Name: 微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶ 連続2光子トモグラフィーを用いたSalmonellaの全臓器三次元検出法。マウス脾臓における抗菌薬治療中の細菌持続性と免疫細胞との空間的関係を解析し、抗生物質耐性感染症治療戦略の開発に貢献する。

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この研究は、スイス国立科学財団 310030_156818、310030_182315、および NCCR_ 180541 AntiResist (DB へ) の支援を受けました。

Fluorescent Reporter 定量による全臓器病原体追跡(英語)

<ol><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+understanding+the+infectious+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The importance of understanding the infectious microenvironment.</a> Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).</li>
<li>Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+infection+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of infection revisited.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).</li>
<li>Bumann, D., Cunrath, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Salmonella-host+interactions+in+infected+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues.</a> Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).</li>
<li>Hofmann, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+-+putting+immune+cells+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context.</a> J Cell Sci. 134 (15), jcs258494(2021).</li>
<li>Blain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tridimensional+atlas+of+the+developing+human+head%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tridimensional atlas of the developing human head.</a> Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+maps+reveal+stereotyped+cell-type-based+cortical+architecture+and+subcortical+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism.</a> Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).</li>
<li>Matho, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+glutamatergic+neuron+system+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex.</a> Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).</li>
<li>Muñoz-Castañeda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+anatomy+of+the+mouse+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compartmentalization+enables+Salmonella+persistence+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118(2021).</li>
<li>Dogga, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aspartyl+protease+5+in+the+establishment+of+the+intracellular+niche+during+acute+and+chronic+infection+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).</li>
<li>Claudi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Salmonella+in+host+tissues+delays+eradication+by+antimicrobial+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy.</a> Cell. 158 (4), 722-733 (2014).</li>
<li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein%3A+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6, 13(2008).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Burton, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+impact+of+oxidative+host+defenses+determines+the+fate+of+Salmonella+during+systemic+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host%26Microbe%22%5BJournal%5D)">Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice.</a> Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+connections+of+the+main+and+the+accessory+olfactory+bulb+formations+in+the+rat%3A+an+experimental+HRP-study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study.</a> J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Wendland, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+GFP+levels+for+analyzing+Salmonella+gene+expression+during+an+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection.</a> FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).</li>
<li>Barat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+Salmonella+depends+on+surface-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002966(2012).</li>
<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
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著者は何も開示していません。

