Name: In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学ぶChandler LoopとRT-FluFFを用いたせん断流下での血栓線維素溶解モニタリング法。流動条件下での血栓構造と溶解効率をリアルタイムで評価し、生理学的関連性の高いin vitroアッセイを構築します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この出版物で報告された研究は、米国国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所(National Heart, Lung, and Blood Institute)の賞番号R01HL167877で支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

以下に示すすべての方法は、治験審査委員会(IRB)のプロトコルおよび機関のヒト研究倫理委員会に準拠しています。すべての健康なボランティアは、献血前に書面でインフォームドコンセントを提供しました。なお、プロトコール内で参照されているすべての材料は、 材料表に記載されています。このプロトコルでは、ヒトの WB と血漿について説明しますが、研究動物の血液と因子が枯渇した血液製剤の使用を購入して代用することができます。
1.全血採取
<ol><li>標準的な瀉血技術を使用して、同意した健康なボランティアから静脈全血(WB)を採取します。 注意: このプロトコル全体で、血液やその他の感染性の可能性のある物質との接触のリスクを減らすために、普遍的な予防措置が守られていることを確認してください。手袋、白衣、フェイスシールドの使用が必要です。</li>
	<li>~50 mL の WB を 3.2% クエン酸ナトリウムチューブに直接集め、すぐに 50 mL チューブにプールして後で使用します。 注:クエン酸チューブに採血する前にチューブを廃棄することに加えて、チューブがメーカー推奨の量まで充填されていることを確認する必要があります。採集したばかりのWBは、宿主の凝固ダイナミクスを最もよく再現します。WBの室温(使用≤4時間前)での短期保存は許容されます。WBは、トロンボエラストグラフィー15で検査すると凝固ダイナミクスに影響を与えることが示されているため、一晩保存されません。</li>
</ol>2.血栓形成
<ol><li>3 mLのクエン酸全血に、蛍光(フルオレセインイソチオシアネート[FITC])タグ付きフィブリノーゲン(FITC-Fg)を最終濃度60 μg / mLまで添加します(内因性血漿フィブリノーゲン濃度を3 mg / mLと仮定すると、蛍光タグ付きフィブリノーゲンと未修飾フィブリノーゲンの比率は1:50です)。 注:この比率は、血餅の形態への影響を最小限に抑えながら、1:10まで高めることができます。13,14蛍光タグ付きフィブリノーゲンは、フィブリノーゲンをフルオレセインイソチオシアネート(FITC)と反応させることによって購入または生成できます。フィブリノーゲンの混合は、実行開始の≤5分前に行う必要があります。<ol><li>フィブリノーゲンが以前に分注および凍結されていた場合は、解凍したFITC-Fgを検査して、重合が時期尚早に開始されて使用不能になっていないことを確認します(溶液中に微粒子や繊維がないことを確認してください)。</li>
	</ol></li>
	<li>直径120 mmのドラムを37°Cのウォーターバスに入れたChandlerループセットアップを準備します(図1)。Chandlerループデバイスが、血栓形成プロセス全体を通じて0〜90rpmの固定回転速度で回転できることを確認してください。 注:追加のChandlerループのセットアップと変更については、Zeng et al.を参照してください。16.</li>
	<li>チューブ(内径5/32インチ、外径7/32インチ)をカットし、ドラムの周りにしっかりとフィットするが、しっかりとフィットしないループを形成します。ここで説明する推奨チューブサイズについては、チューブの端を接続してクローズドループを形成するためのフィッティングとして使用するために、標準の200 μL PCRチューブをカットします。 注:異なるサイズの血栓16を生成するために、異なるチューブサイズを利用することができます。</li>
	<li>全血に200 mMの塩化カルシウム溶液を1:17の比率で追加することにより、血液の凝固を開始します。.3 mLシリンジを使用して、血液をチューブ(チューブ容量の~50%を充填)にロードします。すぐにループを両端を接続するチャンドラーループドラムに置き、回転を開始します。<ol><li>ロード前に穏やかな反転で適切な混合を確保し、WBコンポーネントの沈降に起因する問題を回避します。</li>
		<li>一貫性が保たれていないと血栓のサイズに影響を与える可能性があるため、各チューブに毎回同じ量の血液が追加されていることを確認してください。</li>
		<li>血液柱内の気泡も血液凝固に影響を与える可能性があるため、チューブを「シーソー」のようにゆっくりと動かして泡を取り除き、ドラムに泡をロードする前に泡の脱出を促進します。</li>
	</ol></li>
	<li>ウォーターバスに部分的に沈めたドラムを40RPMの回転速度で回転させ、計算されたせん断速度~450 s-1を達成します。 注:チューブのサイズと回転速度(20〜60 RPM)に基づいて計算されたせん断に関する情報については、Zengらを参照してください16。典型的な静脈および動脈のせん断速度は、それぞれ 20-200 s-1 と 300-1,000 s-1 であり、~400-500 s-1 が肺動脈の代表です。</li>
	<li>蛍光タグ付きフィブリノーゲンの光退色を最小限に抑えるために、低照度条件下で40〜60分間血栓が形成されます。</li>
	<li>希望の凝固時間に達したら、チューブから血栓を取り出し、すぐに使用します。構造を損なうことなく血栓を穏やかに除去するには、チューブを静かに反転させて、血栓がチューブからゆっくりと滑り出して小さな容器に入るようにします。 注:形成された血栓をクエン酸血漿または PBS で 4 °C で一晩保存すると、その後のフローループでの血栓消化の分析に影響を与える可能性があります。</li>
</ol>3. RT-FluFF装置のセットアップ
<ol><li>図2に示すように、フローループ装置が接続され、すべての接続が安全であることを確認してください。要するに、フローループ装置には、流れの方向の順に、ポンプ>ダンパー>入口圧力センサー>血栓>出口圧力センサー>蛍光光度計>加熱リザーバー>ポンプが含まれます。ポンプ容量、実験流量、チューブの直径と長さ、温度、リザーバー容量、血栓のサイズ/形状の選択を、各研究に固有の実験ニーズに合わせて調整します。 注:この例では、チャンドラーループで使用されたのと同じ直径のチューブがRT-FluFFに使用されました。チューブは、同じ日に複数回の運転に使用できますが、劣化や漏れがないか監視し、必要に応じて交換/すすぎる必要があります。ランの合間に温かい蒸留水ですすぐことをお勧めします。実験計画によっては、実行のたびにチューブを交換する必要がある場合があります。</li>
	<li>すべてのチューブが固定されたら、圧力モニターをオンにします。圧力モニターが入口センサーと出口センサーの両方で0mmHgを読み取りていることを確認します。開いていない場合は、バルブを開いて圧力センサーが大気圧に対して開いていることを確認し、センサーをゼロにします。</li>
	<li>使用している加熱ブロックまたはウォーターバスの電源を入れ、実験中の温度を監視します。人間の生理的な体温を模倣するために、温度を37°Cに近づけてください。</li>
	<li>ポンプを希望の流量に回して漏れがないか確認し、圧力センサーが機能していることを確認します。 注:このチューブサイズでの流速が~160 mL/分の場合、せん断速度は~500 s-1になります。</li>
	<li>血栓の充填を容易にするために、ポンプをオフにしてください。</li>
</ol>4. 血栓をフローループにロードする
