Name: 赤痢菌による上皮細胞感染解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: 学ぶ上皮細胞感染アッセイを用いたShigellaの接着・侵入・細胞内増殖メカニズム。胆酸やグルコースなどの消化管信号が病原性遺伝子発現に与える影響を解明し、新規治療薬やワクチン開発に貢献する知見を提供する。

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著者への支援には、マサチューセッツ総合病院の小児科、研究暫定支援資金(ISF)に関する執行委員会賞2022A009041、国立アレルギー感染症研究所の助成金R21AI146405、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の助成金ハーバード大学栄養肥満研究センター(NORCH)2P30DK040561-26が含まれる。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

結腸上皮細胞の 赤痢 菌感染を分析するためのプロトコル

著者は利益相反がないことを宣言します。

このプロトコルは一組の腸の上皮セルの赤痢菌の付着、侵入および細胞内の複製を調査する3つの標準化された試金を記述する。これらの方法は、宿主細胞内のさまざまな細菌性病原体の侵入および細胞内複製を研究するために使用される古典的なゲンタマイシンアッセイの単なる修正版ですが49,50,51、赤痢菌を研究する際には特別な考慮事項を適用する必要があります。
赤痢菌は通性嫌気性菌であり、曝気43の豊富な培地中で37°Cで最適に成長します。赤痢菌感染症に対するさまざまな環境シグナルまたは代謝物の影響を調べるためにこれらのアッセイを実施する場合は、赤痢菌をリッチ培地で一晩培養し、感染前の中間期まで定義培地またはサプリメント培地に継代培養することをお勧めします。最大病原性遺伝子発現は、成長の対数期に発生します52,53。したがって、赤痢菌培養物を一晩継代培養し、細菌を指数関数的段階(OD600~0.7)まで増殖させることは、赤痢菌の病原性を適切に評価するために必要なステップです。さらに、病原性遺伝子の発現は温度依存的です。宿主感染時のみ発現の特異性を確保するために、病原性遺伝子は宿主の生理学的温度(37°C)で誘導され、より低い温度(例えば30°C)で厳密に抑制される54。病原性遺伝子の発現を確実にするために、細菌の継代培養と感染は、温度が37°Cを下回らないように適切な注意を払って、37°Cで行う必要があります。 浸潤と上皮細胞感染に必要な分子機構をコードする220キロ塩基の大きな病原性プラスミドは、すべての赤痢菌属菌5に必須の病原性決定因子です。継代を繰り返すと、37°Cで増殖が長引くと、病原性プラスミドが不安定になり、プラスミドが失われ、赤痢菌細胞が病原性55になります。病原性プラスミドの維持と重要な病原性遺伝子の発現を確実にするために、2週間ごとに冷凍ストックから新鮮なTSB + Congoレッドインジケータープレートに直接細菌を再ストリークすることをお勧めします。コンゴ赤寒天培地は、野生型病原性(赤、CR+)コロニーと、病原性プラスミド45を失った病原性(白色、CR−)コロニーを区別するために用いることができる。病原性プラスミドの不安定性が繰り返し観察される場合は、赤痢菌の一晩培養を30°Cでインキュベートして病原性プラスミドの損失を防ぎ、続いて37°Cで継代培養して病原性遺伝子の発現を促進することができます43。最後に、変異体および/または補完株を用いた分析を行い、これらの細菌株に抗生物質マーカーが存在する場合は、細菌の夜間および継代培養のステップで適切な抗生物質の選択を行うことが推奨されます。
HT-29上皮単分子膜の使用は、in vitroで赤痢菌の病因の分子メカニズムを研究するための多くの利点を有する。赤痢菌はヒトに適応した病原体であるため、小動物モデルはヒトで観察された赤痢症の特徴的な病因を正確に反映していない36。したがって、ヒト由来の細胞株の感染に標準化されたプロトコルを使用することで、細菌の病原性の個々のステップを定量的に調べて、この病原体とその天然宿主との間の分子相互作用を特徴付けることができます。歴史的に、HeLa細胞は主にin vitroで宿主と病原体の相互作用を研究するために使用されていました25,56,57。しかし、HeLa細胞は不死化子宮頸がん細胞株であり、腸内細菌病原体の非天然宿主細胞です。