細菌性病原体の局所組織状況は、局所的な宿主攻撃、細菌の適応、宿主病原体との相互作用と抗菌化学療法の局所的な結果、および全体的な疾患結果に対する個々の寄与を決定するために重要です。マイクロメートルサイズの細菌をセンチメートルサイズの臓器にイメージングすることは困難でした。シリアル 2 光子 (STP) トモグラフィーは、臓器全体の個々の細菌細胞を検出するのに十分な空間分解能、自動化された切片化とイメージング、および十分なスループット (1 日あたり ~1 臓器) を提供します11。宿主抗原は in vivoで染色できますが、病原体細胞は、細胞内病原体細胞を包括的に検出するために、適切な蛍光タンパク質を発現する必要があります。結果として得られるデータセット(臓器あたり0.5〜1.5テラバイト)は、データ分析と保存のためのITインフラストラクチャに大きな課題をもたらします。
この方法には、いくつかの重要な手順があります。まず、蛍光タンパク質GFPまたはYFPの検出可能で均質な発現を持つ病原体株が必要です。理想的には、染色体発現カセット25 を使用して、プラスミドのコピー数変動による蛍光の不均一性を最小化します。十分な蛍光強度が必要であるが、病原体の適応度障害を避けるために、過剰なレベルの蛍光タンパク質を避けるべきである23。適切な発現レベルは、適切なプロモーターの選択およびリボソーム結合部位25 または全体の5'非翻訳領域(UTR)26の微調整によって得ることができる。第二に、灌流固定には、血液循環からできるだけ多くの赤血球を除去するためのバッファーによる最初の洗浄を含める必要があります。これは、脾臓と肝臓にとって特に重要です(ただし、これらの臓器から赤血球を完全に除去することは困難です)。残りの赤血球は、スペクトルの可視部分で光を吸収し、イメージング品質を損なう27。第三に、凍結保護剤に固定組織を保存することは、炎症組織で特に高く、病原体細胞の比較的弱い蛍光を覆い隠す可能性のある組織の自家蛍光を減らすために重要である11。第四に、組織と周囲のアガロースブロックへの効果的な架橋は、組織がアガロースブロックから飛び出すことなくスムーズなビブラトーム切断を行うために重要です。第五に、蛍光シグナルおよびそれらが病原体細胞として同定されることは、病原体成分に対する抗体(グラム陰性菌のリポ多糖類など)による染色や、断層撮影装置11から取り出した切片の共焦点顕微鏡法などの直交的アプローチを用いて、独立して検証されなければならない。感染組織の中には、形状が似ていて蛍光スペクトルが重なり合う自己蛍光粒子が含まれているものもあり、病原体細胞と誤解されやすいことがあります。第六に、マイクロコロニー内の病原体細胞の量を共焦点顕微鏡法などの直交的アプローチと比較して、精度を評価する必要があります。これらの計算に基づく全体的な細菌負荷は、フローサイトメトリーやプレーティングなどの直交的なアプローチと比較することで検証する必要があります。
広く使用されているSTPプロトコルの重要な変更には、光電子増倍管211の前に510/20 nmの狭帯域パスフィルターを配置することが含まれ、感染して炎症を起こした肝臓、脾臓、およびパイエルパッチで特に強い緑黄色の自家蛍光の干渉を減らすためである。このような臓器は、脳(STPの他の用途が主流)と比較して、自家蛍光が強く、光散乱が増加するため、照明の不均一に対するより効果的な補正の必要性も生じています。別の変更として、このプロトコルは、この目的のためにCIDREアプローチ22 (図3)とAIベースの細菌のセグメンテーションを採用しています。最後に、組織の前処理は、-20°Cの凍結保護剤にインキュベーションステップを含めることによって変更され、これにより組織の自家蛍光が減少し、したがって比較的弱い蛍光を有する小さな病原体細胞の検出が容易になった11。
病原体シグナルを検出できない場合、またはセグメンテーションによって感度が不十分(見逃される病原体細胞が多すぎる)または精度が不十分(病原体細胞としてセグメント化されるバックグラウンド粒子が多すぎる)場合は、トラブルシューティングが必要になることがあります。バックグラウンド組織の自家蛍光が検出可能であるにもかかわらず、病原体のシグナルが少なすぎる場合、病原体に含まれる蛍光タンパク質の量が不十分である可能性があります。これは、同じ感染組織からの組織切片の共焦点顕微鏡法または組織ホモジネートのフローサイトメトリーを用いて試験することができる19,28。根本的な理由は、発現レベルが不十分であるか、発現カセットが不安定であることである可能性があります。緩和戦略には、発現を促進するための代替プロモーター、病原体種の蛍光タンパク質をコードする遺伝子のコドン適応、コピー数の多いエピソームコンストラクトの採用、または染色体統合またはバランス致死相補による発現カセットの安定化が含まれる可能性がある29。蛍光タンパク質の選択も重要ですが、GFP.mut2、mWasabi、YPet、TIMERbacで検出が可能です。セグメンテーションが不正確な場合、これは、上記のように対処できる病原体の蛍光が弱すぎるか、組織の自家蛍光バックグラウンドが高すぎることが原因である可能性があります。アガロースブロックおよびトモグラフィーに包埋する直前に、洗浄液を広範囲に灌流するか、保存バッファーで長時間インキュベートすることで、これらの問題を解決できる可能性があります。最後に、正確な分類にはニューラルネットワークの十分なトレーニングが必要ですが、過度のトレーニングは、新しいサンプルのパフォーマンスを損なう過剰適合につながる可能性があります。
現在、個々の細菌を検出するために、臓器全体を3Dで十分な空間分解能で画像化できる方法は他にありません。組織透明化とライトシート顕微鏡法の将来の改善により、同様の解像度が得られる可能性があります。これにより、より高速で、より多くの蛍光チャンネルでのイメージングが可能になるかもしれません。
STPの重要な制限は、面内ピクセル解像度が~0.5 μm、垂直解像度が5〜10 μmであることであり、密集したマイクロコロニー内など、密集した細菌の分離には不十分です。しかし、トモグラフィー後に組織切片を回収し、選択した組織部分の二次高解像度共焦点顕微鏡法を行うことが可能です。STPのもう一つの制限は、蛍光チャネルが3つしかないため、同時にイメージングできる蛍光色素の数が制限されていることです。ここでも、マルチプレックス法で取得した組織切片を二次解析することで、選択した組織部分のさらに多くのマーカーの位置と強度を明らかにすることができます。この情報は、STPで決定されるように、周囲の組織の全体的な3D構造に統合できます。
結論として、このプロトコルは、局所および全臓器レベルでの宿主と病原体の相互作用の詳細な調査を可能にします。このプロトコルは、他の病原体(蛍光株として入手できる場合)、他の臓器、および異なる宿主種に容易に適応できる必要があります。

