顕微鏡法に加えて、これらのナノ粒子の酸化鉄成分は、MRIまたはMPIによるマルチモーダルイメージングを可能にします。将来的には、がんの早期発見を実現し、悪性腫瘍に対するより効果的な治療法につながることが期待されます。これを達成するための1つの方法は、2光子生体内顕微鏡法を陽電子放出断層撮影法や光音響超音波などの他のイメージングモダリティと融合させることです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの</emマウス神経膠腫の>生物発光イメージング

私たちは、ヌードマウスとその後シリアルの脳に人間の多形性膠芽腫細胞の正確な、定位注入のための統合方法を説​​明...

定位頭蓋内注入と<emインビボ&gt;</em多形性膠芽腫のマウスモデル系における腫瘍異種移植片の&gt;生物発光イメージング

このビデオでは、マウスモデルに事前に注射されたがん細胞の生体内イメージングを、埋め込み頭蓋窓を介して行っています。この高解像度タイムラプスイメージング技術により、生きたマウスにおけるがん細胞の動的挙動の研究が可能になります。...

マウスモデルにおける頭蓋窓ベースの生体内イメージング:マウスモデルの脳内における事前注射癌細胞の挙動を研究するためのイメージング技術

このビデオでは、マウスモデルにおける蛍光タンパク質タグ付き膠芽腫異種移植片のin...

蛍光分子断層撮影法:マウスモデルにおける蛍光タンパク質タグ付き神経膠芽腫異種移植片のIn vivoイメージングのためのイメージング技術

出典: Clark, AJ, et al. 神経膠芽腫に対する免疫担当動物モデルの生物ルミネセンスイメージングJ. Vis.

神経膠芽腫に対する免疫担当マウスモデルの生物発光イメージング

我々は、腫瘍の成長の間の遊びで、通常の生物物理学的な制約を再現生体2光子顕微鏡用マウスにおける皮質同所神経膠芽腫モデルを確立している。腫瘍の上に頭蓋骨を交換慢性ガラス窓は、2光子顕微鏡による経時的な腫瘍進行のフォローアップを可能にします。...

同所神経膠芽腫モデルマウスは、脳実質細胞の物理的制約を維持し、生体内二光子顕微鏡に適し

GL261神経膠腫細胞は、神経膠芽腫の有用な免疫適格動物モデルを提供します。このプロトコルの目標は、in vivo 生物発光イメージングを使用して頭蓋内腫瘍の成長を監視するための適切な技術を実証し、腫瘍免疫学および神経膠芽腫を治療するための免疫療法アプローチを研究するためのルシフェラーゼ修飾 GL261...

神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

腫瘍細胞の同所性頭蓋内注入は、脳腫瘍生物学、進行、進化、および治療反応を研究するがん研究に使用されています。リアルタイム生体イメージングと定量腫瘍の臨床神経膠芽腫モデルで質量を提供する蛍光分子腫瘍異種移植片のトモグラフィーをご紹介します。...

膠芽腫の異種移植片の生体内イメージング用蛍光分子トモグラフィー

癌の悪性挙動を理解するには、腫瘍細胞がマクロファージなどの腫瘍微小環境の構成要素とどのように相互作用するかについての正確なモデルを作成する必要があります。ここでは、膠芽腫細胞と腫瘍関連マクロファージおよびミクログリアとの相互作用を研究するための2つの方法について説明し、膠芽腫の浸潤への影響が評価されます。...

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

このプロトコルは、真空安定化イメージングウィンドウを使用して、無傷の肺の長期高解像度シングルセルイメージングをリアルタイムで行うための多光子顕微鏡の使用を説明しています。...

真空安定化撮像窓と肺における長期高分解能生体顕微鏡

学ぶマウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡法。蛍光標識鉄酸化物ナノ粒子の脳腫瘍への薬物送達メカニズムをリアルタイムで可視化し、血脳関門を越えた治療戦略の最適化に貢献します。

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

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