Name: 若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶ Drosophilaを用いた経験依存的シナプスリモデリングの分子メカニズム。嗅覚刺激によるシナプスグルメルリの可塑性変化と、神経膠細胞の役割を解明する手法を紹介します。

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<meta charset="utf8"></head><body>ショウジョウバエの若年脳における嗅覚体験誘発性シナプスリモデリング

<ol><li>English, S., Barreaux, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+sensitive+periods+in+development%3A+insights+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Behav+Sci%22%5BJournal%5D)">The evolution of sensitive periods in development: insights from insects.</a> Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).</li>
<li>Fabian, B., Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+in+the+olfactory+system+of+Drosophila+melanogaster+and+other+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Fron+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects.</a> Fron Cell Neurosci. 17, 1130091(2023).</li>
<li>Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+exposure+causes+central+adaptation+and+morphological+changes+in+selected+olfactory+glomeruli+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila.</a> J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).</li>
<li>Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+in+the+olfactory+pathway+of+adult+Drosophila+take+place+at+a+critical+age%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age.</a> J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).</li>
<li>Sachse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+local+GABAergic+interneurons+drives+olfactory+habituation%5BTitle%5D)+AND+%22Pro+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation.</a> Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).</li>
<li>Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+is+required+in+adult+Drosophila+sensory+neurons+for+morphological+and+functional+plasticity+of+the+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit.</a> PLoS Genet. 11 (5), e1005244(2015).</li>
<li>Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+remodeling+of+Drosophila+olfactory+sensory+neuron+brain+innervation+during+an+early-life+critical+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period.</a> J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).</li>
<li>Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+FMRP+roles+in+experience-dependent+remodeling+of+olfactory+brain+innervation+during+an+early-life+critical+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period.</a> J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).</li>
<li>Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerulus-selective+regulation+of+a+critical+period+for+interneuron+plasticity+in+the+drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe.</a> J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).</li>
<li>Stephan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Psidin+regulates+olfactory+neuron+number+and+axon+targeting+through+two+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (46), 16080(2012).</li>
<li>Doll, C. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+FMRP+requirements+in+development+of+the+neural+circuitry+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory.</a> Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).</li>
<li>Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+one-step+dissection+protocol+for+whole-mount+preparation+of+adult+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (118), e55128(2016).</li>
<li>Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+axon+targeting+of+Drosophila+olfactory+receptor+neurons+specified+by+the+proneural+transcription+factors+Atonal+and+Amos%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos.</a> Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+fragile+X+mental+retardation+protein+activates+glial+insulin+receptor+mediated+PDF-Tri+neuron+developmental+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance.</a> Nat Comm. 12 (1), 1160(2021).</li>
<li>Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+odors+at+naturally+occurring+concentrations+triggers+limited+plasticity+in+early+stages+of+Drosophila+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing.</a> eLife. 12, 85443(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>臭気曝露用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアル</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>32-110</td><td></td></tr><tr><td>酪酸エ</td><td>チル Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>臭気室</td><td>グラスロック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペイント ブラシ</td><td>ウィンザー &ニュートン</td><td>シリーズ233</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS37440</td><td></td></tr><tr><td>金網</td><td>Scienceware378460000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脳解剖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール、190プルーフ</td><td>デコンラボ</td><td>280170</td><td>%に希釈</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-30</td><td>デュモン#5</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>157-8</td><td>4%</td></tr><tr><td>シャーレ</td>に希釈 <td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>70011-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>スクロー</td>スフィ<td>ッシャーサイエンティフィックに希釈&nbsp;</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>シルガード</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Brain Immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 ヤギ抗ニワトリ</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>546 ヤギ抗ラット</td><td>Invitrogen</td><td>A11081</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>チキン アンチ GFP</td><td>アブカム</td><td>13970</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>アバンター</td><td>48366-067</td><td>25 x 25 mm</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>スコッチ</td><td>34-8724-5228-8</td><td></td></tr><tr><td>フルオロマウント-G&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-2</td><td>75 x 25 mm</td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>サリー・ハンセン</td><td>109</td><td>エクストリームウェア、目に見えない</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗CadN</td><td>発達研究 ハイブリドーマバンク</td><td>AB_528121</td><td></td></tr><tr><td>共焦点/分析</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>任意のコンピューター/ラップトップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zeiss 510 META&nbsp;</td></tr><tr><td>フィジーソフトウェア</td><td>フィジー</td><td></td><td>バージョン2.14.0 / 1.54f</td></tr></tbody></table>

