Name: 初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: 学ぶ初代ヒト乳腺上皮細胞の単離培養法。少量組織から効率的にHMECを分離し、ROCK阻害剤Y-27632処理で増殖を促進。肉芽腫性乳腺炎の病態解明と治療開発への応用が期待される革新的プロトコルを解説します。

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この研究は、中国浙江省のTCM科学技術プログラム(2017ZA055;2018ZA036)、および中国貴州省遵義市科学技術プロジェクト(遵義市克河支援NS(2020)第18号)からX.Xu.著者らは、細胞培養トレーニングを提供してくれたYoujia(Hangzhou)Biomedical Technology Companyの分子生物学研究所に感謝します。

このプロトコルで使用される新鮮な正常な乳腺組織は、浙江中医科大学の最初の付属病院の医療倫理委員会のガイドラインに従って、浙江中医科大学の最初の付属病院の難治性肉芽腫性小葉性乳房炎の病変の周りの手術から収集されます(プロトコル番号。ChiMCTR2100005281、日付:2017-07-17)。
1. ティッシュの採取
<ol><li>成人女性から採取した手術標本から新鮮な乳腺組織を、10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 3% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) を含む 滅菌チューブに採取します。 注:乳腺組織は、手術からの収集後24時間以内に、次の詳細に従って取り扱う必要があります。</li>
</ol>2.組織の前処理
<ol><li>2対の鉗子で乳腺組織から脂肪組織を取り出し、残りの乳腺組織の重量が~1gであることを確認します。</li>
	<li>乳房組織を75%エタノール溶液(5 mL)で5秒間すすぎ、次に20 mLの洗浄液(表1)で2 x 5分間洗浄します。.</li>
</ol>3.組織の消化
<ol><li>乳腺組織を小さな断片にスライスし、2つの外科用ブレードを使用して組織を15分間細断して、組織ホモジネートを取得します。組織片を50 mLの遠心分離チューブに移します。</li>
	<li>10 mLの5.0 mg/mLディスパーゼ+5.0 mg/mLコラゲナーゼ溶液、3 mLの0.25%トリプシン、および7 mLのPBSを、乳腺組織断片を含む50 mLの遠心チューブに合計20 mLの消化溶液に加えます。チューブを37°Cのウォーターバスに入れ、1.5時間インキュベートします。チューブを20分ごとに振ってください。</li>
	<li>20mLの中和液を注入して消化プロセスを停止します。~15回ピペッティングして内容物を混合します。</li>
	<li>混合物を100μmメッシュフィルターでろ過します。156 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を取り除き、20 mLの中和溶液でペレットのインキュベーションを繰り返します。内容物を15倍ピペッティングして混合し、156 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを10 mLの初期培養培地で再懸濁します。細胞懸濁液を100 mmの細胞培養皿に播種します。</li>
	<li>5% CO2 インキュベーターで細胞を37°Cで培養します。 元の培地を3日ごとに新鮮な上皮細胞培地と交換します。細胞を確認し、2日ごとに培地を更新してください。</li>
</ol>4. 細胞継代
<ol><li>細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、インキュベーターから100 mmディッシュを取り出し、使用済みの培地を廃棄し、2 mLのPBSでディッシュを2回すすいでください。PBSを取り出し、100 mmの各皿に2 mLの0.05%トリプシンを加えます。. 注意: トリプシン溶液が皿の底に十分に接触していることを確認するために、皿を回転させます。</li>
	<li>100 mmディッシュを37°Cのインキュベーターに~7分間入れて、消化プロセスを行います。</li>
	<li>40倍対物レンズを使用して顕微鏡で細胞を検査し、ほとんどの細胞が皿の底から解離していることを確認します。</li>
	<li>8 mLの中和溶液を加えて消化プロセスを停止し、細胞を15 mLチューブに移します。ピペッティングで10〜15倍に動かして細胞を混合します。細胞を156 × g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、10mLの上皮細胞培地で細胞を再懸濁し、細胞数を数えます。</li>
	<li>100 mmディッシュ中の10 mLの上皮細胞培地に1 × 106細胞を加え ます。</li>
	<li>上皮細胞培地をリフレッシュし、2日ごとに細胞を観察します。</li>
</ol>5. 細胞凍結保存
<ol><li>手順4.1〜4.4を繰り返します。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、細胞を2 mLの細胞凍結保存溶液に再懸濁します。</li>
	<li>細胞を含む凍結保存溶液1 mLを各極低温バイアルに移します。</li>
	<li>凍結保存された細胞の名前、継代番号、および日付を記録します。</li>
	<li>バイアルを制御速度の凍結容器に-80°Cで一晩置きます。</li>
	<li>-80°Cの冷凍庫から極低温バイアルを取り出し、液体窒素にすばやく移して長期保存します。</li>
</ol>

