Name: 術後イレウスマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 26 s
Description: 学ぶ術後イレウスマウスモデルの作成法。腸管操作により一貫性のある術後イレウスモデルを確立し、腸管免疫と病態生理を解明し、新規抗炎症治療法の評価に活用する方法を解説します。

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<meta charset="utf8"></head><body>腸管操作による術後イレウス研究のためのマウスモデル

<ol><li>Chapman, S. J., Pericleous, A., Downey, C., Jayne, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+following+major+colorectal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus following major colorectal surgery.</a> Br J Surg. 105 (7), 797-810 (2018).</li>
<li>Farro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR2-dependent+monocyte-derived+macrophages+resolve+inflammation+and+restore+gut+motility+in+postoperative+ileus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCR2-dependent monocyte-derived macrophages resolve inflammation and restore gut motility in postoperative ileus.</a> Gut. 66 (12), 2098-2109 (2017).</li>
<li>Wouters, M. M., Vicario, M., Santos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+functional+GI+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in functional GI disorders.</a> Gut. 65 (1), 155-168 (2016).</li>
<li>Engel, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+memory+cells+disseminate+postoperative+ileus+over+the+entire+intestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract.</a> Nat Med. 16 (12), 1407-1413 (2010).</li>
<li>Schwartz, C., Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+murine+basophils+by+flow+cytometry+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of murine basophils by flow cytometry and histology.</a> Methods Mol Biol. 2163, 367-375 (2020).</li>
<li>Funk, E. K., Weissbrod, P., Horgan, S., Orosco, R. K., Califano, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+experience+with+a+novel+single-port+platform+for+transoral+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Endosc%22%5BJournal%5D)">Preclinical experience with a novel single-port platform for transoral surgery.</a> Surg Endosc. 35 (8), 4857-4864 (2021).</li>
<li>Nemoto, S., Mailloux, A. W., Kroeger, J., Mulé, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-031%3A+Immunologic+checkpoint+expression+on+murine+effector+and+memory+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-031: Immunologic checkpoint expression on murine effector and memory T-cell subsets.</a> Cytometry A. 89 (5), 427-429 (2016).</li>
<li>Brandi, J., Wiethe, C., Riehn, M., Jacobs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-93%3A+A+41-color+high+parameter+panel+to+characterize+various+co-inhibitory+molecules+and+their+ligands+in+the+lymphoid+and+myeloid+compartment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice.</a> Cytometry A. 103 (8), 624-630 (2023).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+composition+of+the+mucosal+flora+in+patients+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>van Bree, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+studying+postoperative+ileus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Physiol+Pathophysiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel method for studying postoperative ileus in mice.</a> Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 4 (4), 219-227 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗マウス I-A/I-E (MHC-II)</td><td>バイオレジェンド</td><td>107614</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗マウス TCRb</td><td>バイオレジェンド</td><td>109212</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 抗マウス CD4</td><td>バイオレジェンド</td><td>100414</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 抗マウス Ly6G</td><td>バイオレジェンド</td><td>127624</td><td></td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット 421 抗マウス CD69</td><td>バイオレジェンド</td><td>104545</td><td></td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット 421 抗マウス F4/80</td><td>バイオレジェンド</td><td>123132</td><td></td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット 785 抗マウス/ヒト CD44</td><td>バイオレジェンド</td><td>103041</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 抗マウス CD8a</td><td>BD</td><td>563786</td><td></td></tr><tr><td>BUV737 抗マウス CD3e</td><td>BD</td><td>612771</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>培養顕微鏡</td><td>CKX53</td> オ<td>リンパス</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ I 牛膵臓由来 (DNase I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-5G</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗マウス CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>147709</tr><tr><td>FITC-デキストラン (70 kWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70-100MG</td><td>Gastrointestinal Transit Assay</td></tr><tr><td>HE staining kit</td><td>solarbio</td><td>G1120</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse PD-1</td><td>Biolegend</td><td>114118</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE (Pharmacia)</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Symphony A5 Flow cytometer</td> <td>BD-Immune</td> <td>cell detection and sorting</td><td></td></tr> <tr><td>トリブロモエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Varioskan LUX</td><td>Thermo</td><td>N16699</td><td>マルチモードマイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability kit</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>Fluorescent生存率染料&nbsp;</td></tr></tbody></table>