したがって、腸管病因のin vitro研究は、結腸腺癌細胞株(HT-29、Caco-2、およびT84など)の使用に移行しており、これは腸上皮の形態をより忠実に再現し、頂点および基底外側表面を分化した上皮単層としてトランズウェル上で増殖させることができる58,59,60.各細胞株には個別の長所と短所がありますが、HT-29細胞は、腸管細胞との表現型の類似性、および細胞表面受容体および炎症誘発性サイトカインの強力な発現により、ここで説明するアッセイに使用されます58,59,61。しかしながら、これらの議論されたモデルのそれぞれは、in vivoにおける結腸上皮の自然な生理学的状態を正確に表さない異常な代謝および増殖表現型を有する癌由来の細胞株である58。ヒト組織培養技術の最近の進歩により、組織生検から得られたヒト腸幹細胞を、ヒト消化管(GI)路に存在するさまざまな細胞タイプを再現するオルガノイドまたは単一の2次元細胞単層に培養することが可能になりました62,63,64.腸管オルガノイドは、腸細胞、粘液産生杯細胞、M細胞、およびその他の組織特異的細胞タイプを含むように分化することができます。最近の研究では、さまざまな赤痢菌、サルモネラ・エンテリカ、大腸菌病原体などの腸内病原体を研究するためのこれらのオルガノイドモデルの使用が検証されています62,63,64。オルガノイドはヒト消化管上皮のより正確なモデルであり、世界人口を表すためにさまざまな栄養条件で培養することさえできるが65、その相対的な複雑さは、かなりのトレーニングと技術的専門知識を必要とし、従来の癌細胞株と比較してコストが高く、培養時間が長くなります58。
このプロトコルでは、2枚の6ウェルプレートを合計12枚の単層でテストに用いるという、中程度のスループットの方法を説明しています。しかし、実験は簡単にスケールアップして、追加の技術的複製に対応するために播種する単層の数を増やしたり、追加の 赤痢菌 変異体や環境シグナルをテストしたりすることができます。より多くのウェルを有する組織培養プレート(例えば、12ウェルまたは24ウェルプレート)も、より小さな直径を有するウェルを考慮して適切な調整とともに使用することができる。ステップ3.2で概説したHT-29増殖条件下では、HT-29力価は、1つのT75フラスコから培養後に約6枚の6ウェルプレートを播種するのに十分であり、HT-29細胞培養を維持するのに十分な細胞が残っています。さらに、HT-29単層の播種および接種細菌の調製ステップは、細菌付着、浸潤、および細胞内複製アッセイの間で同一である。したがって、同じ 赤痢菌 株または継代培養条件を試験するアッセイを並行して容易に実施して、 赤痢菌 感染のさまざまな段階における各実験条件の役割を同時に調べることができます。
接着菌(ステップ4)、浸潤細菌(ステップ5)、細胞内細菌(ステップ6)の回収力価は、溶解後の感染HT-29細胞の段階希釈液を播種することによって決定され、赤痢菌感染の各段階の効率を定量的に評価することができます。古典的なアッセイ49,50,51に基づく浸潤および細胞内複製アッセイにおける遠心分離ステップは、細菌と宿主細胞との接触を促進して即時侵入させ、侵入率を高めます。したがって、遠心分離は、後に赤痢菌感染の重要な側面であることが発見された付着ステップを「スキップ」します17,18,19,66。遠心分離ステップは、トランズウェルに播種された分極上皮細胞では実行できないことに注意することが不可欠です。しかし、アドヒアランスアッセイでは、遠心分離によってアドヒアランスが強制されることはなく、溶解前に感染したHT-29細胞にゲンタマイシンを添加しないため、接着細菌細胞の計数が可能です。組織培養培地の容量を1 mLに減らして(浸潤および細胞内複製アッセイでは2 mL)、細菌とHT-29細胞とのより効率的な接触を可能にします。さらに、付着率によっては、3時間のインキュベーション中に浸潤および細胞内複製が起こり得るが、その量は通常無視できる(例えば、宿主細胞溶解後に回収された細菌集団のわずか0.05%)。それにもかかわらず、3時間のインキュベーション中に付着細菌と細胞内細菌を適切に考慮するために、記載されたプロトコルに加えて、2番目のプレートを50 μg/mLのゲンタマイシンとウェルあたり2 mLのDMEMで合計45分間インキュベート(15分間のインキュベーション、洗浄、新鮮なDMEM +ゲンタマイシンを30分間)インキュベートして、細胞外細菌を完全に溶解するパラレルアッセイを実施することをお勧めします。プロトコルに記載されているHT-29細胞溶解に続いて、細胞内細菌は上記のように列挙することができ、侵入した細菌の数を表します。