Name: 透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 学ぶレチナールオルガノイドの透過型電子顕微鏡法サンプル調製法。iPSC由来オルガノイドのシナプス超微細構造をナノスケールで解析し、再現性のある機能的研究基盤を確立します。

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<meta charset="utf8"></head><body>TEM用のレチナールオルガノイドサンプル調製のための最適化されたプロトコール

<ol><li>Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+pluripotent+stem+cells+to+model+and+treat+inherited+degenerative+diseases+of+the+outer+retina%3A+3d-organoids+limitations+and+bioengineering+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions.</a> Cells. 10 (9), 2489(2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribbon+synapses+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Ribbon synapses of the retina.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Webvision%3A+The+organization+of+the+retina+and+visual%22">Webvision: The organization of the retina and visual</a>. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. , University of Utah Health Sciences Center, Webvision. Salt Lake City (UT). (1995).</li>
<li>Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+maintenance+and+restoration+in+the+retina+by+ngl2%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2.</a> Elife. 7, e30388(2018).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746 (2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
<li>Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-chip+for+therapy+development+and+fundamental+science%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human-on-chip for therapy development and fundamental science.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).</li>
<li>Chahine Karam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ipsc-derived+retinal+organoids+and+retinal+pigment+epithelium+for+novel+intronic+rpgr+variant+assessment+for+therapy+suitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability.</a> J Pers Med. 12 (3), 502(2022).</li>
<li>Lo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+for+glaucoma+and+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies.</a> Mol Aspects Med. 94, 101219(2023).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3d+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), 171686(2019).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), e1634 1623-1640 (2020).</li>
<li>Cora, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cleared+view+on+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">A cleared view on retinal organoids.</a> Cells. 8 (5), 391(2019).</li>
<li>Żak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy%E2%94%80development%2C+challenges%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives.</a> Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).</li>
<li>Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+foveola+reinvestigated%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the foveola reinvestigated.</a> PeerJ. 6, e4482(2018).</li>
<li>Syrbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cells+of+the+primate+foveola%3A+An+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study.</a> Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+bipolar+cells+receive+cone+photoreceptor+inputs+through+both+invaginating+synapses+and+flat+contacts+in+the+mouse+and+guinea+pig+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas.</a> J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+rpgra+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish.</a> Front Cell Dev Biol. 11, 1169941(2023).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%CE%B1-synuclein+in+the+mouse+retina+is+confined+to+inhibitory+presynaptic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements.</a> J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+degeneration+of+photoreceptor+synapse+in+ccl2%2Fcx3cr1-deficient+mice+on+crb1%28rd8%29+background%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background.</a> Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).</li>
<li>De Robertis, E., Franchi, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+on+synaptic+vesicles+in+synapses+of+the+retinal+rods+and+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones.</a> J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).</li>
<li>Frey, T. G., Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+internal+structure+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The internal structure of mitochondria.</a> Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+retinal+organoids+recapitulate+disease+features+of+late-onset+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 128(2020).</li>
<li>Afanasyeva, T. aV., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+look+into+retinal+organoids%3A+Methods%2C+analytical+techniques%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications.</a> Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mmペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>10000</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>サンタクルス</td><td>sc-395251</td><td></td></tr><tr><td>銅グリッド</td><td>北京 Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AZH400HH</tr><tr><td>デジタル顕微鏡写真ソフト</td><td>株式会社ガタン</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>StemCell Technologies</td><td>#07913</td><td>細菌プロテアーゼ</td></tr><tr><td>DMEM/F12培地</td><td>Gibco</td><td>#11320033</td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型</td><td>北京中京慶科技有限公司</td><td></td><td></td>GZ10592</tr><tr><td>Epon-812 樹脂</td><td>電子顕微鏡 Science</td><td>#14900</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>#04-0021A</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Shownin Biotechnology Co., Ltd.</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GZ02618</tr><tr><td>L-GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050061</td><td>L-グルタミン代替品</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>CITOTEST</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>シグマ</td><td>71650</td><td>PB/PBS</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>PB/PBSの成分</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Sigma</td> <td>#M7145</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ラボ 双眼生物顕微鏡</td><td>Xsz-107bnii</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</</td><td>sub>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>ブルーパード</td><td>BPG9040A</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 Science</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Semi/ultrathin microtome</td><td>Reichert-Jung</td><td>396649</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td> <td>#T0625</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Sangon Biotech</td><td>E670105-0100</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>日立</td><td>H-7500</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>テッドペラ</td><td>CA96049</td><td></td></tr><tr><td>-メルカプトエタノール</td><td>Σ</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