人間のティッシュからの乳腺の上皮細胞を単離するためのプロトコル

<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoepithelial+cells%3A+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li>
<li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women%27s+breast+cancer+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li>
<li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+rat+mammary+gland%3A+Isolation%2C+characterization%2C+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).</li>
<li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselective+secondary+tissue+attachment%26%2334%3B+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A &#34;selective secondary tissue attachment&#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978(2021).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li>
<li>Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologe%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li>
<li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li>
<li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li>
<li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li>
<li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).</li>
</ol>

著者らは、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。

HMECは、乳腺組織の解剖学的および機能的完全性を維持するのに不可欠であり、科学的調査、臨床実施、および関連ドメイン15に有用です。初代上皮細胞は、継代が限られ、寿命が短い特殊な細胞の一種です。しかし、HMECの成長は技術的な制約によって妨げられており、その結果、乳がんや乳房に関連する他の炎症性疾患の研究の進歩が妨げられてきました16。
そのため、新鮮な乳腺組織からHMECを得るための安定的で実現可能かつ効率的な方法の開発が急務となっています。Hammond et al.8 と Band and Sager17 は、乳房上皮細胞の抽出と培養に成功しました。しかし、必要な培地の組成は過度に複雑でした。Taylor-Papidamitriouらによる以前の研究では、成長因子と血清18を添加した培地を使用して母乳の腔細胞を培養できることが示されました。この手法では、母乳からHMECを直接抽出することができますが、非上皮細胞の存在はHMECの成長に影響を与える可能性があり、細胞数を正確に測定することは困難です。Jinらは、従来の培養法と比較して、一次HMECのライフサイクルが長く、細胞の不均一性を保持することを可能にする条件付きリプログラミング法を開発したが、特定の培養条件に大きく依存し、他の研究室やアプリケーションでのこの方法の使用を制限した12。