次に、ゲンタマイシン処理なしでプレートから列挙された細菌からこの値を差し引いて、付着細菌と侵入細菌を適切に決定できます。また、浸潤後のHT-29細胞内の赤痢菌の細胞内複製について、例えば、複数の時点を用いて細胞内増殖曲線を解析するなど、より深い洞察を得るために、並行解析を実施することもできる。最後に、18時間のゲンタマイシンインキュベーション後の細胞内細菌の列挙とともに、培養上清を採取し、感染したHT-29細胞のサイトカイン分泌について分析することができます。例えば、IL-8は上皮細胞から分泌されるケモカインであり、主にPMNを感染部位に動員する働きをします。感染したHT-29細胞の培地に分泌されるIL-8の量は、IL-8 ELISAアッセイ67で分析することができる。
胆汁塩は、ヒト消化管系を通過する際の赤痢菌の重要な病原性シグナルであることが証明されており、これらのプロトコルで細菌増殖培地を補い、典型的な消化管状態を再現するために使用できます。当然のことながら、胆汁塩は消化を助けるために十二指腸または小腸の上部に導入されます。そして回腸末端または小腸の末端では、胆汁塩の95%が除去され、胆嚢に最終的に沈着するために循環に戻される68。胆汁塩は通常、小腸で0.2%〜2.0%(w / v)の濃度を持ち、自然に殺菌性があります。しかし、赤痢菌は、ほとんどの腸内細菌とともに胆汁塩に抵抗し、そのシグナルを利用して感染を増強する47。いくつかの研究は、胆汁塩への曝露が、時にはグルコースなどの他の小腸信号と連動して、感染前の赤痢菌の生存と病原性調節にどのように影響するかを文書化しています。赤痢菌は、胆汁塩に抵抗し、遺伝子発現を変化させ、小腸輸送を再現する条件でバイオフィルムを形成して分散させることが示されています17,69。研究は、これらの変化が高毒性の表現型をもたらし、赤痢菌によるその後の結腸感染時に付着と浸潤が誘発されることを実証しました17,18,19,48,66。したがって、上記で概説した条件は、接着、浸潤、または細胞内複製アッセイを実行する前に、小腸通過を模倣するために胆汁塩で赤痢菌を継代培養する方法を文書化しています。指定されたTSB製剤には、典型的なルリアブロス(LB)17と比較してグルコースが添加されています。したがって、LBを用いる場合、小腸17におけるグルコースシグナルを適切に考慮するために、培地にグルコース(0.5%-2.0%[w/v])を補給することも重要である。さらに、前述したように、すべての赤痢菌の継代培養物は洗浄して胆汁塩を除去し、感染分析のために結腸への移行を模倣します。
従来、上記の結果(図1および図2)で強調されているように、感染アッセイは赤痢菌感染における特定の遺伝子の役割を決定するために有用です。しかし、さまざまな変異体の表現型は、細菌培養培地の適切な補給なしには真に評価されない可能性があります。先行研究で実証されているように、胆汁塩は、中枢代謝の遺伝子、転写因子、糖トランスポーター、薬剤耐性、染色体または病原性プラスミドにコードされている病原性遺伝子など、S. flexneri遺伝子の発現を有意に変化させる17。これらの遺伝子は、赤痢菌が胆汁塩をシグナルとして使用して遺伝子発現を変化させ、結腸の最終的な感染に備える方法に関する洞察を提供し、したがって、アドヒアランス、浸潤、および細胞内複製アッセイにおける病原性への影響を調べる前に、適切な補充された細菌増殖培地でその後の突然変異分析を実施する必要があります。上記の図1および図2に見られるように、ΔVF変異はアドヒアランスには影響しなかったが、浸潤および細胞内複製には影響を与えた。この変異により細胞内浸潤と細胞内複製が促進されるため、現在、遺伝子産物がどのように感染を制御しているかを明らかにする実験が進行中です。変異体解析は、赤痢菌の病因に関する新しい理解を、特にヒト消化管をよりよく再現する条件で研究する方法の一例として役立ちます。さまざまな変異体の表現型を検証するために、適切な相補分析が推奨されます。
組み合わせて、これらの手順は、感染中のヒト消化管の自然環境を最もよく模倣することにより、赤 痢菌 の付着、HT-29結腸上皮細胞への浸潤、および複製の分子メカニズムに関する重要な洞察を提供する定量的実験を記述します。今後の研究では、 赤痢菌 がヒト宿主に対してどのように準備し、効果的に感染するかについての理解を深めるために、変異体と実験条件を拡張することができます。何十年にもわたる研究にもかかわらず、 赤痢菌 感染症についてはまだまだ多くの発見があります。