<ol><li>以前に保存された血栓を使用する場合は、血栓をフローループシステムにロードする前に、必ず血栓を室温に戻してください。</li>
	<li>血栓の質量損失は、血栓溶解アッセイの重要なエンドポイント測定です。血栓の質量は、以前の測定に頼るのではなく、フローループにロードする直前に測定するのがベストプラクティスです。<ol><li>血栓の質量測定は、サンプル間および分析日間で一貫性を確保するために、常に同じ方法で行う必要があります。これは、血栓内および血栓上の液体含有量が血栓の質量に大きな影響を与える可能性があるためです。ベストプラクティスは、測定プロセス全体で血栓を圧迫しないように注意しながら、ワイプに大量の液体が放出されなくなるまで、実験室のワイプで血栓を穏やかに吸い取ることです。</li>
	</ol></li>
	<li>血漿(自家またはタイプマッチ)またはフローループで使用される他の移動相溶液(PBSや定義培地など)に血栓を沈め、秤量皿などの浅い容器に入れます。移動相溶液は、50 mLシステムリザーバーから直接取り出して、システム全体の容量を制御する必要があります。血栓溶解剤または医薬品の試験剤は、血栓充填段階では存在してはなりません。フローループを実行するための移動相の総容量は ≥50 mL にすることが推奨され、すべてのサンプルで一貫している必要があります。</li>
	<li>フローループチューブの中央部分(入口センサーと出口センサーの間)を取り外し、チューブの一方の端に10mLシリンジを取り付けます。</li>
	<li>チューブの自由端を使用して、チューブをプラズマ(または移動相)に入れ、少量の溶液を取り込み、チューブをプライミングします。次に、チューブインレットを血栓の近くに置き、血栓を注意深く調べて、ヘッド(通常は血栓の少し厚い端)とテール(ヘッドの反対側の端)を特定します。血栓の頭部は、入口圧力センサーの方に、出口から離して配置する必要があります。チューブを血栓の「尾部」端に置き、シリンジでチューブに吸引します。 注:血栓ヘッド/テールの方向性を視覚的に判断できない場合は、チャンドラーループからの回転方向を知ることに基づいて方向性を割り当てるのが最適です-血栓ヘッドはドラム回転の反対方向を向いています。</li>
	<li>血栓が出口圧力センサーに最も近づくように、チューブをメイン装置に取り付け直します(血栓の頭が出口センサーの反対側を向いている必要があります)。チューブと血栓ヘッドに「X」パターンの2本の30G針を刺して、血栓をその位置に固定します。実行中は、これらの針をそのままにしておきます。 注:ダンパーとポンプの設定によっては、血栓が早期に断片化しないようにするために、追加の針が必要になる場合があります。必要に応じて、血栓の下流のチューブにスクリーンを追加して、血栓の破片がシステム内を循環するのを防ぐことができます。血栓を保持するための針の数が決まったら、これを条件間で一定に保ちます。</li>
	<li>移動相溶液の残りを取り出し、リザーバーとして50 mLチューブに入れます。</li>
	<li>リザーバーをウォーターバスに入れ、入口と出口のチューブに入れます(出口は蛍光光度計からで、入口はポンプヘッドに入ります)。</li>
	<li>使用している蛍光光度計が接続され、監視されていることを確認してください。実験開始時の移動相のみのシステムベースラインと比較して、初期値が適切であることを確認してください。 注:インライン蛍光光度計が利用できない場合は、フローループ分析期間を通じて定義された間隔でリザーバーの連続的な定期サンプリングを実行できます。収集されたフラクションは、実験完了直後に市販の分光光度計で96ウェルプレートを使用して読み取ることができます。</li>
	<li>500 μL の 100,000 ng/mL tPA をリザーバー容量に直接加えると、50 mL で最終的に 1,000 ng/mL tPA 濃度が得られます。添加される量、濃度、および特定の薬物は、目的の目標循環濃度とシステムリザーバー容量によって異なります。</li>
	<li>ポンプを始動する前に、次のことを確認してください。<ol><li>すべてのジャンクションは安全です。</li>
		<li>圧力センサーの上にある2つのバルブは、適切な閉位置にあります。</li>
		<li>リザーバーに残っているプラズマ(または液体)が交換されています。</li>
		<li>血栓溶解薬がリザーバーに追加され、適切に混合されています。</li>
		<li>インレットチューブはリザーバーの底近くにあります(これにより、気泡が最小限に抑えられます)。</li>
		<li>アウトレットチューブは固定されており、目的の圧力に対して適切な高さにあります(モデル化されている容器の位置によって異なります)。</li>
		<li>ポンプの回転方向が正しい(流れの順序:ポンプ>ダンパー>クロット>蛍光光度計>リザーバー>ポンプ)。</li>
		<li>ポンプの回転数が非常に高い(>150 rpm)場合は、圧力の急激な変化が血栓を断片化したり、チューブの漏れを引き起こしたりしないように、低速で開始してランプアップします。</li>
		<li>システムが蛍光光度計からのデータを適切に記録していることを確認する、および/または実験後の時点の読み取りのために移動相の定期的なサンプリング用に供給が準備されていることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>ポンプの電源を入れ、160 mL/minの所望の体積流量を達成するか、または所望の圧力に達するまで流量を増やすように設定します。システムは液体と泡で満たされます。泡は人為的に蛍光測定値を上げるので、気泡が晴れるのに注意してください。それらが終わったら、ライトをオフにしてデータ取得を開始します。</li>
	<li>血栓が著しく劣化するか、目的の実験時間が経過するまで(≥60分)、ポンプを作動させたままにします。必要に応じて、リザーバーを介して実験全体を通してシステムに試薬を追加し、さまざまな血栓溶解性のバリエーションをテストする独自の実験条件を作り出します。 注:実験時間は、ポンプの流量(せん断レベル)と血栓溶解性の濃度によって異なります。</li>
	<li>アッセイが完了したら、体積流量を下げ、ポンプがまだ稼働している間にインレットチューブを取り外して、システム内のほとんどの流体をリザーバーに押し込みます(一部の移動相はチューブに残ります)。チューブの出口圧力センサー側にある血栓を含むチューブセクションを外し、計量ボートに下げます。</li>
	<li>血栓を所定の位置に保持している針を取り外して、システム内から残った液体と血栓/血栓の破片を収集します。必要に応じて、シリンジを使用してシステムをクリアします。</li>
	<li>残りの血栓を秤量して処理し、損失質量率の計算や組織学などの追加分析を行います。</li>
</ol>5. システムのクリーニング
<ol><li>サンプル間で、システム全体を高rpm(>150rpm)の温水ですすいでください。リザーバーに水を入れ、システムを少なくとも2分間実行し、空にして、再度実行して2回の完全なシステムすすぎを行います。これらのすすぎ後、蛍光光度計の読み取り値がベースラインに戻らない場合は、すすぎプロセスをさらに繰り返します。それでもベースラインに戻らない場合は、次のサンプルをアッセイする前にチューブを完全に交換してください。 注:実験中、チューブはサンプル間で再利用できます。ただし、血栓を所定の位置に保持するために使用される針による穿孔のため、入口圧力センサーと出口圧力センサーの間のチューブセクションは、実行のたびに交換する必要があります。実験条件によっては、サンプルのクロスコンタミネーションを排除するために、各分析またはクラスタリングアッセイの後にチューブセット全体を交換することが必要になる場合があります。</li>
	<li>その日の実験のためにすべてのサンプルを実行した後、すべてのチューブを取り外して廃棄します。T字型ジャンクションをお湯と毛ブラシできれいになるまでこすり洗いし、乾かしてシリンジダンパーをお湯ですすいでください。無菌性を助けるために70%EtOHを使用してください。</li>
</ol>