感染は、複雑な解剖学的構造と区画化された生理機能を持つ組織で発生します。感染組織に共存する多様な微小環境は、局所的な病原体サブセットの運命と、それらが全体的な疾患転帰に寄与することを決定することができる1,2,3。しかし、cmサイズの組織における微生物病原体の包括的な3Dマッピングは依然として困難です4。脳やその他の臓器のイメージングは、実験戦略5を絶えず改善している非常に活発な研究分野ですが、多くの方法では、μmサイズの細菌性病原体を自信を持って特定するために必要なサブμmの分解能が依然として不足しています。対照的に、シリアル2光子(STP)トモグラフィー6は、サブμmの面内分解能で組織全体の自動マルチカラー変形フリーイメージングを可能にし、完全な体積データセットを生成します。この方法は、ビブラトームを使用した組織の繰り返しの物理的切片化と、赤外光による出現するブロック面の断続的な2光子イメージングを組み合わせたものです。STPトモグラフィーは、脳内の細い軸索をマッピングして接続マップを確立するために広く使用されています7,8,9,10。
STPトモグラフィーは、トモグラフィーを使用して、感染組織全体の個々の微生物病原体細胞(サルモネラ菌、トキソプラズマ)の3Dマッピングも可能にします11,12。第2高調波生成は、動脈の周りや脾臓の小柱などの線維性バンドにコラーゲン鞘を明らかにし、解剖学的状況を提供します。in vivoで注入した蛍光抗体は、宿主細胞の染色に使用でき、個々の病原体細胞と好中球などの浸潤免疫細胞との間の相互作用を明らかにすることができます。ここでは、組織の処理、イメージング、照明補正によるイメージングタイルのスティッチング、3次元での画像の積層、機械学習ツールを使用したセグメンテーションを含むパイプラインについて説明します。このパイプラインは、個々の病原体、細胞、およびマイクロコロニーの宿主コンテキスト内の3D位置を生成します。マイクロコロニー内の個々の細胞の数を数えることは、解像度の限界のために依然として困難ですが、そのような数はマイクロコロニーの統合された明るさに基づいて推定することができます。このパイプラインは、組換えGFPまたはYFP発現病原体が利用可能な場合、他の感染モデルに容易に適応させることができます。

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤 ロックタイト 435</td><td>ヘンケル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>71321-25G</td><td></td></tr><tr><td>水酸化</td>ナトリウム <td>メルク</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>過ヨウ素酸ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>トリス緩衝生理食塩水 (TBS)</td> <td>メルク</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>真空ろ過 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</Blade></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAIレーザー</td><td>スペクトル-物理学</td><td></td><td></td></tr>プラスチック<tr><td>金型を剥がす</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000断層撮影</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体/染料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primary抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, rabbit</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, clone 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>142403抗Ly-6G-PE、クローン1A8</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Secondary 抗体</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-rabbit Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g or later</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b or later</td><td></td></tr><tr><td>オーケストレーター(断層撮影)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可視化ソフト Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0以降</td><td></td></tr></tbody></table>

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

ほとんどの感染症は、複雑な解剖学的構造と局所的に変化する宿主生理機能を持つ三次元の宿主組織内で発生します。この多様な環境内での病原体細胞の位置付けは、病原細胞のストレスレベル、反応、運命、および疾患の全体的な進行と治療の失敗への寄与に大きく影響します。しかし、cmサイズの宿主臓器内にμmサイズの病原体細胞を位置特定することは技術的な困難さのため、この研究分野は比較的未開拓でした。ここでは、この課題を解決する方法を紹介します。私たちは、連続2光子断層撮影法とAI強化画像解析を用いて、感染マウスの脾臓全体、肝葉、リンパ節全体にわたって個々の サルモネラ 細胞を特定します。蛍光レポーターと in vivo 抗体の投与により、単一 サルモネラ 菌細胞の複製速度、特定の免疫細胞との局所的な相互作用、および抗生物質に対する細菌の応答を決定できます。これらの方法論は、3次元組織コンテキスト内での感染症、その予防、および治療の包括的な調査への道を開きます。