術後イレウスマウスモデル

Postoperative Ileus Murine Model

このプロトコルでは、POI は腸操作 (IM) によって外科的に誘発されましたが、これは臨床手術の効果に似ています。偽のグループでは、IMなしで切開が行われました。POIマウスは、偽対照マウスとともにPOI手術の24時間後に犠牲にされました。消化管の重要な機能である内容物輸送機能は、FITC-デキストランの強制によって検出されました。POIモデルは、FITC強度が小腸の近位部分で増加したため、成功したと見なされました(図2B)。平均GCは、IMのトランジット機能障害を定量化し、操作の一貫性を示すために計算されました(図2C)。
HE染色は、消化管のさまざまなセグメントの形態を示しました(図3)。十二指腸と回腸の粘膜下層と平滑筋層は、POI導入の24時間後に腫れました(図3A、B)。偽マウスのそれらと比較して、十二指腸のHE染色は、POIマウスの免疫細胞浸潤の増加を明らかにしました(図3A)。
マルチカラーフローサイトメトリー解析は、免疫細胞の割合、状態、および機能を解析するための中心的な方法です。腸組織をコラゲナーゼとデオキシリボヌクレアーゼで消化し、フローサイトメトリーのために単一細胞懸濁液に分離しました。ゲーティング戦略を使用して、LPL中のCD3 T細胞および関連する亜集団の割合を決定しました(図4A)。POIマウスでは、活性化および接着マーカーCD69、およびCD4 T細胞、CD8 T細胞、およびgd T細胞の発現がアップレギュレーションされています(図4B)7。同様に、CD44+ PD-1+(活性化、末端分化、および消耗マーカー)亜集団の割合は、増加傾向を示した(図4C)7。リンパ球に加えて、骨髄細胞サブセット(好中球、樹状細胞、およびマクロファージ)の割合もIM手術後に増加します(図4D)8。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2.jpg"> 
図1:術後イレウスのマウスモデル(A)術後イレウスのマウスモデルの模式図。(B)麻酔および髭剃り後のマウスの固定。(C)切開部を露出させ、医療用滅菌ガーゼで覆いました。(D)腸管を腹部切開部から腹腔外に絞り出し、滅菌ガーゼに装着して露出させた。(E)小腸全体を湿らせた滅菌綿棒にさらしました。(F)筋肉層を外科的縫合糸で閉じた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig02v2.jpg"> 
図2:消化管機能評価のための消化管トランジットアッセイ。 手術後22.5時間で、偽マウスまたはPOIマウスをFITC-デキストラン溶液で強制経口投与し、90分後に犠牲にしました。(A)消化管は15のセグメントに分割され、生理学的位置に従って番号が付けられました。(B)偽マウスとPOIマウスの消化管からのすべてのセグメントのFITC強度。(C)投与されたFITC-デキストランの幾何学的中心が計算され、バイオリンプロットとして示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig03.jpg"> 
図3:POIマウスの小腸の代表的なHE染色。 偽マウスおよびPOIマウスの(A)十二指腸および(B)回腸の断面のHE染色。スケールバー:100 μmまたは25 μm(インセットの拡大画像)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig04.jpg"> 
図4:POIマウス由来の小腸免疫細胞の代表的なフローサイトメトリー解析。 (A)手術後24時間後のPOIマウスの小腸組織由来のT細胞集団に対するフローサイトメトリーゲーティング戦略。(B)偽マウスおよびPOIマウスの小腸由来のCD4 T細胞、CD8 T細胞、およびgd T細胞におけるT細胞活性マーカーCD69+の割合。(C)偽マウスおよびPOIマウスの小腸におけるCD4 T細胞、CD8 T細胞、およびgd T細胞におけるCD44+ PD-1+活性マーカーの割合。(D)偽マウスとPOIマウスの小腸からのCD45+アクアライブ免疫細胞のうち、好中球(Ly6G + CD11b +)、樹状細胞(CD11c + MHC-II+)、およびマクロファージ(CD11b + F4 / 80 +)の割合。各パネルの数字は、それぞれのセルタイプの割合を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

術後イレウス（POI）が増加し、罹患率および長期の入院期間につながる腹部手術の合併症である。予防的または治療的戦略が激化研究を欠いているので必要です。そこで我々は、POIの病態生理を調査し、潜在的な治療の選択肢を研究するために標準化され、実行可能なマウスモデルを確立した。...

げっ歯類における腸運動と腸壁の炎症の機能評価：腸管操作の標準化されたモデルで分析

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術後イレウスマウスモデル

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