Chandler Loop と RT-FluFF の組み合わせによる Ex vivo 血栓溶解モニタリング

<ol><li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspect+of+thrombolytic+therapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).</li>
<li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+ischemic+stroke+models%3A+replicating+human+stroke+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li>
<li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684(2014).</li>
<li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14(2006).</li>
<li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li>
<li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li>
<li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201(2018).</li>
<li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+in+haemostasis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833(2020).</li>
<li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511(2023).</li>
<li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li>
<li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24(2023).</li>
<li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li>
<li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization%2C+fibrinogenolysis%2C+or+fibrinolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

血栓の形成と標識 チャンドラーループは、 生体内 血栓16を模倣する血栓を再現性よく生成する容易かつ効果的な手段を提供することが実証されている。チューブのサイズ、回転速度、ドラムの直径、凝固時間などのパラメータを微調整することで、動脈と静脈の両方の源を模倣したさまざまな血栓で評価される建築的特徴を捉えることができる、さまざまなせん断条件下での血栓の迅速な生成が可能になります。FITC-Fgなどのマーカーを導入できるという柔軟性が加わったことで、RT-FluFFシステムで実証したように、これらの血栓の潜在的な用途が広がります。チャンドラーループの基本原理は初歩的ですが、一貫した血栓形成に関連する急な初期学習曲線が残っており、同時に血栓形成プロセス全体で血液と血液製剤を取り扱います。これは、WBの凝固が凝固の開始前後の取り扱いに非常に敏感であるという事実に由来します。特に重要なのは、血液表面の相互作用が血栓形成の進行に影響を与える可能性があるため、チャンドラーループの血栓形成ステップで使用されるチューブの選択です。チューブは、生体反応性が低い医療グレードまたは外科グレード(非発熱性および非溶血性)である必要があります。私たちの結果で説明したように、形成された血栓の変動は、実験規模と独自のアッセイ変更に基づいて最適なワークフローを開発する際に、技術の初期学習段階で予想されます。最終的な再現性の達成は、線維素溶解を受ける際の血栓の構造が血栓の挙動に与える影響を考えると、極めて重要です。最後に、健康なボランティアの間でさえ、凝固の変動も予想され、実験計画中に考慮する必要があります。
RT-FluFFアッセイ FITC-Fgをマーカーとして用いた線維素溶解の蛍光/分光光度定量は、主にエンドポイント血栓質量評価に依存してきた従来の技術に比べて、多くの利点を提供します。生理学的フローパラメータに近似した環境で、リアルタイムまたはほぼリアルタイムで線維素溶解ダイナミクスをモニタリングする能力は、従来の線維素溶解薬スクリーニングアッセイからの大幅な改善を表しています。このアッセイは、完全に小型化されたマイクロ流体アプローチを採用するのではなく、臨床的に関連する血栓サイズ、流場、体積流量、および血栓質量負荷により近づくように、提示されたスケールで意図的に設計されました。RT-FluFF装置をスケールダウンすると、チューブの直径が小さいか、チューブの距離が短いかのどちらかを利用する必要があります。その結果、システムは目的のフローパターンと生理学的関連性から逸脱し始めます。チャンドラーループと同様に、RT-FluFFシステムは、一定の流量下での流れ圧力を調整することにより、せん断速度などのパラメータを制御し、どの流動媒体を利用するかを制御することができます。さらに、RT-Fluff システムは、拍動流と独自の血餅分解形状にも対応でき、分解プロセス全体を通じて移動相の定期的なサンプリングが可能ですが、これは回転するクローズド消化セットアップにより Chandler ループでは不可能です。これらのパラメータが血栓溶解に及ぼす影響は、Zeng et al.14の一部として詳細に調査されています。
Chandlerループ形成血栓とRT-FluFFアッセイチューブを一緒にすると、血栓形成ステップと血栓消化ステップの両方で同じ直径にすることも、異なるレベルの閉塞を達成するために変化させることもできます。これにより、血栓塞栓症を模倣するためにほぼ完全な血管閉塞までモデル化できます。本明細書に記載されているすべてのアッセイは、ChandlerループとRT-FluFFシステムの両方で同じチューブ径を使用しました。RT-FluFFシステムのチューブ径が大きくなると、システムの充填に必要な追加容量に対応するために、移動相リザーバーの容積を増やす必要がある場合があります。リザーバー容量を増やすと、システムに追加する必要のある血栓溶解剤/薬物の必要量も増加する可能性があり、血漿または移動相のニーズも増加します。自家血漿の使用が理想的ですが、実験全体を完了するために必要なすべてのアッセイと反復にわたって、チャンドラーループ血餅形成とRT-FluFF移動相容量に対応するために、個々のドナーから非常に大量の血液を採取する必要があります。このため、血液提供センターから入手した、または商業業者から購入したタイプマッチしたプール血漿が一般的に採用されていました。RT-FluFFアッセイチューブ全体はある程度短縮できますが、すべてのコンポーネントが消化実験を実行するためのループ内に留まるのに十分なスペースを確保するなどの制限があります。特に重要なのは、血栓自体の上流で使用されるチューブの長い部分が、チューブの直径と流量に基づいて計算され、浮遊血餐塊に到達するまでに層流が達成されるように、最小の長さを超える必要があることです。チューブのサイズの選択に関係なく、チャンドラーループの血栓形成ステップで詳述されているのと同じチューブに関する考慮事項をRT-FluFFシステムチューブにも適用する必要があります。繰り返しになりますが、圧力センサー間のチューブは、チャンドラーループが形成された血栓が「X」パターンで挿入された2本の針を介して所定の位置に固定されており、針の穿刺部位で漏れが発生するのを防ぐために、アッセイのたびに交換する必要があります。消化中に血栓を所定の位置に保持するために針を使用すると、血栓の凝集が制限され、流れ方向に対する血栓配向機能が提供されるため、アッセイ間の一貫性が向上します。ここでは、tPAを用いた単一の代表的な血栓消化試験について説明していますが、ChandlerループおよびRT-FluFFアッセイは、新規の線維素溶解薬を試験するためのさまざまな血栓構造、レポーター分子、せん断速度、および消化条件に対応する高度なカスタマイズ性を提供します。
制限 線溶薬のスクリーニングに利用されている現在のプラットフォームや方法と同様に、RT-FluFFアッセイにも認識すべき特定の弱点があります。まず、チャンドラーループで形成された血栓は、 インビボ 血栓に一般的に存在するモチーフを示すが、それでもなお、拍動性の流れおよび内皮との相互作用が存在する インビボ 血栓とは異なる環境で形成される17 さらに、FITC-Fg濃度が血栓構造への影響を最小限にするように最適化されていたとしても、修飾されたフィブリノーゲンの添加は依然として生理学的条件からの逸脱を表している。血漿の移動相培地の選択は、ドナーごとに異なる可能性のある血漿のタンパク質および脂質含有量に関連する少量のバックグラウンドシグナルが存在するため、蛍光光度計の使用に影響を与える可能性があります。RT-FluFFセットアップの潜在的に大きな制限は、蛍光染色リードに対するRBCの悪影響であり、FITCを蛍光血餅消化マーカーとして利用する際にWBを移動相として使用することを制限することです。これを軽減するための実行可能な方法は、分光光度計で離散的な時点を読み取る前にRBCをペレット化するための遠心分離ステップを導入するか、またはRBCの存在による影響が少ない別の血餅消化レポータータグを利用することです18。アッセイデザインに基づいて慎重に検討し、重要な変数が制御されるようにする必要があります。例えば、血漿が移動相として選択される場合は、ドナー間の凝固や線維素溶解のばらつきを最小限に抑えるために、多くのドナー間で血漿をプールするのが最善です。最後に、蛍光タグ付きタンパク質と同様に、FITCタグがフィブリノーゲン19の表面上に互いに相対的に近接して存在するため、消光の問題が自然に生じる。
結論と今後の方向性 血栓溶解のようなダイナミックなプロセスを研究するためには、生理学的条件を再現し、複数のパラメータを同時に制御できる、同様にダイナミックな環境が必要です。高忠実度のRT-FluFFシステムは、このギャップを埋め、動物モデルへの移植に先立つ新規血栓溶解薬の将来の開発とスクリーニングにおける重要なツールとして機能します。RT-FluFFは、非常に汎用性の高いプラットフォームであり、ここでは説明されていない複数の能力を備えていますが、医薬品設計、作用機序、または多様な凝固疾患状態の再現の固有のニーズに応じて、プロトコルに確実に組み込むことができます。RT-FluFFシステム内で評価できた利点は次のとおりです:(a)可変チューブの形状と構成、(b)ルーメン閉塞の程度と相関するリアルタイムでの圧力モニタリング、(c)ユーザーの介入を必要としないリアルタイムでの蛍光測定、(d)アッセイ期間とサンプル周波数の柔軟性、(e) 生体内 条件を模倣するためのリザーバーの使用、 (f) in vivo のようなせん断流パターン、(g)拍動性流を含めるオプション、(h)異なる疾患代表血餅類似体のチャンドラーループ形成における有意な柔軟性、(i)血栓形成または血栓消化に対する薬物の影響をテストする能力、および(j)透明なチューブを介してバルク血餅消化を追跡するための直接血栓基質イメージングにより、さらに消化後が可能になります。 縦断的ビデオ分析。