記載されている手順により、脾臓、肝臓、腸間膜リンパ節、およびパイエル板11などのマウス臓器全体の個々のサルモネラ細胞の検出が可能になります11(図5および図6)。また、マウスの脳12でトキソプラズマ原虫も検出します。肝臓、パイエル板、脾臓などの一部の感染組織は、緑黄色の範囲でかなりの自家蛍光を発します。自家蛍光は、組織構造を保存するために必要なパラホルムアルデヒドによる固定によってさらに増強されます。この自家蛍光バックグラウンドに対するGFP、mWasabi、およびTIMERbacの緑色成分からの緑色蛍光の検出は、光電子増倍管2(緑色発光を収集する)の前に510/20 nmの狭帯域通過フィルター(ほとんどのGFP発光を透過するが、自家蛍光スペクトルの大部分を遮断する)を置き、固定組織を凍結保護剤11に3日以上保存することにより組織の自家蛍光を減らすことによって改善される.しかし、細菌は依然としてGFPまたは他の蛍光タンパク質の細胞あたり少なくとも数千コピーを発現するはずです。一方、過剰な蛍光タンパク質レベルは、病原性の減衰につながる可能性のあるフィットネスコストを最小限に抑えるために避けるべきである23。
組織中の蛍光細菌の正しいセグメンテーションは、イメージング後に取得した組織切片の免疫組織化学によって確認できます。具体的には、リポ多糖などの細菌表面成分に対する抗体で染色した物体を、STPトモグラフィーで得られた蛍光画像と一致させることができます(図5)。染色されたサルモネラ細胞の中には、蛍光タンパク質を欠くものがあり、共焦点顕微鏡とSTPトモグラフィーの両方で検出可能な蛍光を発することに注意することが重要です。これらの細胞は、フローサイトメトリーによる選別と単一選別細胞からの増殖培養、および寒天プレート上のコロニー形成ユニットの数とフローサイトメトリーによって決定される蛍光サルモネラ細胞の数との間に密接な相関があることで示されるように、宿主免疫系によって死滅されたサルモネラ菌です24.さらに、プラスミドの喪失は非蛍光性の生細胞をもたらす可能性があり、これはプラスミド上の選択マーカーに対応する適切な抗生物質の有無にかかわらず培地にプレーティングすることによって試験する必要があります。pSC101由来プラスミドの場合、in vivoでのプラスミド損失はまれです19。11で使用されているsifB::gfpのようなほとんどの染色体統合発現カセットでは、発現喪失はin vivoでは検出できません。セグメンテーションが免疫組織化学データと一致しない場合は、セグメンテーションパイプラインを変更する必要があります。
STPトモグラフィーの分解能は、密集したマイクロコロニー内の個々の細菌細胞を分離するには不十分です。しかし、マイクロコロニーの全蛍光強度により、 サルモネラ 菌の数を推定することができます。これには、 サルモネラ菌sifB::gfp11のような非常に均質な蛍光レベルを持つ蛍光株が必要です。すべてのマイクロコロニーおよび単一細胞の サルモネラ 細胞の推定数を組み合わせると、組織ホモジネートのプレーティングまたはフローサイトメトリーなどの代替方法と一致する総細菌組織負荷が得られる11。プレーティングとフローサイトメトリーは、STPトモグラフィーのために灌流固定する必要があるため、同じ組織から直接行うことはできません。それどころか、固定されていない追加の動物を使って行う必要があります。さまざまなアプローチによって決定される細菌負荷の中央値が3倍以上異なる場合、蛍光細菌の生存率が損なわれる可能性がある(コロニー形成単位が低い場合)か、一部の細菌が蛍光レポーターコンストラクトを失った(コロニー形成単位が高い場合)可能性があります。このような不一致の原因を特定するためには、対照実験が必要になります。
STPトモグラフィーは、感染組織の3D構造内の細菌細胞の局在化を提供します。コラーゲンの第2高調波信号は、動脈や小柱などの解剖学的ランドマークを提供します。さらに、宿主細胞は、灌流前に表面マーカーに抗体を注入することにより、 in vivo で染色できます(図5 および 図6)。この染色は、組織コンパートメントや炎症病巣などの特定の微小環境に追加のランドマークを提供します(細胞内マーカーや、脾臓の白い歯髄や脳などの拡散バリアを持つ一部のコンパートメントは簡単にアクセスできないため、この in vivo 染色に適しています)。このアプローチにより、脾臓の白い歯髄が、抗菌化学療法中の サルモネラ 菌の長期生存を可能にする組織コンパートメントであることが明らかになりました11。
最後に、中程度または遅い速度で複製するサルモネラ菌は、複製速度11,15の単一細胞レポーターであるタイマーbacを発現する株を使用して、組織の3D構造内で同定および局在化することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> 図1:連続2光子(STP)トモグラフィーを用いた全臓器イメージングの手順(A-B) 臓器を経心灌流後に採取し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)に4°Cで一晩保存します。(C-E) 臓器を酸化アガロースに包埋して架橋した後、組織をスキャンし、STPトモグラフィーを使用してスライスします。スライスは、その後の免疫組織化学のために収集されます。(F-J)細菌数の定量化、蛍光細菌の確認、細菌位置の3D再構成のための計算機解析パイプライン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> 図2:シリアル2光子(STP)トモグラフィーセットアップ(A)断層撮影は、(B)2光子イメージングと(C)自動シリアル組織切片を組み込んだものです。(D)追跡調査のために収集された組織切片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> 図3:タイルのステッチと照明の補正。 タイルはステッチされ、不均一な照明は、正則化エネルギー最小化(CIDRE)を使用して補正された強度分布を使用して補正されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> 図4:サポートベクターマシン(SVM)と畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を使用した緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する サルモネラ菌 のセグメンテーション。 (A)SVMでセグメント化されたGFPオブジェクト(左)とSVMでセグメント化された領域を持つ対応する画像(右)の代表的な画像(スケールバー:10μm)。(B)セグメント化された地域のクラスター化された赤-緑-青(RGB)値の分布。(C)SVMが細菌と誤認した非GFP物体の代表画像(左)。CNN は、それらを背景として正しく無視します (右、スケール バー: 10 μm)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> 図5:トモグラフィーによる緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するサルモネラ菌の検出と免疫組織化学による確認。サルモネラリポ多糖に対する抗体で染色した後、トモグラフィーまたは共焦点顕微鏡法で取得した同じ切片の画像(左)。好中球(赤)は、灌流前にPE標識抗Ly-6G抗体をin vivo注射して染色しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> 図6:感染したマウス脾臓における サルモネラ 菌の3D再構築と局在化。 (A)厚さ5mmの脾臓切片を、抗CD169抗体(赤)による灌流前に in vivo で染色した3次元(3D)再構成。青色の信号は、第2高調波によって検出されたコラーゲンを表します。(B) (A)に示す3Dスタックの1つの光学面。 サルモネラ 菌細胞またはマイクロコロニーの位置は星で示されています。(C)感染した肝臓の サルモネラ 菌の位置(星)の3D再構築。動脈は、コラーゲン鞘(青)に基づいて見えます。スケールバー:1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、感染時の病原菌の臓器全体にわたる検出と蛍光レポーター活性の定量化を可能にする手順について説明します。