腸内細菌性病原体によって引き起こされる下痢性疾患は、世界的な健康上の重大な負担です。2016年、下痢性疾患は世界で130万人の死亡の原因となり、5歳未満の子供の死因の第4位でした1,2。グラム陰性腸内細菌性病原体である赤痢菌は、世界中で下痢による死亡の主な原因である赤痢症の原因物質です3。赤痢症は、低・中所得国の子どもに毎年重大な罹患率と死亡率を引き起こし4,5、高所得国での感染は、保育所、食品媒介、水媒介の発生に関連しています6,7,8,9。効果のないワクチン開発10と薬剤耐性(AMR)11,12の上昇により、大規模な赤痢菌の集団発生の管理が複雑になっています。米国疾病管理予防センター(CDC)の最近のデータによると、2020年には米国における赤痢菌感染症の約46%が薬剤耐性を示しており13,14、世界保健機関(WHO)は赤痢菌をAMRの優先病原体として宣言しており、新しい治療法が緊急に必要とされています15。
赤痢菌感染症は、汚染された食品や水を摂取すると、糞便-経口経路を介して、または直接の人間との接触を介して容易に伝染します。赤痢菌は、効率的なヒト適応病原体に進化し、10〜100個の細菌の感染量で病気を引き起こすのに十分です16。小腸の通過中、赤痢菌は高温や胆汁などの環境信号にさらされます17。これらのシグナルを検出すると、転写変化が誘発され、細菌がヒト結腸に感染する能力を高める病原性因子が発現します17,18,19。赤痢菌は頂端表面から結腸上皮に侵入するのではなく、卵胞関連上皮内の特殊な抗原提示微小蕾細胞(M細胞)への取り込みに続いて上皮層を横切って通過します20,21,22。トランスサイトーシス後、赤痢菌細胞は常在マクロファージによって貪食されます。赤痢菌は急速にファゴソームから脱出し、マクロファージ細胞死を引き起こし、炎症誘発性サイトカインを放出します5,23,24。次に、赤痢菌は基底側から結腸上皮細胞に侵入し、マクロピノサイト液胞を溶解し、細胞質に複製ニッチを確立します5,25。炎症誘発性サイトカイン、特にインターロイキン-8(IL-8)は、多形核好中球白血球(PMN)を感染部位に動員し、上皮のタイトジャンクションを弱め、上皮内膜への細菌浸潤を可能にして基底側感染を悪化させます5。PMNは感染を封じ込めるために感染した上皮内膜を破壊し、その結果、細菌性(血性)赤痢の特徴的な症状が現れる5。浸潤と細胞内複製のメカニズムは徹底的に特徴付けられていますが、新しい研究は、消化管(GI)通過中の病原性調節17、アドヒアランス19、バリア透過性による基底側アクセスの改善26、栄養失調の小児における無症候性輸送27など、赤痢菌感染における重要な新しい概念を実証しています。
赤痢菌が下痢性疾患を引き起こす能力は、ヒトおよびヒト以外の霊長類(NHP)に限定されています28。赤痢菌の腸管感染モデルは、ゼブラフィッシュ29、マウス30、モルモット31、ウサギ21、32、33、ブタ34、35について開発されています。しかし、これらのモデルシステムのどれも、ヒト感染中に観察された疾患特性を正確に再現することはできない36。赤痢症のNHPモデルは赤痢菌の病因を研究するために確立されていますが、これらのモデルシステムは実装に費用がかかり、人為的に高い感染線量を必要とし、ヒトの感染線量よりも最大9桁高い37、38、39、40、41、42。したがって、ヒト宿主の感染に対する赤痢菌の顕著な適応は、赤痢菌の病因を正確に調べるための生理学的に適切なモデルを再現するために、ヒト由来の細胞培養の使用を必要とします。
ここでは、HT-29結腸上皮細胞への 赤痢菌 の付着、浸潤、および複製の速度を測定するための詳細な手順について説明します。これらの標準化されたプロトコルを使用して、細菌の病原性遺伝子と環境シグナルが 赤痢菌 感染の各ステップに影響を与える分子メカニズムを調べて、動的な宿主と病原体の相互作用関係をよりよく理解することができます。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;m PESフィルター</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SCGP00525</td><td>最大50mLの培地を滅菌するための滅菌済みポリエーテルスルホンフィルター</td></tr><tr><td>14mL培養チューブ</td><td>コーニング</td><td>352059</td><td>17 mm x 100 mmポリプロピレン製試験管(キャップ付き</td></tr>) <tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>430829</td><td>50 mL透明ポリプロピレン円錐底遠心分離チューブ(漏れ防止キャップ付き</td></tr>) <tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>コーニング</td><td>3516</td><td>プレートは最適な細胞付着のために処理されます</td></tr><tr><td>胆汁塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>1:1の比率 コレートとデオキシコール酸</td></tr><tr><td>コンゴレッド染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>ベンジジンベースのアニオン性ジアゾ色素、>85%</td></tr><tr><td>純度 Countess細胞計数チャンバースライド</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Countess Automated Cell Counter</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td><td>と併用しますSigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>A 高極性有機試薬</td></tr><tr><td>Dulbecco'Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEMには、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、GlutaMAX、フェノールレッド</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td>が添加されています<td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>熱不活性化、滅菌ゲン</td></tr><tr><td>タマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>ストック濃度は50 mg/mL</td></tr><tr><td>HT-29細胞株</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>腺癌細胞株;起源</td></tr><tr><td>パラフィンフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>ラボ用シーリングフィルム</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm 固形媒体用シャーレ</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010049</td><td>1x 濃度; pH 7.4</td></tr><tr><td>寒天を選択</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>赤海藻の細胞壁から抽出された多糖類の混合物で細菌のめっき培地を作る</td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430641U</td><td>組織培養フラスコ</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T8787</td><td>一般的な非イオン性界面活性剤と乳化剤&nbsp;</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>死んだ組織培養細胞を検出する色素; 生細胞のみが色素を除外できます</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>細胞株の維持管理と継代のための細胞解離用試薬</td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス (TSB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>細菌増殖培地</td></tr></tbody></table>