Zubeldia-Plazaolaのグループによる研究では、コラゲナーゼとヒアルロニダーゼの混合物によるミンチ組織断片のゆっくりとした消化(一晩)と、その後の2日目に3回の分画遠心分離を行い、間質/上皮画分を分離するという最適化された単離法を確立した。この単離法に加えて、培養物にY-27632を添加することで、多数の生存上皮細胞が得られました。しかし、彼らの研究で使用された乳腺組織の量は40〜75gであり、分離手順はほぼ2日間続きました9。ここでは、このプロトコルでわずか1gの組織を使用したことを報告し、この方法がわずか0.25gの組織でも有効であることをテストした結果、効果があることを発見しました。コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシンの酵素混合物は、1.5時間で1gの組織を効率的に消化し、全体の手順には~3時間かかりました。初期培養培地へのY-27632の添加は、上皮細胞の接着および増殖を促進することができるが、間質細胞の増殖も阻害することができる19。重要なことに、この研究では、初期培地の成分をテストし、以前の出版物で使用されたG培地を置き換えるDMEM中の5%FBSが、表皮細胞の接着と成長を促進するのに十分であることを発見しました10。
最初の培地で2日間培養した後、細胞を無血清ケラチノサイト培地で培養しました。接種後の初期培養(P0)の細胞増殖パターンを 図2に示すのは、コロニーの増殖パターンを示しています。この単離法では、乳腺組織由来の筋上皮細胞を含む、あらゆる種類の上皮細胞が得られる可能性が高く、将来的にはさらに特性評価する必要があります。それにもかかわらず、Y-27632の存在下での細胞の増殖を、初期培養培地にY-27632を添加せずに対照群と比較することにより、Y-27632を用いた方法が細胞産生を有意に増強し、細胞培養の効率を向上させたことがわかりました(図2A)。通常、接種後9~10日間の培養で、表皮細胞は継代に適した密度を達成できます。さらに、Y-27632の存在が、初期培養終了時に凍結したP0細胞を回収した後、P1 HMECの増殖を促進する可能性があることも示しました(図3)。私たちの手では、細胞の90%以上が冷凍保存から解凍された後も生き残ることができたことがわかりました。細胞の倍加時間は約72時間で、HMECは7継代目まで正常な増殖を維持することができました。
この研究では、細胞は乳腺上皮細胞マーカーCK7およびGATA3を高レベルで発現し、重要なことに、初期培養後期の細胞のほぼ100%がCK7およびGATA3に対して陽性であり(図4)、この方法で得られた上皮細胞の純度が高いことを示しました。最後に、この研究では、P0細胞とP3細胞におけるCK7とGATA3の発現レベルを比較し、両方で高い発現レベルを明らかにし、継代が細胞の表現型を変化させないことを示唆しました(図5A、B)。さらに、Y-27632の存在にかかわらず、CK7およびGATA3は一貫して高発現しており、Y-27632の添加は細胞表現型に影響を与えなかったことが示唆されました(図5C、D)。
我々のアプローチによる細胞増殖の増強の主な原因は、ヒト上皮細胞の増殖および特殊化に有利な影響を与えることが示されているY−27632の包含である19,20。Chapmanらは、Y-27632を使用すると、上皮細胞の増殖能力が有意に向上し、細胞危機の兆候なしに細胞の無死化に成功したことを発見した21。我々の研究では、Y-27632は、それらの接着および増殖を増強することにより、これらの上皮細胞の収量を有意に増加させた19。
この方法の1つの重要な特徴は、ディスパーゼとコラゲナーゼを組み合わせて結合組織から上皮組織を分離することであり、同時にトリプシンを使用して上皮組織から上皮細胞を解離させることである22。ディスパーゼは、上皮細胞の生存能力を維持しながら、真皮から損傷を受けていない表皮、および培養中の損傷を受けていない上皮細胞の層を下層から分離するための迅速かつ効率的でありながら穏やかな酵素であることが証明されています23。I型コラゲナーゼは、上皮細胞の単離を促進し、細胞の活力と完全性を確保する24。この方法のもう一つの重要な特徴は、Y-27632を含む初期培地を使用して、新たに分離されたHMECを培養することです。3日目に細胞が皿に付着した後、培養液をケラチノサイト無血清培地に変更します。このアプローチにより、実験のステップが著しく簡素化され、実験のコストが削減されます。その結果、この方法では少量の乳腺組織のみを用いて非常に満足のいく細胞数を得ることができ、これは大量の初期組織を必要としないことを示しています。ただし、このアプローチの1つの欠点は、トリプシンの存在が上皮細胞の完全性を適切に保護しないことです。この方法の別の潜在的に制限的な側面は、初期培養中に筋上皮細胞の小さな(<1%)汚染の可能性である9。
私たちの方法は、成体乳組織に由来する一次HMECを単離および培養するための合理的で効率的なアプローチを提供します。この技術は、その単純さ、時間の節約、および基本的な細胞機能を維持する能力によって特徴付けられます。したがって、この手法には明確な利点があり、かなりの量の上皮細胞を生成するために非常に有望です。さらに、この方法は、幅広いドナーからのHMECの分離と培養を可能にし、実験室での研究と臨床応用の両方に適しているため、非常に汎用性が高く、広く適用できます。