iPS細胞の分化による3次元ROの確立は、網膜疾患のメカニズムや幹細胞補充療法の研究に強力なツールを提供します。他の研究者は、ROのシナプス結合を機能的および免疫細胞化学的に実証していますが、従来のシナプスとリボンシナプスの直接的な証拠は非常に限られています。ここでは、TEMによってROの2種類のシナプスの超微細構造を調査する方法を紹介します。180日間の培養後、ROを固定、染色、包埋、および極薄スライスしました。TEM観察の結果、OPLに分布する視細胞の軸索終末にリボンシナプスが認められ(図1 、 図2)、それが明らかになった。TEM下では、桿体のリボンがシナプス陥入の周囲に広がり、水平な細胞を持つ馬蹄形のプロファイルを形成します(図1)。通常、ロッドにはリボンが 1 つしかありませんが、コーンには複数のリボンがあります (図 2)。さらに、IPLのアマクリン細胞間に古典的な化学シナプスが観察されました(図3)。TEM下では、化学シナプスはシナプス前、シナプス間隙、シナプス後という3つの部分で構成されています。シナプス前部分とシナプス後部分に対応する細胞膜は、他の部分よりもわずかに厚く、2つの膜の間の狭い隙間をシナプス間隙と呼びます。シナプス前膜部位の細胞質には多くのシナプス小胞があります。この研究は、iPS細胞に由来する3D ROに完全なシナプス結合が存在することを確認しています。ただし、ステップ間のすすぎが不完全であると、サンプル調製の過程で黒い粒子が沈殿することになることに注意してください(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig01.jpg"> 図1:ROのロッドリボンシナプスのTEM画像(A、B)ロッドと水平セルは馬蹄形のプロファイルを形成します。ROのOPLの各ロッドスフェルールに単一のリボン(矢印)が観察され、多数の小胞に囲まれていました。スケールバー = 0.2 μm。略語:ROs =網膜オルガノイド;HC = 水平セル;OPL =外側のプレキシフォーム層。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig02.jpg"> 図2:ROのコーンリボンシナプスのTEM画像。 3つのリボンシナプス(矢じり)は、ROのOPLの円錐形椎弓根で明らかでした。スケールバー = 0.2 μm。略語:TEM =透過型電子顕微鏡;ROs = 網膜オルガノイド;OPL =外側のプレキシフォーム層。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig03.jpg"> 図3:ROの化学シナプスのTEM画像。 従来の化学シナプスが、ROのIPL層のアマクリン細胞間で観察されました。化学シナプスは、シナプス前、シナプス間隙、シナプスの3つの部分で構成されています。シナプス前膜部位の細胞質には多くのシナプス小胞があります。矢印はシナプス伝達の方向を示し、1つのAC1プロセスから別のAC2プロファイルへの多数の小胞の移動を示します。スケールバー = 0.2 μm。略語:TEM =透過型電子顕微鏡;ROs = 網膜オルガノイド;IPL =内側のプレキシフォーム層;AC=アマクリン細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66590/66590fig04.jpg"> 図4:サンプル調製の過程で発生する可能性のある問題の例。 ステップ間のすすぎが不完全であるため、円錐形の茎には黒い粒子(円)がたくさんあります。矢印:リボンシナプス。スケールバー = 0.2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66590/66590fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ヒト以外の霊長類は、開発と老化の理解のための重要な並進種です。霊長類の網膜の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することがあります。...

脳へのゲートウェイ：霊長目の解剖

このビデオの記事では、器官型網膜wholemount文化や外因性誘導効果の分析のためのサイトスピン手順の確立を示しています。器官型網膜wholemount文化模倣体...

生体のような器官型マウス網膜Wholemountの文化で

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

本研究は、外植物の取り扱い中にレチナル完全性を損なうことを防ぐ新しいヒトの妄想性レチナルカルチャー(HORC)モデルの開発を目的としている。これは、上層の色素および下層の網膜色素上皮-脈絡膜(RPE-脈絡膜)および皮膜で網膜を培養することによって達成される。...

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

ここでは、成熟ヒト網膜オルガノイドを生成し、それらを光受容体毒性アッセイに利用して、加齢性網膜変性疾患黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)の医薬品候補を特定するための段階的なプロトコルを紹介します。...

創薬のためのヒト網膜オルガノイドの毒性スクリーニング

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。...

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

このプロトコールでは、迅速で再現性の高い内胚葉性肝オルガノイド(eHEPO)の生成について説明します。このプロトコルにより、eHEPOは2週間以内に産生され、その差別化と機能を失うことなく長期(1年以上)に拡大することができます。...

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

このプロトコルでは、網膜のシナプス回路とタンパク質の局在の探索に焦点を当てて、免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みの詳細な手順を概説しています。...

免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みによる網膜回路と分子局在の研究

このプロトコルでは、網膜光受容体末の構造的特徴に焦点を当てて、体積電子顕微鏡用の網膜サンプルを調製するための詳細な手順について説明します。...

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

このプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を組み合わせて、ホールマウント網膜オルガノイドの全容積共焦点イメージングを実現します。3D構造を保持し、主要なニューロン経路の詳細な視覚化を可能にし、網膜の成熟、空間構成、および疾患モデリングや個別化医療への応用の可能性の研究を改善します。...

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

学ぶレチナールオルガノイドの透過型電子顕微鏡法サンプル調製法。iPSC由来オルガノイドのシナプス超微細構造をナノスケールで解析し、再現性のある機能的研究基盤を確立します。

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

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