Name: 慢性肺同種移植拒絶反応のマウスモデルにおけるコラーゲン沈着の半定量的組織病理学的評価のためのピクロシリウス赤色染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T12:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: 学ぶ ピクロシリウス赤色染色を用いたマウス肺移植モデルにおけるコラーゲン沈着の半定量的評価法。厚いコラーゲン線維と薄いコラーゲン線維を区別し、慢性肺同種移植拒絶反応における線維化の進行を解析する。

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すべての動物プロトコルは、人道的な動物研究のための3Rの倫理原則に準拠しており、地元の獣医倫理委員会(Veterinäramt Kanton Zürich, Switzerland, Study number 45/2014)によって承認されました。同様に、読者は実験動物で手順を実行する前に、関連機関から許可を得る必要があります。
1. サンプル取得
<ol>
	<li>個々のニーズとそれぞれの倫理的承認に従って動物実験を実施します。1人の顕微外科医が、虚血の長期化時間を追加することなく、すべての手術を行います。 注:代表的な結果の再現については、Charles River Laboratoriesから特定の病原体を含まない成体雄C57BL/6J、C57BL/10J、および体重27-30 gのBALB/cマウスを入手してください。アイソグラフトには、C57BL/6J動物をドナーとレシピエントの両方として使用します。マイナーミスマッチモデルでは、C57BL/10Jドナー肺をC57BL/6Jレシピエントに移植します。主要なミスマッチ モデルでは、BALB/c ドナー肺を C57BL/6J レシピエントに移植し、術後にシクロスポリン (10 mg/kg/日) とメチルプレドニゾロン (1.6 mg/kg/日) を毎日皮下注射します5.灌流には生理食塩水を使用し、8週間(56日)後に肺を回収します。</li>
	<li>安楽死のためには、20Gカテーテルで動物を挿管し、2%〜3%イソフルランを補充したO2 で換気します。足の挟み込みに対する反応がないことにより、麻酔の十分な深さを確認します。</li>
	<li>腹腔内軟骨切開術は、手術用ハサミで腹壁を切開し、胸骨の長さを切開して心臓を露出させることにより行います。下大静脈と左心房付属器を解剖学的位置で特定します。</li>
	<li>素早く続けて、下大静脈と左心房付属器を手術用ハサミで切断し、注射器で肺動脈の根元から3〜5mLの0.9%NaClを動物に灌流して、肺循環からすべての血液を取り除きます。 注:安楽死は、それぞれの倫理的承認に従って実施する必要があります。他の方法も同様に適用できます。肺循環からの血液を完全に除去することが推奨されますが、これは循環停止後の灌流によっても行うことができます。</li>
	<li>はさみを使用して灌流された肺を取り除きます。</li>
	<li>保存のために、サンプルを4%ホルマリンでインキュベートします。ホルマリン溶液を気管支と肺血管系に直接注入します。サンプルをホルマリンに浸し、少なくとも6時間インキュベートします。 注:ホルマリンによる肺の膨張については、同等の結果を得るために標準化された手順を適用する必要があります。.このような手順のプロトコルの例は、他の場所で公開されています10,11。</li>
	<li>実験的なニーズに応じて臓器をトリミングします。横方向に肺を半分に切り、気管支樹のすべての部分をセクションに捕らえます。</li>
	<li>アルコール配列で脱水するためにサンプルを自動組織処理装置に移し、次のようにキシロールおよびパラフィンコーティングで透明化します:70%エタノール、70%エタノール、80%エタノール、96%エタノール、100%エタノール(各1時間)、100%エタノール、100%エタノール、キシロール(各2時間)、キシロール(1時間)、およびパラフィン3xで2時間。</li>
	<li>パラフィンを溶解し、サンプルを正しい向きでポリオキシメチレン包埋カセットに埋め込みます。切断面を下に向けてサンプルを埋め込むように注意してください。ロータリーミクロトームを使用して、5μmの切片を連続して切断します。スライドを37°Cで24時間乾燥させてから、さらに処理します。</li>
</ol>
2. パラフィンスライドの脱パラフィンと水和
<ol>
	<li>サンプルを100%キシロールに2回、それぞれ5分間インキュベートして、パラフィンを除去します。 注意: キシロールは可燃性で健康に害を及ぼします。ヒュームフードの下でのみ使用してください。</li>
	<li>サンプルを100%エタノール、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、および50%エタノールでそれぞれ2分間水和します。その後、蒸留水で2分間洗浄します。</li>
</ol>