若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period

図1 は、嗅覚経験依存性の臨界期匂い物質曝露と脳イメージング法のワークフローを示しています。このプロトコールは、脱皮直前のファレートダークサナギの年齢マッチングから始まります(図1A)。蛹を4時間匂いチャンバーに入れ、次に新たに閉じた成体をビヒクルコントロールまたは投与されたEB臭気チャンバーのいずれかで新鮮なバイアルに入れます(図1B)。通常、臭気物質に24時間さらしますが、任意の期間も可能です。匂い物質への曝露後、脳の解剖は、胸部から頭部を切除し、次に細い鉗子でキューティクル外骨格を切除することから始まります(図1C)。分離された脳は、イメージングを妨げる可能性のある関連組織をすべて取り除き、すぐにPBSの4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースに固定します。脳組織の良好な完全性のためには、30分の短い固定で十分です。免疫細胞化学プロトコールは、1時間のブロック(BSA、NGSなど)から始まり、一次抗体(抗GFP、-CadNなど)で一晩インキュベートし、その後、二次抗体で2時間の短時間のインキュベーションを行います(図1D)。標識された脳は、触角葉の最適なイメージングのために、脳の背側表面を上にして、密封されたカバーガラスの下のスライドガラスに取り付けられます(図1E)。すべてのサンプルは、後でデコードするためにスライドにコード化された指定をマークすることにより、遺伝子型と経験条件の両方を知らされていないことに注意してください。63倍の油浸対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、脳の中枢触角葉を画像化します(図1F)。使用する蛍光色素に最適なレーザーライン(Argon 488やHeNe 543など)を選択し、周囲の糸球体のコンテキストでVM7のOr42a嗅覚ニューロン神経支配を画像化します。
VM7糸球体におけるOr42aニューロン神経支配のZスタック投影全体を捉えるためには、最適なゲイン、オフセット、イメージング解像度、光学スライスの厚さを選択することが重要です。比較するすべての遺伝子型と経験条件は、同じ顕微鏡設定で画像化されます。ZスタックはImageJソフトウェアを使用して処理され、主に神経支配ボリューム7,14によって評価される経験依存の変化があります。体積計測値を計算するには、2つの方法があります。1つは、ImageJのなげなわ関数を使用してスライスごとに神経支配領域を計算し、次に各値に各スライスの厚さ(μm)8,9を掛けます。もう 1 つは、合計スライス Z 投影を使用し、Z スタック スライスの数にスライスの厚さを掛けて平均ボリュームを決定します。どちらの方法でも一貫した結果が得られます。体積測定に加えて、VM7糸球体16の最大強度投影により蛍光強度も評価できます。すべてのピクセルの加重合計は、ImageJ 合計スライス最大投影によって評価され、各強度レベルのピクセル番号を合計して全体の強度 8,9 を計算します。背景は、同じサイズの糸球体外領域を定量化することで差し引くことができます。この減算法は、各脳サンプルのさまざまなレベルのバックグラウンド抗体標識を考慮し、神経支配蛍光強度値のより代表的な定量を生成するため、より時間がかかりますが、より正確です。強度測定は、Zスタック内の18〜30個の光学スライス(0.37μm/スライス)の一般的な範囲で行われ、各脳16について平均化される。ほぼすべての場合において、神経支配蛍光強度と体積の測定により、一貫した結果が得られます。
すべての測定方法において、代表的な結果は揺るぎないままです。初期のEB臭気物質の経験は、Or42aニューロン神経支配の大幅な喪失をもたらします。VM7糸球体は、正確にマッピングされた他の触角葉嗅覚糸球体(図2A)の中でサイズ、形状、位置によって、また、抗神経カドヘリン(CadN;図 2B)。臭気物質のビヒクル制御(鉱油)に時間ばく露すると、未治療の正常な動物と区別がつかないほどのOr42aニューロン神経支配が起こります。それでも、脱落後最初の数日間のEB臭物質の経験(dpe)は、シナプス糸球体の剪定を引き起こします(図2C)。この剪定メカニズムは、短い初期の重要な時期8,10に完全に限定されています。現在、私たちは通常、24時間の匂い物質曝露を使用して、VM7糸球体のシナプス剪定と、その結果としてのショウジョウバエの幼若脳の神経支配量の減少を評価しています。臭気ビヒクル制御(鉱油)への24時間の曝露(0-1 dpe)は、両脳半球触角ローブ(図2D<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66629/66629fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66629/66629fig03large.jpg" target="_blank"></a>

Early-life olfactory sensory experience induces dramatic synaptic glomeruli remodeling in the Drosophila juvenile brain, which is experientially ...

experience-dependent-remodeling-juvenile-brain-olfactory-sensory

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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