赤痢菌による上皮細胞感染解析

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

ヒトに適応した腸内細菌性病原体である赤痢菌は、毎年何百万人もの感染症を引き起こし、小児患者に長期的な増殖効果をもたらし、世界中で下痢による死亡の主な原因となっています。感染は、病原体が消化管を通過し、結腸を覆う上皮細胞に感染する結果として、水様または血性の下痢を誘発します。抗生物質耐性菌の驚異的な増加と承認されたワクチンの不足により、この手ごわい病原体を研究するには、標準化された研究プロトコルが不可欠です。ここでは、結腸上皮細胞における細菌の付着、浸潤、および細胞内複製のin vitro分析を使用して、赤痢菌の分子病因を調べるための方法論を紹介します。感染分析に先立ち、赤痢菌コロニーの病原性表現型は、寒天プレート上のコンゴ赤色色素の取り込みによって検証されました。また、バクテリア培養中にin vivo条件を模倣するために、サプリメントを添加した実験用培地を検討することもできます。次に、細菌細胞を標準化されたプロトコルで使用し、感染の各段階を分析するための適応を伴う感染の確立された多様性で、組織培養プレート内の結腸上皮細胞に感染します。アドヒアランスアッセイでは、赤痢菌細胞を培地レベルを下げてインキュベートし、細菌と上皮細胞との接触を促進します。浸潤アッセイと細胞内複製アッセイの両方で、ゲンタマイシンをさまざまな時間間隔で適用して細胞外細菌を排除し、浸潤の評価および/または細胞内複製速度の定量化を可能にします。すべての感染プロトコルは、感染した上皮細胞溶解物を段階的に希釈し、コンゴ赤寒天プレート上の感染力価と比較して細菌コロニー形成単位をめっきすることにより、付着細菌、侵入細菌、および/または細胞内細菌を列挙します。これらのプロトコルを組み合わせることで、上皮細胞の赤痢菌感染の各段階について、独立した特性評価と比較が可能になり、この病原体の研究に成功します。