3. Picrosirius Redによる染色
<ol>
	<li>スライドをMeyerのヘマラム溶液で8分間染色します。水道水でスライドを10分間洗います。</li>
	<li>スライドをPicrosirius Red溶液で1時間インキュベートします。Picrosirius Red溶液には、プレミックス染色溶液を使用するか、飽和ピクリン酸で希釈したDirect Red 80またはSirius Red F 3B(CI 35780)の0.1%を使用してください。 注意: ピクリン酸は可燃性で爆発性が高いため、慎重に取り扱う必要があります。 注:Picrosirius Red染色キットには、 材料表に記載されているように、さまざまなサプライヤーが入手可能です。価格や染色方法の違いに注意し、常にサプライヤーの指示に従ってください。Sirius Red F 3B(CI 35780)の特定のカラーインデックスを持つ染色キットのみを使用することをお勧めします。</li>
	<li>スライドを酢酸溶液(0.5%)に5x〜10x浸します。スライドを静かに振って、溶液を物理的に取り出します。</li>
	<li>スライドを95%エタノール、100%エタノール、100%エタノール、100%キシロール、および100%キシロールでそれぞれ5分間脱水します。</li>
	<li>各サンプルに封入剤を1滴加えて埋め込み、カバースリップで覆います。スライドをドラフトの下で乾かします。</li>
</ol>
4. デジタル化と画像処理
<ol>
	<li>適切なイメージングソフトウェアを搭載した光学顕微鏡で、画像が鮮明で鮮明になるまでサンプルの焦点を合わせます。偏光フィルターを追加し、背景が完全に暗くなるか黒くなるまで偏光の度合いを調整します。背景ができるだけ暗い場合、正しい偏光が達成されます。 注:偏光フィルターを使用せずに、従来の透過光でピクロシリウスレッド染色を視覚化することも可能です。この目的のために、シリウスレッドを単独で使用するよりも感度が高いことが示されているため、ファストグリーンと一緒にシリウスレッドを使用することをお勧めします12,13。しかし、太いコラーゲン繊維と細いコラーゲン繊維を区別するためには、偏光顕微鏡が必要です。</li>
	<li>すべてのサンプルを20倍の倍率で完全にスキャンし、.tiffとしてエクスポートします。フィジーソフトウェアへの転送14.スライドは事前に適切にクリーニングし、露光時間と光源強度に関する標準化された設定を使用してください。</li>
	<li>サンプルを手動で囲み、ソフトウェアで Edit &gt; Clear Outsideを使用して切り取ります。[ 解析] &gt; [計測] をクリックして、総表面積を計測します。 注:測定するコンパートメントの選択は、信頼性が高く比較可能な結果を作成するための重要なステップです。サンプル全体をデジタル化して選択することで、良好な断面が表示され、不均一な組織を全体として考慮します。ただし、胸膜や個々の気管支など、サンプル内の特定の領域に自分自身を閉じ込めることも可能です。比較するコンパートメントは常に標準化された方法で選択することに注意してください。サンプルが換気に大きなばらつきを示す場合、分析されたコンパートメント15から空域領域を除外することをお勧めします。</li>
	<li>「 Image (画像)」&gt;「Adjust &gt; Color Threshold 」をクリックし、設定を調整するには「 Analyze (分析)」&gt;「Analyze Particles」をクリックして、サンプルあたりの総コラーゲン含有量を測定しColor Threshold(カラーしきい値)をクリックします。サイズ = 1 - 無限大、クリア、集計を設定します。明るさ = 35 - 255。色相 = 2 - 130 注:色のしきい値を合理的に設定することは、信頼性の高い結果を得るために重要です。</li>
	<li>色相を赤 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> 太いコラーゲン繊維(色相2-30)、黄緑 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> 細いコラーゲン繊維(色相31-130)に調整して、太いコラーゲン繊維と細いコラーゲン繊維について繰り返します。結果は、染色されたピクセルの領域になります。</li>
	<li>マクロを自動処理用に構成するには 、「Plugins &gt; Macros」&gt;「Record and repeat」をクリックし、すべてのサンプルで繰り返します。</li>
	<li>断面の表面積に標準化された最終値を受け取るには、すべてのパラメーターの染色されたピクセルの面積を、各サンプルのステップ4.3と4.5でそれぞれ測定した総表面積で割ります。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Picrosirius Red染色を用いたマウス肺線維症におけるコラーゲン評価