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

細菌感染症は、人間の健康に対する大きな脅威です。抗菌薬耐性は増加しており、いくつかの主要な病原体に対するワクチンはまだ不足しています。制御戦略の新たな道筋を見出すためには、病原体が宿主の免疫系や感染組織中のin vivoでの抗生物質にどのように反応するかについて、さらに知る必要があります。生き残った細菌は、抗菌薬が感染を根絶できない場合、再発を引き起こす可能性があります。シリアル断層撮影を使用して、サルモネラ菌を引き起こす腸チフスが治療中に持続する可能性があることを示します 脾臓の特定の部分で。この領域では炎症が弱いため、抗生物質と炎症の間の重要な相乗効果が乱れ、効果的なクリアランスがもたらされます。バクテリアはマイクロメートルサイズの物体です。このような小さな物体を組織の文脈で位置特定することは困難です。連続2光子トモグラフィーは、センチメートルサイズの臓器内の1つの細菌を検出し、その複製速度を決定することができます。また、好中球などの免疫細胞を検出し、細菌との空間的関係を決定することもできます。静菌性抗生物質の活性について研究しています。これらの抗生物質は感染症を治すことができますが、実際に病原体を殺さずに細菌の増殖を阻害することしかできません。また、特定の病原性因子を欠く細菌変異体の広がりや、免疫障害が感染や治療に与える影響も判断します。

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Research

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Immunology and Infection

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