基本的に血栓塞栓症の病因に起因する疾患は、現代社会における罹患率と死亡率の主要な原因を示しています。血栓塞栓症の病因の徴候には、心筋梗塞、虚血性脳卒中、深部静脈血栓症、および肺塞栓1が含まれるが、これらに限定されない。病原性血栓症に対処するための安全で効果的な方法の開発を中心に、複数の分野にまたがる膨大な量の進行中の研究が展開されています。血栓症の動脈および静脈の症状の変動と解剖学的位置の変動により、さまざまな治療アプローチが開発されました。ただし、急性期の治療は一般に、プラスミノーゲン活性化剤を介した薬理学的血栓溶解の使用に依存しており、特定の臨床状況下で機械的血栓摘出術の可能性があります2。
新しい薬理学的治療戦略の開発は、基本的に前臨床試験のためのinvivo動物モデルとinvitro消化モデルの両方に依存しています3,4。In-vivoモデルは、医薬品のクリアランスや薬物との細胞相互作用など、治療効果に関するさまざまな生理学的パラメータの複雑な相互作用を捉える能力から自然に恩恵を受けます。しかし、この同じ複雑さにより、このようなモデルは非常に高価になることが多く、ヒトの生理機能とは大きく異なる動物の基礎となる薬力学/動態を分離しようとすると、追加の問題が発生します。インビトロモデルの開発は、医薬品の開発とスクリーニングを実施できる蒸留試験環境を促進するのに役立ちましたが、多くの場合、研究対象の疾患状態を再現するために必要な忠実度に欠けています。
新規血栓溶解薬を試験するための一般的に見られるinvitroプロトコルは、残留血栓質量が主要評価項目5,6として機能する静的条件下で形成および溶解された血栓の利用に依存しています。残念ながら、このような手法では、乱流や経血栓圧力降下など、試験薬の薬力学を大きく変える可能性のある血栓溶解の機械的側面を説明できていません。さらに、静的条件下で形成された血栓には、生理学的血栓とは異なるマイクロアーキテクチャが含まれています。血栓形成中のせん断の存在は、血小板の活性化やフィブリン架橋など、結果として生じる血餅の特性に影響を与えることが再現性よく示されています。せん断流下で生成される血餅は、静的に形成された血餅7,8にはない、先端から尾までの複雑な不均一性を示します。このような生理学的血栓構造からの逸脱は、血栓内への薬物浸透とその後の溶解効率を含む重要な医薬品開発の特性評価に影響を与える可能性があります9。
静的凝固/血栓溶解モデルの使用に関連するこれらの制限のいくつかに対処するために、血栓形成とせん断の存在下での血栓溶解の両方にチャンドラーループを採用することで、復活が見られました10。このようなシステムは、比較的静的なアッセイと比較して、流れのダイナミクスをより適切に表現し、より生理学的に関連性のあるアーキテクチャの血栓を生成することができますが、その単純化された流れ条件は依然として生理学的条件からの逸脱を表しています。最後に、イメージングの容易さと均一なフローパターンにより、マイクロ流体アプローチも実施されています。しかし、それらは、主に臨床的に関連する血栓塞栓症11,12で影響を受けるより大きな血管内で予想される生理学的条件からの有意な除去のままです。
上記の議論を念頭に置いて、前臨床血栓溶解薬スクリーニングのための高忠実度の in-vitro 血栓溶解モデルを開発しました。このモデルは、新規血栓溶解療法スクリーニングの領域で上記で詳述した現在の落とし穴のいくつかに対処することを目的としており、さまざまな濃度の組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)での再現性と感度が検証されました。本明細書に記載のシステムは、蠕動ポンプ、圧力減衰器、加熱リザーバー、2つの圧力センサ、インライン蛍光計、および蛍光標識されたチャンドラーループせん断形成血餅アナログを利用して生理学的せん断流を提供し、線維素溶解13のリアルタイム追跡を容易にする。まとめると、システム全体は Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay(RT-FluFF Assay)14 と呼ばれ、この原稿では、この高忠実度の in-vitro 血栓溶解モデルでアッセイを正常にセットアップして実行するための複雑さについて説明します。

<table><tbody><tr><td>30 G&nbsp;使い捨て皮下注射針</td><td>Exel International&nbsp;</td><td>26439</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>6 mm HSS旋盤バーストックツール150 mm長い</td><td>uxcell</td><td>B07SXGSQ82</td><td>チャンドラーループ、&nbsp;</td></tr><tr><td>96ウェルクリアフラットボトムUV透明マイクロプレート</td><td>コーニング</td><td>3635</td><td>その他の消耗品、未処理アクリル共重合体、非滅菌</td></tr><tr><td>エアタイト ルアーロック 非滅菌 60mLシリンジ</td><td>エアタイト</td><td>MLB3</td><td>RT-FluFF装置、ダンパー</td></tr><tr><td>アリウムミニプラス 超純水システム</td><td>ザルトリウス</td><td>NA</td><td>DI水源</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>ミリポア シグマ</td><td>C5670</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>ディスポーザブルBPトランスデューサー</td><td>ADインスツルメン</td>ツ <td>MLT0670</td><td>RT-FluFF装置</td></tr><tr><td>ドレーガー ジーマンス ヘモメッドポッド</td><td>ドレーガー</td><td>5588822</td><td>RT-FluFF装置</td></tr><tr><td>ドレーガー ジーマンス 生体情報モニタ</td><td>ドレーガー</td><td>SC 7000</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr>ドラム<tr><td>(シリンダー、直径120 mm、幅85 mm)</td><td></td><td></td><td>チャンドラーループ、</td></tr><tr><td>フェイスシールド</td><td>モックス</td><td>SHIELDS10</td><td>チャンドラーループ,&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒト血漿由来フィブリノーゲン、Alexa Fluor 488 コンジュゲート</td><td>Thermo Scientific</td><td>F13191</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>フィッティング、ポリカーボネート、4方向ストップコック、オス ルアーロック、非滅菌</td><td>Masterflex</td><td>30600-04</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr><tr><td>フルオレセイン (FITC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>119245000</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>汎用ウォーターバス</td><td>Thermo Scientific</td><td>2839</td><td>チャンドラーループ,&nbsp;</td></tr><tr><td>ホットプレート4 &times; 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>1152016H</td><td>RT-FluFF装置</td></tr>人間<tr><td>源血漿新鮮冷凍</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-SPL</td><td>その他の消耗品、CPDA-1抗凝固剤</td></tr><tr><td>人間全血&nbsp;</td><td>ゼンビオ</td><td>SER-WB-SDS&nbsp;</td><td>その他の消耗品、CPDA-1抗凝固剤</td></tr><tr><td>L/S Easy-Load II ポンプヘッド 高性能精密チューブ用、PPS ハウジング、SS ローター</td><td>Masterflex</td><td>77200-62</td><td>RT-FluFF 装置、ポンプヘッド</td></tr><tr><td>L/S 可変速デジタル駆動ポンプ、リモート I/O 付き、6 から 600 rpm; 90 から 260 VAC</td><td>Masterflex</td><td>7528-10</td><td>RT-FluFF 装置、ポンプ</td></tr><tr><td>モーター速度コントローラー</td><td>CoCocina</td><td>ZK-MG</td><td>チャンドラーループ、&nbsp;</td></tr><tr><td>Nalgene チューブ T 型コネクター</td><td>Thermo Scientific</td><td>6151-0312</td><td>RT-FluFF 装置</td></tr>チューブ <tr><td>チューブ&nbsp;</td><td>マスターフレックス</td><td>06424-15&nbsp;</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P3813</td><td>その他の消耗品、粉末、pH 7.4、1 L溶液の調製用</td></tr>スイッチング<tr><td>電源</td><td>SoulBay</td><td>UC03U</td><td>チャンドラーループ、&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>S751010</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>組織プラスミノーゲン活性化剤、ヒト</td><td>ミリポア Sigma</td><td>T0831</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>チューブ ID 1/4'', OD 3/8''</td><td>Fisher Scientific</td><td>AGL00017</td><td>その他の消耗品、1.5cm セクションにカット チューブを T 型コネクター</td></tr><tr><td>に接続するために使用しますチューブID 5/32インチ、OD 7/32インチ</td>、<td>タイゴン</td><td>ND-100-65、ADF 00009&nbsp;</td><td>その他の消耗品</td></tr><tr><td>V3 365 nmミニ - ブラックライトUV懐中電灯</td><td>uvBeast</td><td>uvB-V3-365-MINI</td><td>チャンドラーループ、DC</td></tr><tr><td>モーター、12 V、100 rpm</td><td>パンギョー</td><td>ZGA37RG</td><td>チャンドラーループZGA37RG ZYTD520</td></tr>完了した血栓をチェックするために使用されます。</tbody></table>