乳がんは、世界中の女性に診断される主要ながんの種類であり、がんによる主な死因です1。乳がんの病因は複雑で、遺伝学、環境、生活習慣など複数の要因が関与しています。HMECs(活性乳産生細胞)は、乳腺組織の最も重要な構成要素の1つであり、乳がんの発がんに関与する元の細胞である可能性が高いです。したがって、HMECは乳がんの研究で研究者から最も注目を集めています2。さらに、初代細胞は、遺伝的安定性、正常な形態、および不死化細胞株3では達成できない基本的な細胞機能のより完全なセットの保持により、複雑な細胞プロセスの生物学的に関連性のある特性評価を提供する能力を有する。したがって、初代HMECの単離と培養は、乳がんや乳房炎症性疾患などのほとんどの乳房関連疾患の研究に不可欠なステップです。
現在、ラット、ウシ、ブタ、およびヤギからの乳腺上皮細胞の単離、培養、および同定のための安定で再現性のあるシステムが確立されている4,5,6,7。しかし、初代HMECの単離と培養は、複雑な微小環境と細胞の低収率のために困難です。何十年もの間、科学者たちはHMECを分離して培養するための最も効果的な方法を探してきましたが、HMECの培養システムは20年近く前に確立されました。例えば、Hammondらは、HMECが効率的に増殖する無血清培地を開発した8。最近、Zubeldia-Plazaolaらは、高速/低速酵素消化手順と逐次ろ過または示差遠心分離ステップを組み合わせて4つの異なる分離法を試験し、HMEC9を取得しました。その結果、ゆっくりとした消化法と示差遠心分離が、新鮮な乳房組織からHMECを分離する最も効率的な方法であることを発見しました。ただし、この分離法では、大きな組織片(40〜75 g)が必要であり、大量の消化酵素を使用します。その手順は複雑で(異なる細胞画分を得るために少なくとも3つの異なる遠心分離を行う)、時間がかかる。したがって、研究および臨床応用のために少量の乳腺組織からHMECの集団を効率的に取得するには、簡単で迅速な方法が依然として必要です9。
我々の先行研究は、初期培地にRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y−27632を添加すると、ヒト皮膚表皮細胞10の単離プロセスを簡素化できることを示しており、これは歯肉上皮細胞11の単離にも成功裏に使用されている。さらに、Zubeldia-PlazaolaのグループとJinのグループが実施した以前の研究では、Y-27632が乳腺組織に由来する初代上皮細胞の迅速かつ無制限のin vitro増殖を刺激する能力を有することが示されています9,12。本研究は、Y-27632を用いることでHMECの単離と培養が容易になるかどうかを検討することを目的としており、乳組織の小片(1g)からHMECを簡便に分離する方法を確立することに成功しました。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン</td><td>Basalmedia</td><td>K431010</td><td>HMECs&nbsp; 解離</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>NEST</td><td>081722CK01</td><td>細胞消化用</td></tr><tr><td>100 & micro;mメッシュフィルター</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>HMECsろ過用</td></tr><tr><td>100 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>solarbio</td><td>P1110-100ml</td><td>HMECsの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430829</td><td>細胞遠心分離用</td></tr><tr><td>細胞ストレーナー</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>細胞ろ過</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5404HN133048</td><td>細胞遠心分離機</td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>42820906</td><td>細胞インキュベーション用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I 型</td><td>Merck</td><td>SKU:SCR103</td><td>HMECs分離</td></tr><tr><td>用 Dispase&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>CAS:42613-33-2</td><td>HMECsの分離のために</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>8122622</td><td>中和媒体の成分</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>2556132P</td><td>中和媒体の成分</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>Tecono</td><td>20201033</td><td></td></tr><tr><td>HMECsの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色のための</td>洗浄液ウサギ<td>抗CK7</td><td>abcam</td><td>ab68459</td> HMECsの分化マーカーを確認する</tr>ための<tr>免疫蛍光染色用 抗<td>GATA3</td><td>abcam</td><td>ab199428</td><td>HMECsの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Solarbio</td><td>IY0040</td><td>ROCK阻害剤</td></tr></tbody></table>

初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

乳腺は乳房の基本的な構造であり、生殖に不可欠な役割を果たしています。乳がんをはじめとする乳房関連炎症性疾患の起源細胞であるヒト乳腺上皮細胞(HMEC)が大きな注目を集めています。しかし、研究目的での初代HMECのin vitro での単離と培養は、その高度に分化し、角質化した性質と短い寿命のために困難でした。したがって、HMECを分離して培養するためのシンプルで効率的な方法を開発することは、乳房生物学および乳房関連疾患の研究にとって大きな科学的価値があります。本研究では、Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632を含む5%ウシ胎児血清DMEMで初期培養を行い、酵素混合物と組み合わせた酵素混合物による消化により、少量の乳腺組織から初代HMECを単離し、続いて無血清ケラチノサイト培地で培養増殖することに成功しました。このアプローチは、上皮細胞の増殖を選択的に促進し、細胞収量を最適化します。この方法のシンプルさと利便性は、実験室研究と臨床研究の両方に適しており、これらの重要な研究分野について貴重な洞察を提供するはずです。