<ol><li>Weigt, S., DerHovanessian, A., Wallace, W., Lynch, J., Belperio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchiolitis+Obliterans+Syndrome%3A+The+Achilles%27+heel+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bronchiolitis Obliterans Syndrome: The Achilles' heel of lung transplantation.</a> Semin Respir Crit Care Med. 34 (3), 336-351 (2013).</li>
<li>Verleden, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lung+allograft+dysfunction%3A+Definition%2C+diagnostic+criteria%2C+and+approaches+to+treatment-A+consensus+report+from+the+Pulmonary+Council+of+the+ISHLT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Chronic lung allograft dysfunction: Definition, diagnostic criteria, and approaches to treatment-A consensus report from the Pulmonary Council of the ISHLT.</a> J Heart Lung Transplant. 38 (5), 493-503 (2019).</li>
<li>Lama, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+lung+transplant+research%3A+A+consensus+statement+from+the+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop.</a> JCI Insight. 2 (9), e93121(2017).</li>
<li>Martinu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+chronic+lung+allograft+pathology+in+a+mouse+minor-mismatched+orthotopic+lung+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Spectrum of chronic lung allograft pathology in a mouse minor-mismatched orthotopic lung transplant model.</a> Am J Transplant. 19 (1), 247-258 (2019).</li>
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<li>Courtoy, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+of+Picrosirius+Red+staining%3A+A+robust+method+for+multi-organ+fibrosis+quantification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis of Picrosirius Red staining: A robust method for multi-organ fibrosis quantification and characterization.</a> Biomolecules. 10 (11), 1585(2020).</li>
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<li>Zhou, X., Moore, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+section+staining+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Lung section staining and microscopy.</a> Bio Protoc. 7 (10), e2286(2017).</li>
<li>Herovici, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picropolychrome%3A+histological+staining+technic+intended+for+the+study+of+normal+and+pathological+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Fr+Etud+Clin+Biol%22%5BJournal%5D)">Picropolychrome: histological staining technic intended for the study of normal and pathological connective tissue.</a> Rev Fr Etud Clin Biol. 8, 88-89 (1963).</li>
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<li>Montes, G. S., Junqueira, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Picrosirius-polarization+method+for+the+study+of+the+biopathology+of+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">The use of the Picrosirius-polarization method for the study of the biopathology of collagen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 86, Suppl 3 1-11 (1991).</li>
<li>Rittié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Picrosirius+Red-polarization+detection+of+collagen+fibers+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Method for Picrosirius Red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections.</a> Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).</li>
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<li>Feingold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+myocardial+fibrosis+among+healthy+pediatric+heart+transplant+recipients%3A+Correlation+of+histology%2C+cardiovascular+magnetic+resonance%2C+and+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diffuse myocardial fibrosis among healthy pediatric heart transplant recipients: Correlation of histology, cardiovascular magnetic resonance, and clinical phenotype.</a> Pediatr Transplant. 21 (5), 12986(2017).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Honeywell, Charlotte, USA</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>4633000956 (serial number)</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip 1.5</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>KCY5.1</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37%</td><td>Fisher Scientific, Leicestershire, UK</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Meyer's hemalum solution</td><td>Merck,ダルムシュタット、ドイツ</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Solution</td><td>Morphisto、オッフェンバッハ・アム・マイン、ドイツ</td><td>13422</td><td>使用できる代替品:ab150681、abcam、ケンブリッジ、英国;SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US</td></tr><tr><td>Polarizing filter</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>000000-1121-813</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome, HistoCore AUTOCUT</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>149AUTO00C1, 14051956472</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Histokitt mounting medium</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Plast Paraffin</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6642.5</td><td></td></tr><tr><td>Rotilabo埋め込みカセット、POM</td><td>Roth、カールスルーエ、ドイツ</td><td>K113.1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Adhesion Microscope slide</td><td>epredia、ポーツマス、英国</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Processor&nbsp;</td><td>ライカ、ウェッツラー、ドイツ</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィジー ソフトウェア バージョン 2.14.0/1.54f</td><td>オープン ソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イメージング ソフトウェア ZEN 3.4.91</td><td>ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