in-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるchandler loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

血栓塞栓症および関連する合併症は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因であり、 in vitro と in vivo の両方で血栓溶解薬の有効性をテストするためのさまざまなアッセイが開発されています。動物モデルには複雑性とコストがかかることに加え、ヒトの生理機能への翻訳性が欠如していることが多いことから、医薬品開発のためのより生理学的に関連性のある in-vitro 血栓モデルに対する需要が高まっています。流量、圧力、およびせん断速度は循環器系の重要な特性であり、流れの下で形成される血栓は、静的に形成された血栓とは異なる形態と消化特性を示します。これらの因子は、従来の in-vitro 血栓消化アッセイでは表現されないことが多く、薬物の翻訳成功率に影響を与える薬理学的な意味を持つ可能性があります。
Real-T ime Flu造山運動法 Flowing F線溶 (RT-FluFF) アッセイは、せん断流下で形成された蛍光タグ付き血栓を使用し、線維素溶解薬の有無下で循環プラズマを使用して消化する高忠実度の血栓溶解試験プラットフォームとして開発されました。血栓形成と血栓消化ステップの両方の流速を変更することで、システムは非常に多様な実験設定で動脈、肺、静脈の状態を模倣することができます。測定は、インライン蛍光光度計を使用するか、離散的な時間点を取ることによって連続的に行うことができ、従来のエンドポイントの血栓質量測定も可能です。RT-FluFFアッセイは、in-vitro試験システムの制御性と再現性を維持しながら、in-vivoの生理学的条件をより正確に表現する流条件下での血餅消化のリアルタイム追跡を可能にする柔軟なシステムです。