S. flexneri 2457T野生型(WT)と、赤痢菌の病原性を負に制御すると仮定された変異体であるS. flexneri ΔVF(ΔVF)を比較して、アドヒアランス、浸潤、および細胞内複製アッセイを実施しました。赤痢菌は胆汁塩を病原性調節のシグナルとして使用するため17,18,47、実験は、TSB培地での細菌継代培養後、および0.4%(w / v)胆汁塩を添加したTSBの後に行われました18。継代培養段階での胆汁塩曝露は、結腸感染前の小腸通過を複製するための前処理として機能します17,18,47。図1は、S. flexneriがHT-29結腸上皮細胞に接着する能力に対するΔVF変異の影響を分析したものです。付着率はy軸にプロットされ、投入細菌数に対するHT-29溶解後に標準化された回収細菌の比率を表します。予想通り、S. flexneri WT株とΔVF株はどちらも、胆汁塩を添加していないTSBと比較して、胆汁塩を添加して継代培養した場合、アドヒアランスが有意に増加しました18。しかし、HT-29細胞への接着性は、各継代培養条件において、WT変異株とΔVF変異株の間で差はありませんでした。これらのデータは、ΔVF変異は、胆汁塩の前処理の有無にかかわらず、S.flexneriがHT-29上皮細胞に接着する能力に影響を与えないことを示しています。
図2では、胆汁塩の前処理の有無にかかわらず、HT-29結腸上皮細胞の内部に侵入し(図2A)および複製(図2B)するS.flexneriの能力に対するΔVF変異の影響が分析されました。回収率はY軸にプロットされ、投入細菌の数に対するHT-29細胞溶解後に回収された細菌細胞の比率を標準化して表しています。図2Aでは、胆汁塩への事前曝露後にHT-29細胞に侵入するWT S. flexneri 2457Tの能力の有意な増加が予想されたが48、S. flexneri ΔVF変異体はWT株と比較して、胆汁塩曝露後の浸潤の増加が小さかった。ΔVF変異体は、TSBで継代培養したWTと比較してHT-29細胞の浸潤率が高かったが、胆汁塩を添加したTSBで継代培養した場合の浸潤率はWTと同程度であった(図2A)。これらの結果は、ΔVF変異がS. flexneriのHT-29細胞への侵入能力を増強し、胆汁塩継代培養後にΔVF変異体の浸潤能力がさらに増加したにもかかわらず、曝露前の胆汁塩の影響を減少させることを示唆している。
全体として、90分間のインキュベーション(図2A)と比較して、一晩のインキュベーション後に10倍多くの細菌が回収され(図2B)、細胞内増殖のモニタリングと浸潤のモニタリングにそれぞれ違いがあることが示されています。感染したHT-29細胞を18時間インキュベートして細菌の細胞内複製を可能にすると(図2B)、WT株と ΔVF 株の両方で胆汁塩の前処理の影響が減少しました。しかし、細胞内複製中の胆汁塩前処理の効果の低下は、 ΔVF 変異体の方が劇的でした。胆汁塩に事前曝露した場合の両菌株の細胞内複製の増加は、同じ条件での侵入率の増加よりも小さかったため、胆汁塩は S.flexneri の病因の初期段階に大きな影響を与えるという仮説を立てています。 ΔVF 変異体は、両方の継代培養条件後、WT(図2B)と比較して、HT-29細胞内で一晩複製した際の回収率の増加を示しました。しかしながら、 ΔVF 変異体の回収率は、曝露前の胆汁塩に関係なく類似していた。