慢性肺同種移植拒絶反応のマウスモデルにおけるコラーゲン沈着の半定量的組織病理学的評価のためのピクロシリウス赤色染色

Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft Rejection

上記のプロトコルは、マウス肺組織中のコラーゲン沈着の客観的な半定量的評価を可能にします。線維性リモデリングは、肺移植後の慢性拒絶反応の病態生理学的特徴です。したがって、Picrosirius Red染色は、左側マウス同所性肺移植を用いた慢性肺同種移植拒絶反応モデルに適用されました。軽度の免疫抑制下でのBALB/cドナーからC57BL/6レシピエントへの主要なMHCミスマッチ肺移植は、ヒトの慢性肺同種移植片機能障害に匹敵する線維性変化をもたらします5。対照的に、C57BL/10ドナーからC57BL/6レシピエントへの軽度のMHCミスマッチ移植は、主にリンパ球性細気管支炎を引き起こします6。 図1 は、実験のセットアップを詳細に示しています。
図2は、2つのモデルの移植された左肺からの代表的な画像とC57BL/6Jアイソグラフトの概要を示しています。MassonのTrich...

Fibrosis is the pathophysiologic hallmark of chronic rejection after lung transplantation and the foremost hurdle to long-term recipient survival. Several ...

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Biology

生物学

このビデオでは、線維組織切片における過剰なコラーゲン沈着を検出するための線維性組織のピクロシリウス赤色染色について説明しています。この染色技術は、結合組織疾患におけるコラーゲン発現の評価に役立ちます。...

Picrosirius赤偏光染色:明視野顕微鏡を用いた心臓組織切片の線維症検出技術

ここでは、拒絶反応の免疫学を研究するためのプロトコルを提示します。手術モデルは、短い手術時間と簡潔な技術のレポートを提示しました。ドナーとレシピエントの系統の組み合わせによっては、移植された腎臓は、間質性線維症と尿細管萎縮によって定義される急性細胞拒絶反応または慢性同種移植片損傷を発症する可能性があります。...

マウス腎臓移植：同種移植片拒絶のモデル

の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

本研究の目的は、火傷治癒のマウスモデルを開発することであった。熱熱熱は、予熱された真鍮テンプレートを使用してマウスの後部皮膚に誘発された。焼失した組織は、遺伝的に類似したドナーマウスの尾から採取した皮膚移植片で破片化され、重ね合わせた。...

同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

このプロトコルは鼻の点滴によって無水ケイ酸懸濁液への反復的な露出によって珪肺症のマウス...

結晶性シリカダストの反復吸入による珪肺症マウスモデル

ウイルス誘発性胆道閉鎖症(BA)の肝線維化機構研究に適した動物モデルと、将来のBA治療のプラットフォームを提供する慢性肝線維症のマウスモデルを確立しました。...

胆道閉鎖症研究のための慢性肝線維症のマウスモデル

ここでは、移植したマウスの左肺を2光子顕微鏡で生体内イメージングするプロトコールを紹介します。これは、マウス肺移植後の細胞動態と相互作用をリアルタイムで研究するための貴重なツールです。...

移植されたマウス肺の生体内2光子顕微鏡検査

代謝機能障害、肝臓遺伝子発現の変化、およびヒトMASLDに似た肝臓病理組織学的変化を伴う代謝機能障害関連脂肪性肝疾患(MASLD)のマウスモデル(進行性線維症ステージ3に進行する線維症を含む)。このモデルは、MASLDの病態生理学の研究や、新しい治療法の前臨床試験に使用することができます。...

線維症を伴う代謝機能障害関連脂肪性肝疾患のマウスモデル

このプロトコルは、ブレオマイシンの中咽頭反復投与によりマウスに肺線維症を誘発する方法を描写し、特発性肺線維症のものによく似た病理学的特徴をもたらします。...

特発性肺線維症の洗練されたマウスモデル

手術を試みる前に、新たな外科医は、基本的な手術手技や概念のトレーニングが必要です。この記事では、げっ歯類に重点を置いた基本的な手術の考慮事項を紹介します。...

新外科医のための齧歯類の外科の原則

学ぶ ピクロシリウス赤色染色を用いたマウス肺移植モデルにおけるコラーゲン沈着の半定量的評価法。厚いコラーゲン線維と薄いコラーゲン線維を区別し、慢性肺同種移植拒絶反応における線維化の進行を解析する。

慢性肺同種移植拒絶反応のマウスモデルにおけるコラーゲン沈着の半定量的組織病理学的評価のためのピクロシリウス赤色染色

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