チャンドラーループ血栓形成 血栓の形成では、一般的に四重結を目指して、血栓の外れ値(総形態と質量に基づく)が存在する場合でも、三重血栓溶解アッセイを実行する能力があることを確認しました。最適な負荷条件を仮定すると、 図3に示すように、血栓はすべて長さ(~3.3 cm)、重量(~100 mg)、および外観が非常に均一である必要があります。FITC-Fgを採用する際には、紫外線下での血栓の検査も目指し、血餅内の高蛍光標識の不規則な領域とは対照的に、蛍光の比較的均一な分散を確保することを目指しました。全血中のFITC-Fgの程度を変えても、調査した濃度内の血栓の重量や外観は変わらないはずです。ただし、マイクロクロットアーキテクチャは、最も高いFITC-Fg濃度(1:5 FITC-Fgから未修飾Fg)で影響を受けました。Zengらによって行われた先行研究は、選択されたせん断レベル16に応じて、チャンドラーループで予想される広範囲の血栓表現型を捉えている。
時には、異常な凝固が発生する可能性があります。最も一般的な血栓形成の問題は、(i)早期の凝固と(ii)凝固障害の2つのカテゴリーのいずれかに分類されます。早期凝固では、血液の全量がチャンドラーループチューブ内で固化します。これは、ドラムの回転をオンにすると、血液が「流れる」のではなく、チューブの壁に付着して一斉に回転するため、明らかになります。このような状況では、これらの血栓は使用できず、廃棄する必要があります。これを回避するには、塩化カルシウムを添加して凝固が活性化されると、ループがすぐに閉じて回転ドラム上に置かれ、凝固が発生するようにします。2番目の状況、または凝固障害は、サンプルが適切に混合されていない場合、または回転が開始される前に血液が凝固し始めたが、状況(i)ほど重要ではない場合に発生します。上記の問題のある血栓は、取り扱うと糸状で薄っぺらく見える傾向があり、多くの場合、血栓の質量が著しく上昇します。表現型的には、これは本質的にうっ滞の設定での凝固を表すため、非常に低い静脈せん断で見られる血栓に近似します。不規則な血栓は時々予想され、廃棄されるべきです。
RT-FluFF蛍光光度計のキャリブレーション RT-FluFFシステムの重要な特徴は、経過した血栓消化期間の血栓溶解を追跡するために使用される蛍光光度計または分光光度計です。実験を実行する前に、蛍光光度計または分光光度計が適切に機能していることを確認することが重要です。私たちの目的のために、蛍光光度計をRT-FluFF装置専用に設計したため、静溶液中に既知の量のFITC-Fg希釈液が存在する場合に、蛍光光度計とよく相関することを確認する必要がありました(図4A)。蛍光光度計の線形範囲を自信を持って決定できるようになったら、次に、流量計が流れの存在下でどのように振る舞うかを確認することを目指しました。フルオレセインを流動溶液に段階的に注入して蛍光の段階的な増加をモニターし、蛍光計の読み取り再現性をよりよく理解し、流動システム内で蛍光がどの程度急速に平衡化しているかを決定することにより、機能性を検証しました(図4B)。その後の実験は、フルオレセインとFITC-Fgの両方を溶液に連続的に着実に注入することにより、線維素溶解実験から予想される連続的な蛍光放出をよりよく模倣することによって実施しました(図4C)。FITC-FgとFITCで描かれている傾きの違いは、FITCが1つのタンパク質(この場合はフィブリノーゲン)に多くのFITC分子を結合させるなど、FITCが自身に近接して結合することで生じるクエンチングの影響から生じると考えられています。当然のことながら、段階的に増加し、傾きは、利用されるFITC/FITC-Fgの濃度だけでなく、フィブリノーゲンあたりのFITC分子の数によっても異なります。ひいては、RT-FluFFを使用して実験を行う際に、多数の血栓バッチ間でデータを比較することが望まれる場合、FITCとフィブリノーゲンの結合の程度を制御することが極めて重要になります。広範な実験を通じて、フィブリノーゲンあたり~14のFITC結合が、溶液中で安定なまま(早期凝集が限定的)、結果として得られる血栓の微細構造への影響を最小限に抑えながら、血栓消化を追跡するための良好な蛍光シグナルを提供することを発見しました。凝固していない純粋なFITC-FgをRT-FluFF装置に流すと、FITC-Fgが高せん断にさらされると、その凝集が促進される可能性があることに注意することが重要です。この現象は、チューブ接続部やポンプヘッドチューブ内の接合部で最もよく観察され、時間の経過とともに利用可能な溶液内蛍光に影響を与える可能性があります。
分光光度計で蛍光を読み取るために離散的な時間点でフローループからサンプルを収集する場合、蛍光光度計のキャリブレーションに関連するこれらの考慮事項の多くは必要ありません。ただし、FITC-Fgの標識、チャンドラーループ形成血餅内のFITC-Fgの量、および血餅のサイズがすべてシステム内で最適化されていることを確認するために、利用されている特定の分光光度計のダイナミックレンジを調査する必要があります。サンプルは、システムからの単離後すぐに読み取るか、実験の完了後にマルチプレックス読み取りのために96ウェルプレートに入れることをお勧めします。必要に応じて、サンプルを採取直後に酸性化して、分析前にさらなる酵素活性を排除することができます。
RT-FluFF血栓溶解 チャンドラーループの動脈せん断下に形成された血栓を利用したRT-FluFFシステムを検証するために、tPA(アルテプラーゼ)を線維素溶解剤として、装置内の移動相としてヒトプラズマを使用しました。調査したtPAの濃度は0〜1,000 ng/mLの範囲でした。ヒトの肺の流れの状態を模倣するために、血漿リザーバーの温度を37°Cに維持し、血餅レベルより物理的に8cm上に上げて平均流量を12mmHgにしました。ポンプ速度は、血栓がない場合に~500 s-1 のせん断流を生成するように調整されました。脈動性フローダンパーがシステムに追加され、ペリスタルティックポンプからのピーク圧力とトラフ圧力の間の変動を最小限に抑えて、ほぼ一定のせん断速度を達成しました(図4D)。圧力ダンパーがない場合、ペリスタルティックポンプの出力圧力は、ポンプヘッドが回転するときにシステム内に液体の小さなパケットを排出することにより、流体を生成する方法の性質により大幅に変動します。血栓溶解は60分間にわたって観察されました。予想通り、tPAの濃度が上昇すると、tPAが少ないまたはまったくない条件と比較して、血栓溶解(RFU/分)の速度が増加し、質量損失が増加しました。tPA 濃度 1,000 ng/mL では、60 分間の消化期間で ~85% の血栓溶解が達成されました。溶解中の血栓の全体的な画像を調べると、血栓構造の物理的劣化と表面蛍光の損失の両方に見られるように、溶解は主に血栓の尾部で発生し、より密集した構造の頭部に影響を与えることが理解できます。予想される血栓の伸張は、せん断速度に依存する方法での経時的な機械的完全性の損失に基づいても発生します。
