Name: 合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶ無細胞タンパク質合成システムを用いた合成細胞構築法。マイクロ流体デバイスとGUVsを活用し、膜タンパク質の機能解析や非標準アミノ酸導入によるタンパク質工学を可能にする革新的な手法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>マイクロコンパートメント化合成細胞のためのCFPSプロトコル

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (ナトリウム塩)(DOPS)</td><td>Avanti</td><td>840035P</td><td></td></tr><tr><td>1,4 dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.11474</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>3,5-サイクリックAMP(cAMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>50 mLチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Tubes BioBased</td><td></td></tr><tr><td>50%過酸化水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>寒天粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>アラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4349</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Stirred Cells</td><td>MerckMillipore</td><td>UFSC05001</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate (NH4OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7262</td><td></td></tr><tr><td>Arginin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4474</td><td></td></tr><tr><td>Asparagin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>Aspartat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5474</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>ロシュ</td><td>11140965001</td><td></td></tr><tr><td>Atto 488 DOPE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67335</td><td></td></tr><tr><td>Atto 647N DOPE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42247</td><td></td></tr><tr><td>バッフル三角フラスコ</td><td>シュニウ</td><td>250 mL, 1000mL</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>ロシュ</td><td>10711454001</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>エッペンドルフ</td><td>エッペンドルフ チューブ 3810X</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機ラック</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030119819</td><td></td></tr><tr><td>化学発光および落射蛍光イメージングシステム</td><td>Uvitec</td><td>Alliance Q9 Advanced</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡 (LSM)</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo Scientific</td><td>Menzel BB02400500A113MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンキナーゼ (CK)</td><td>Roche</td><td>10127566001</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンリン酸 (CP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10621714001</td><td></td></tr><tr><td>培養皿</td><td>Huanqiu</td><td>90 mm</td><td></td></tr><tr><td>Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5360</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5'-三リン酸二ナトリウム塩(CTP)</td><td>アラジン</td><td>C101487</td><td></td></tr><tr><td>透析膜</td><td>スペクトル</td><td>標準RCチューブMWCO:12-14 kD</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A.サイクルピュアキット</td><td>オメガバイオテック</td><td>D6492-01</td><td></td></tr><tr><td>電気加熱常温耕運機</td><td>Yiheng機器</td><td>DHP-9602</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>バイオシャープ</td><td></td><td></td>1100027</tr><tr><td>蛍光板リーダー</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>フッ素化油</td><td>蘇州 CChip 科学機器</td><td>2%HFE7500</td><td></td></tr><tr><td>フォリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>フレンチプレス</td><td>G.Heinemann</td><td>HTU-DIGI-Press</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>グルタマット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5667</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5792</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 5'-三リン酸ナトリウム塩水和物(GTP)</td><td>ロシュ</td><td>10106399001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep Q FF 16/10</td><td>Cytiva</td><td>28936543</td><td></td></tr><tr><td>ヒスチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>イソロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5281</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル-&amp;β;-D-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6914</td><td></td></tr><tr><td>Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>酢酸マグネシウム四水和物 (Mg(OAc)2 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>メチオニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8439</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Multipurpose Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>核酸 &amp;タンパク質UVアッセイ測定</td><td>IMPLEN</td><td>NanoPhotometer N60</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kit for transfection-grade plasmid DNA</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740414.5</td><td></td></tr><tr><td>Nunc-Immuno MicroWell 96ウェルポリスチレンプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8616</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler nexus</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>フェニルラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8740</td><td></td></tr><tr><td>ホスホエノールピルバット (PEP)</td><td>GLPBIO</td><td>GC44635</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 8000 (PEG 8000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム (KOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸カリウム(K-グルタミン酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム(KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8865</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸キナーゼ(PK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>Serin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4311</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>Zhichushakers</td><td>ZQZY-AF8</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>アラジン</td><td>S112226</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Jinteng</td><td>0.45 μm</td><td></td></tr><tr><td>試験管</td><td>Shuniu</td><td>20 mL</td><td></td></tr><tr><td>TGX FastCast アクリルアミドキット, 12%</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610175</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Threonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8441</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>トリプトファン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8941</td><td></td></tr><tr><td>チロシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>UTP 三ナトリウム塩 (UTP)</td> <td>アラジン U100365</td><td></td><td></td></tr><tr><td>循環水システム付き真空ポンプ</td><td>鄭州 万里の長城 科学 産業および貿易 Co.Ltd</td><td>SHB-<img alt="方程式1" src="/files/ftp_upload/66626/66626eq01.jpg" style="margin: auto;"></td><td></td></tr><tr><td>Valin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4638</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixers</td><td>Kylin-Bell</td><td>Vortex QL-861</td><td></td></tr><tr><td>浄水システム</td><td>MerckMillipore</td><td>直接超純水(タイプ1)</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>&amp;β;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