これらのデータ傾向は、 ΔVF 変異体がWTと比較してHT-29細胞内でより効率的に複製し、WTで観察されたように、胆汁塩の曝露前の ΔVF 変異体の細胞内複製能力に影響を与えないことを示唆しています(図2B)。胆汁塩の曝露前条件における変異株とWT株の違いは、90分間の浸潤アッセイ中に観察されなかったため、欠失した VF 遺伝子によってコードされた生成物は、HT-29細胞内の S.flexneri 複製も制御している可能性があるという仮説を立てています。両方の解析を組み合わせると、 ΔVF 変異体はWTに比べて毒性が高いことが示され、 VF 遺伝子産物が S. flexneri 病原性の負の調節因子であることを示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> 図1:曝露前の胆汁塩は、 S. flexneri のHT-29細胞への付着を誘導しました。 S. flexneri 2457T WTおよび ΔVF 変異細胞を、0.4%(w/v)胆汁塩(TSB+BS)培地を添加したTSBまたはTSBで継代培養しました。次に、細菌をHT-29細胞に感染多重度(MOI)100で適用し、3時間インキュベートして接着性を調べました。インキュベーション後、感染したHT-29細胞を洗浄して溶解し、回収した細菌の段階希釈液を播種して、コロニー形成単位/mL(CFU/mL)を列挙しました。付着菌の数は、入力細菌力価に対してプロットされ、付着率を確立します。データは、1 つの生物学的複製と 3 つのテクニカル複製(個々のドット)を表しています。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示します。統計的有意性は、スチューデントのt検定(*p &lt; 0.05; ***p &lt; 0.001)によって決定されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> 図2:曝露前の胆汁塩は、WT S. flexneri の浸潤と細胞内複製を増加させた。 S. flexneri 2457T WTおよび ΔVF 変異細胞を、胆汁塩(TSB+BS)培地を添加したTSBまたはTSBのいずれかで継代培養した。次に、バクテリアをMOI100でHT-29細胞に適用し、細胞に遠心分離し、37°Cで5%CO2 で45分間インキュベートしました。細胞をPBSで洗浄し、DMEMにゲンタマイシンを添加して細胞外細菌を溶解し、細胞内細菌のみを回収しました。90分(A、細菌の浸潤)または18時間(B、細胞内複製)のインキュベーション後、感染したHT-29細胞を洗浄して溶解し、回収した細菌の段階希釈液を播種して、mLあたりのコロニー形成単位(CFU/mL)を列挙しました。細胞内細菌の数は、入力された細菌力価に対してプロットされ、回収率を確立します。データは 1 つの生物学的複製を表しており、それぞれに 3 つのテクニカル複製 (個々のドット) があります。エラーバーはSEMを示します。 統計的有意性は、スチューデントのt検定(*p &lt; 0.05)によって決定されました。パネル(A)と(B)のy軸スケールの違いに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