血栓溶解速度の有意差は、総的には蛍光放出に基づいて評価できますが、蛍光放出と存在する線維素溶解量との間に完全な線形相関はありません。これは、 図 5 で最もよく理解されています。WBベースの血栓の線維素溶解は、自然にFITC-Fgフラグメントだけでなく、血栓形成中にフィブリンネットワーク内に閉じ込められた赤血球(RBC)も放出します。これらの赤血球がRT-FluFF装置内で循環中に放出されると、結果として循環プラズマが著しく赤くなり始めます。循環プラズマのこの比色変化は、蛍光光度計センサーによって読み取られる循環FITC-Fgからの蛍光発光に悪影響を与える可能性があります。線溶濃度が上限に達すると、溶液中へのFITC-Fg放出の程度が、蛍光発光に対するRBCの影響を圧倒します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig01.jpg"> 図1:チャンドラーループのセットアップの概略図。 チャンドラーループドラムにロードされた血液で満たされたチューブは、血栓形成プロセス全体を通して37°Cのウォーターバスに沈められ、ライトは暗くなります。ドラムは、DCモーター、ドライブシャフト、および制御ボードを介して一定の回転速度で回転します。この図は、Zeng etal 14から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig02.jpg"> 図2:RT-FluFFシステムの概略図。 システムの重要なコンポーネントは、画像上で識別されます。この画像には、ペリスタルティックポンプの使用に伴う流れの脈動を最小限に抑えるために、1つの大容量ダンパーが描かれています。インライン蛍光光度計がない場合、定期的なサンプリングの2つの追加オプションには、次のものが含まれます:1)リザーバーから直接サンプリングする。または 2) 移動相を抽出するためのインラインサンプリングポートを組み込んでいます。この図は、Zeng etal 14から修正されています。略語:RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig03.jpg"> 図3:周囲光およびUV光下での質量および物理的外観を含む、Gross Chandler loop FITC-Fgタグ付きWB血栓特性 (A)多様な凝固条件下での一貫した血栓形成は、Chandlerループ血栓形成プロトコルの微調整を通じて達成できます。血栓の質量と外観は、チューブの直径、回転速度、および血栓形成時間の長さによって大きく異なることに注意することが重要です。写真の血栓は、37°Cで1時間、せん断速度506 s-1で形成されました。スケールバー = 20 mm. (B) FITC-Fgのそれぞれの比率を利用してチャンドラーループに形成された血栓の塊。データは、三重以上のデータポイントの平均±標準偏差を表します。この図は、Zeng etal 14から修正されています。略語:FITC-FG =フルオレセインイソチオシアネートタグ付きフィブリノーゲン;WB = 全血。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig04.jpg"> 図4:蛍光光度計の特性評価 (A) 既知の量のFITC-Fg希釈液の文脈におけるRT-FluFFインライン蛍光光度計と分光光度計の比較。(B)フルオレセインをRT-FluFFシステムに段階的に導入して、流れるヒト血漿中の蛍光度計の再現性と蛍光平衡化時間を決定します。(C)RT-FluFFプラットフォームでのフルオレセインとFITC-Fgの比較による連続注入。傾きの違いは、FITC-Fgグループの蛍光消光に起因している可能性があります。(D)同じ体積流量条件下で異なるサイズのダンパーを使用した場合の出口圧力センサー(ポストクロット)の波形。この図は、Zeng etal 14から修正されています。略語:FITC-FG =フルオレセインイソチオシアネートタグ付きフィブリノーゲン;RT-FluFF = リアルタイム蛍光流動線維素溶解アッセイ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig05.jpg"> 図5:RT-FluFFプラットフォームにおける血栓溶解 (A)循環tPAの存在下での血栓消化の60分間で蛍光の代表的な傾きが上昇する。プラスミノーゲンのtPA活性化と血栓消化は瞬間的ではないため、最初の血栓溶解の遅延時間に注意してください。(B)さまざまな濃度のtPaおよびRT-FluFFシステム、一定せん断下でのチャンドラーループ血栓消化、および静的(せん断なし)血栓消化を含むさまざまな血栓溶解モダリティで失われた血栓質量の割合。データは、3 倍以上のデータ点の平均±標準偏差を表し、二重アスタリスクは 0.01 &lt; p 値を示し、3 重アスタリスクは 0.001 &lt; p 値を示します。(C)200 ng/mL の tPA での血栓溶解の総特性。この図は、Zeng et al.14から修正されています。略語:RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay;tPA = 組織プラスミノーゲン活性化因子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