細胞抽出物とT7 RNAポリメラーゼの新しいバッチごとに、Mg2+ とK+ の両方の濃度の基本的なスクリーニングを実施して、CFPSシステムの最適な性能を確保することをお勧めします。スーパーフォルダーGFPの蛍光は、 図1A、Bに示すように、さまざまな条件下でのCFPSシステムの全体的な収量の指標として役立ちます。さらに、異なるコンパートメント間でのCFPSシステムの並行収率比較を 図1Cに示し、スクロース46の影響によりGUVがわずかに減少するものの、カプセル化されたCFPSシステムで一貫した性能を示しています。さらに、CFPS反応は、液滴(図2)、GUV(図3)、およびSLB上(図4)にカプセル化されることに成功しました。
図2A は、油溶液が乱流になったときに明らかなエマルジョン液滴の形成を強調しています。緑色/赤色蛍光タンパク質(GFPおよびmCherry)の発現は、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて捕捉しました。 図3 は、単純なエマルジョン転写プロセスによるGUV内のCFPS反応のカプセル化の成功を示しています。赤いチャネルは、標識された脂質を示しました。緑のチャンネルはスーパーフォルダGFPの表現を示しました。黄色のチャンネルは不活性な蛍光色素を表していました。 図4A は、CFPS反応を堆積させることができるSLBチャンバーを示しています。このチャンバー内では、ガラスカバーガラスの上にSLBを形成し、CFPS反応混合物を予め形成されたSLBの上に配置することで、共焦点レーザー走査型顕微鏡によるイメージングを可能にしました。 図4Bに示すように、SLBは標識脂質(緑色)で可視化され、mCherryと融合した発現した低分子GTPアーゼCdc42はマゼンタで示されています。mCherry-Cdc42の in-situ 発現は、可逆的なメンブレンターゲティングプロセスとともに、顕微鏡下で観察できました。しかし、利用されたCFPSシステムは、最近の出版物47で詳述されているように、プレニル化機械によって補完された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig01.jpg"> 図1:CFPSシステムの最適化と比較。 CFPSシステムの(A)Mg2+ 濃度および(B)K+ 濃度のバルクでのスクリーニング。(C)異なるコンパートメントでのタンパク質発現収量を示す棒グラフ。スーパーフォルダーGFPの蛍光を使用して、プレートリーダーまたは共焦点レーザー走査型顕微鏡で測定したCFPSシステムの収率を決定しました。略語:CFPS =無細胞タンパク質合成;GFP = 緑色蛍光タンパク質;sfGFP = スーパーフォルダGFP;GUV =巨大な単層小胞;SLB = 担持脂質二重層。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig02.jpg"> 図2:液滴中での無細胞タンパク質合成 (A)界面活性剤で安定化された油中水滴中のカプセル化されたCFPS反応の写真。(B)共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化された液滴に封入された(C)mCherryおよび(D)スーパーフォルダーGFPのCFPSの明視野および(C,D)蛍光画像。スーパーフォルダ GFP は緑色で示されます。mCherryはマゼンタで表示されます。スケールバー = 20 μm。略語:CFPS =無細胞タンパク質合成;GFP = 緑色蛍光タンパク質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig03.jpg"> 図3:GUVにおける無細胞タンパク質合成 (A)GUVにおけるカプセル化されたCFPS反応の写真。(B-D)POPC GUV内にカプセル化されたCFPSの蛍光像で、スーパーフォルダGFPを発現しています。(B)脂質二重層は、0.05%標識されたAtto647N-DOPE脂質で標識され、赤色で示され、(C)不活性色素は黄色で示され、(D)スーパーフォルダーGFPは緑色で示されました。スケールバー = 20 μm。略語:CFPS =無細胞タンパク質合成;GFP = 緑色蛍光タンパク質;GUV =巨大な単層小胞;POPC = 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロール-3-ホスホコリン;DOPE = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66626/66626fig04.jpg"> 図4:SLB上の低分子GTPaseタンパク質-Cdc42の無細胞タンパク質合成 (A)共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化された、SLB上のCdc42の膜ターゲティングとRhoGDI依存性膜抽出の再構成の概略図。プレニル化機構は、プレンリトランスフェラーゼ濃縮抽出物を介して実施されましたが、これについては他の場所で詳しく説明しています。47. (B) SLBの上の反応混合物のプレニル化前およびプレニル化後の直交図。(C,D)(C)メンブレンターゲティングおよび(D)メンブレン抽出中のメンブレン(ピンク)および溶液中(黒)のmCherry-Cdc42強度の時系列。スケールバー = 10 μm. (A-D) は Kai et al.47 から採用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1: バッファーの一覧。 注:使用直前にβ-メルカプトエタノールとDTTを添加してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:Mg2+濃度スクリーニングのピペッティングスキーム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%202_rev.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表3:K+濃度スクリーニングのためのピペッティングスキーム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%203_rev.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表4:内部溶液の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%204_rev.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表5:外部溶液の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%205_rev.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表6:プリインナー溶液の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66626/66626_Table%206_rev.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for ...

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Research

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