慢性肺同種移植拒絶反応のマウスモデルにおけるコラーゲン沈着の半定量的組織病理学的評価のためのピクロシリウス赤色染色

私たちの研究は、慢性肺同種移植片拒絶反応における線維症の発症の分析に焦点を当てています。したがって、線維性組織コンパートメントを特徴付ける方法に関心があります。移植関連疾患の再現には、数年前に導入した単肺移植のマウスモデルを採用しています。

このモデルでは、同種マウス系統間での肺の移植は、異なるレベルの移植片線維症をもたらすことが示されています。線維性組織リモデリングに関する組織学データは、しばしば定性的に提示されます。Picrosirius Red染色法は、半定量的評価の利点を提供し、太いコラーゲン繊維と細いコラーゲン繊維を区別します。

まず、パラフィン包埋マウス肺サンプルをエタノール濃度を減少させて、それぞれ2分間水和します。スライドをマイヤーのヘマラム溶液で8分間染色します。流水でスライドを10分間洗浄し、その後、スライドをPicrosirius Red溶液で1時間インキュベートします。

スライドを0.5%酢酸溶液に5〜10回浸します。スライドを静かに振って溶液を取り除きます。次に、スライドをエタノール濃度と100%キシロールをそれぞれ5分間増やして脱水します。

埋込用のサンプルに封入剤を1滴加え、カバースリップで覆います。スライドをドラフトの下で乾かします。光学顕微鏡下で、適切なイメージングソフトウェアを使用して、鮮明で鮮明な画像が得られるまでサンプルの焦点を合わせます。

背景が完全に暗くなるか黒くなるまで、偏光フィルターの度合いを調整します。サンプルを20倍の倍率でスキャンし、画像をTIFF形式でエクスポートします。画像をフィジーのソフトウェアに転送します。

「編集」をクリックし、「外部をクリア」を選択します。次に、[分析]、[計測]の順にクリックして、総表面積を測定します。サンプルごとのコラーゲン含有量の合計を測定するには、[Image] をクリックし、[Adjust] と [Color Threshold] をクリックします。

色相を 2 から 130 まで、明るさを 35 から 255 まで設定します。次に、[分析] をクリックし、[パーティクルの分析] ウィンドウでサイズを 1 から無限遠を引いた値に設定し、[クリア] ボックスと [集計] ボックスをオンにします。濃厚なコラーゲン繊維の分析では色相を赤に、細いコラーゲン繊維の分析では黄緑に調整し、総コラーゲン数を測定します。

最後に、「プラグイン」、「マクロ」、および「レコード」をクリックして、マクロを自動処理用に構成します。Massonのトリクローム染色、Herovici染色、Picrosiriusレッド染色は、主要な組織適合遺伝子複合体の不一致モデルにおける広範な傍気管支および傍血管コラーゲン沈着を示しました。軽度の不一致モデルは、主に密集したリンパ球浸潤を示し、コラーゲン沈着はそれほど強くありませんでした。

偏光フィルターによるPicrosirius Red染色では、両モデルで堆積した繊維の緑色の外観が明らかになりました。アイソグラフトコントロールは、ナイーブマウスの肺と同様に、傍気管支および傍血管の境界に限定されたコラーゲンを示しました。デジタル画像解析により、主要な組織適合遺伝子複合体の不一致肺移植片では、軽度の不一致移植片、右側ナイーブ肺組織、またはナイーブBALB/c左肺と比較して、総コラーゲンの増加が明らかになりました。

太いコラーゲン繊維の違いは示されませんでした。細いコラーゲン線維の分析では、マイナーミスマッチモデル、ナイーブな右側肺組織、またはナイーブなBALB/c左肺と比較して、メジャーミスマッチモデルでの存在が増加したことが示されました。