in vitro血栓溶解アッセイは、消化されるモデル血栓や血栓溶解が起こっている環境など、生体内条件を再現するのに苦労することがよくありました。ここでは、ChandlerループとReal-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay(RT-FluFF)の結合が、高忠実度のex-vivo血栓溶解モニタリングにどのように使用されているかを探ります。

In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

血栓症は多くの病状と関連しており、現在の治療法では重度の出血のリスクがあります。循環器系の流れは、血栓の構造に大きな影響を与えます。インビトロモデルにフローを組み込むことで、その生理学的関連性が向上し、インビボ試験のより良い候補の選択肢が増える可能性があります。線溶性物質の研究のためのアッセイでは、主に静的な血栓またはマイクロ流体システムを利用して、溶解時間、血栓構造、粘弾性などの特性を評価します。静的な血栓溶解アッセイは、通常、線溶効率を評価するためのエンドポイントとして、分光光度測定または血栓質量測定に依存しています。現在の血栓溶解性試験では、静的に形成された血栓が使用されており、これは流動条件下で形成されるものとは構造が異なります。マイクロ流体システムは流れのダイナミクスを考慮していますが、スケールが小さいため、独特の血行動態と血栓構造が生まれます。現在開発されているRT-FluFFアッセイは、生理学的流条件下でのリアルタイムでの線維素溶解のモニタリングを容易にします。これは、新しい血栓溶解薬をスクリーニングする際に、より良好な翻訳のために、複数のパラメータを制御してin-vivo研究モデルに近い条件を模倣できるプラットフォームを手に入れたことを意味します。

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マウスにおけるFeCl3誘発血栓症モデルは、ここで説明されています。腸間膜血管の生体内顕微鏡観察と頸動脈の血流測定により血栓の成長を監視する方法が提示されます。...

塩化第二鉄誘発性頚動脈および腸間膜血管に血栓症のマウスモデル

私たちは、塩化第二鉄（FeCl 3を）の洗練された手順は、頸動脈や腸間膜動脈ならびに静脈に血栓症モデルを誘発血栓形成を閉塞性までの時間を監視するために生体顕微鏡を用いて、効率的特徴を報告しています。...

塩化第二鉄誘発性マウス血栓症モデル

本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。...

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。...

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

フィブリンは、止血症および血栓症の間に血栓形成を担当する。濁度アッセイおよびトロンボエラストグラヒ(TEG)は、血栓の相補的評価を提供する相乗的なツールとして利用することができる。これらの2つの技術を組み合わせることで、凝固条件がフィブリン血栓形成にどのような影響を与えるかについてのより多くの洞察を与えることができる。...

相補的な血栓特性解析のための濁度と血栓芽細胞学の活用

ここで示されているのは、標準化された体外血球ループモデルのプロトコルです。このモデルは、輸血チューブまたは血管ステントのヘモ適合性を試験することを可能にする ISO (国際標準化機構) 標準 10993-4...

血管医療機器の血球適合性と宿主細胞活性化を調べるインビトロ血球ループモデル

従来の光血栓性脳卒中(PTS)モデルは、主に組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)溶解性治療に対して高い耐性の高密度血小板凝集体を誘導します。ここでは、光活性化のためにトロンビンと感光性色素を同時注入することにより、修正されたマウスPTSモデルが導入されています。トロンビン増強PTSモデルは、血小板:フィブリン血栓を混合し、tPA血栓溶解に対して非常に敏感です。...

フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル

肝トリプシー支援溶解性分娩またはリソトリプシーは、深部静脈血栓症の治療のために開発中である。この併用療法の有効性を評価するために、インビトロの手順をここに提示する。血栓モデル、画像ガイダンス、および治療有効性の評価のための主要なプロトコルについて議論する。...

組織組織の血栓溶解性の有効性と溶解薬を測定するインビトロシステム

本プロトコルは、FeCl3媒介傷害を使用して動脈血栓症を誘発する方法、および電子顕微鏡分析のために血栓症の様々な段階で動脈損傷サンプルを収集して調製する方法を記載している。...

塩化第二鉄誘発動脈血栓症および3D電子顕微鏡分析のためのサンプル収集

本研究は、せん断応力を用いて血液中の血栓形成を誘発し、多次元読み取りによって血栓を特徴付けるマイクロ流体アッセイを記述しています。このアッセイは血液サンプルの血栓促進傾向を測定できるため、疾患診断、薬剤開発、さらには血栓症に関連する基本的なメカニズム研究に役立ちます。...

血栓プロファイリングアッセイ:生体力学的血栓形成を包括的に特徴づけるためのマイクロ流体ベースのプラットフォーム

学ぶChandler LoopとRT-FluFFを用いたせん断流下での血栓線維素溶解モニタリング法。流動条件下での血栓構造と溶解効率をリアルタイムで評価し、生理学的関連性の高いin vitroアッセイを構築します。

In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

さらに動画を探す