現在のプロトコルはin vitroの上皮細胞ラインを使用して赤痢菌の付着、侵入および細胞内複製を調査する伝染の試金を記述する。

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

赤痢菌は、毎年壊滅的な感染率を引き起こす重要な世界的病原体です。赤痢菌は消化管に感染し、下痢や赤痢を引き起こします。私たちの研究は、ワクチンやその他の抗菌薬など、より効果的な治療法の開発に役立てるために、感染症の理解を深めることを目的としています。第一に、動物モデルと新しい組織培養技術により、赤痢菌感染の生理学をよりよく理解し、ヒト消化管の複雑さを忠実に再現することができます。第二に、臨床赤痢菌分離株の特性評価は、この属の多様性を捉え、重要な病原性遺伝子を特定し、感染の理解を深めるのに役立ちました。私たちは、胆汁塩やグルコースなどの消化管シグナルを用いて、赤痢菌が小腸での通過を生き延び、大腸での感染のために病原性遺伝子の発現を調節する仕組みを解明しました。私たちは、赤痢菌が胆汁塩に抵抗する仕組みを実証し、赤痢菌が接着タンパク質を産生して上皮細胞との接触を開始して感染を開始することを示しました。これらのプロトコルは、赤痢菌の付着、浸潤、細胞内生存など、上皮感染の重要な側面を調べるように設計されています。これらのプロトコルは、標準的な上皮細胞株を用いて実施していますが、現在利用可能な高度なヒト消化管モデルにも手法を適応させています。これらのプロトコルは、感染の各段階を個別に考慮しており、赤痢菌感染の重要なステップを理解するために重要です。また、複合解析により、赤痢菌感染の全体像レベルでの理解が深まることも強調されている。

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Vonaesch, P. ら、 哺乳類細胞の細菌挑戦後のストレス顆粒形成の免疫蛍光解析。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオは、病原性細菌シ ゲラ・フレクスネリ...

がん性上皮細胞の シゲラ 感染による応力顆粒の形成

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

このビデオは、ヒト上皮細胞の赤痢菌感染時に局所的および全体的なカルシウムイオン応答を検出する技術を示しています。赤痢菌は宿主細胞に侵入し、浸潤エフェクターを放出し、細胞内のカルシウムレベルに影響を与えます。局所的および全体的な細胞質カルシウムの振幅と周波数は、蛍光インジケーターを使用して研究されます。...

細菌感染細胞のカルシウム応答を研究するイメージング技術

我々は内膜破裂を追跡するための方法を説明することは細胞内細菌によって誘発...

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

病原体の普及に対抗するために、宿主細胞には、細菌を区分し、オートファジーを誘導するそれらの細胞骨格を再編成する。組織培養細胞のシゲラ感染を使用して、このプロセスの基礎となるホストおよび病原決定因子が同定され、特徴付けられる。 シゲラ感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、発見された分子およびメカニズムの役割は、in vivoで調べた。...

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

ここでは、赤痢菌に感染した HeLa 細胞によるカルシウム (Ca2 +) 応答を可視化するためのプロトコルを提案する.細菌感染のパラメーターを最適化して Ca2 +蛍光プローブとイメージングにより、非定型グローバルおよびローカル Ca2...

上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca2 +応答をイメージング

パイエル板を覆う特殊な濾胞関連上皮におけるM細胞は腸管関連リンパ系組織における粘膜免疫監視に重要な役割を果たす。ここでは、M細胞による細菌のトランスサイトーシスのために評価方法を説明...

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している...

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

我々は、フローサイトメトリーのネガティブ選択による一次マウスII型肺胞上皮細胞（AECII）の迅速な単離を記述している。これらAECIIは高い生存率と純度を示し、そのような自己免疫疾患や感染症などの呼吸器疾患におけるそれらの役割に関する機能と分子生物学的研究の広い範囲のために適しています。...

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

赤痢アメーバによるヒト感染はアメーバ、熱帯の国では下痢の主な原因につながる。感染は、細胞 - 細胞接触の開口部と、その結果、下痢、時には肝臓感染症が続くを刺激、腸上皮細胞による病原体の相互作用によって開始される。この記事では、アメーバ症の病因の理解を向上させるために初期の宿主 - 病原体相互作用を評価するためのモデルを提供します。...

プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

学ぶ上皮細胞感染アッセイを用いたShigellaの接着・侵入・細胞内増殖メカニズム。胆酸やグルコースなどの消化管信号が病原性遺伝子発現に与える影響を解明し、新規治療薬やワクチン開発に貢献する知見を提供する。

赤痢菌による上皮細胞感染解析

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