図 1 に、この手順の概略を示します。このプロトコルには、酵素の組み合わせ、すなわち、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、およびトリプシンの使用が含まれます。この組み合わせは、上皮シートをその下の線維芽細胞層から剥離し、続いてトリプシンを利用して乳腺上皮細胞を懸濁液に解離させる目的で利用されます。また、初期培地にY-27632を添加することにより、上皮細胞の増殖を効果的に促進した。その結果、この方法では多数のHMECが得られ、平均10日で通過するための要件を満たしています。
単離後の細胞増殖におけるY-27632の重要な役割をテストするために、新たに単離した細胞を2つのグループに分けました:1つのグループに10mMのY-27632を含む初期培地を播種しました(図2A)。他の基は、Y-27632をコントロールグループとして追加せずに、初期培地でめっきしました(図2B)。培養の2日後、両グループの細胞を表皮細胞培地に切り替えました(図1)。 図2から、Y-27632を用いた方法が3日目と比較して、9日目のHMECの数を著しく増加させたことがわかります。HMECは、細胞間に明確な境界と強いつながりを持つ島に似たまとまりのあるグループを形成しました。これらの細胞は、周囲の環境に外側に拡大しました。Y-27632を播種した細胞(図2A)は、対照群の細胞(図2B)よりもはるかに速く成長しました。Y-27632がHMECの増殖を促進することを確認するために、凍結したP0細胞を10 mM Y-27632を添加するまたは添加しないで融解およびプレーティングし、 図3に示すように継代1(P1)細胞を異なる日に収集しました。細胞の生存率および増殖について、Cell Count kit-8(CCK-8)を用いて解析した。 図3に示すように、Y-27632含有培地で処理した細胞の増殖速度は、Y-27632を含まない対照群の細胞の増殖速度よりも有意に高かった。これらのデータをまとめると、初期培地にY-27632を添加すると、単離後の付着細胞の増殖が著しく促進されることがわかります。
この方法で得られた細胞がHMECであることを確認するために、2つの乳腺上皮細胞マーカー(CK7およびGATA3)についてP0 HMECの免疫蛍光分析を行いました。診断的に重要なサイトケラチンであるCK7は、正常な乳腺上皮とその増殖性上皮過程における腺分化のマーカーである13。さらに、Kouros-Mehrらは、GATA3が乳腺上皮細胞内の転写因子として機能し、完全に発達した乳腺の管腔上皮分化の維持に関与していることを報告しています14。 図3に示すように、培養して増殖させた細胞は、CK7(図4A)とGATA3(図4B)の両方を強く発現しています。CK7陽性細胞とGATA3陽性細胞の両方の定量分析では、細胞の98%以上がCK7とGATA3の両方を発現していることが示され(図4C)、線維芽細胞などの他のタイプの細胞の汚染は限定的であることを示しています。初期培養では、限られた数の線維芽細胞様細胞(細長い形態)が観察されることがありましたが(P0、 図2)、継代した細胞にこれらの細胞が現れることはめったにありません(P3、 図4D)。
HMECの上皮特性が数回の継代後も維持できるかどうかを調べるために、Y-27632の有無にかかわらず培養した細胞の乳腺上皮細胞マーカーCK7およびGATA3のqRT-PCR解析を行いました(図5)。CK7とGATA3の両方の発現レベルは、Y-27632の有無にかかわらず、P0細胞とP3細胞の両方で有意差はなく、それらの表現型および分化特性が培養拡大中に経時的に変化しなかったことを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig01.jpg"> 図1:HMECを分離および培養するためのプロトコルのフローチャート。 最初に、女性の乳腺組織の断片を手術用ブレードでスライスし、酵素の組み合わせで消化しました。続いて、得られた細胞ペレットを10mMのY-27632を含有する初期培地で培養した。2日後、最初の培養培地を上皮細胞培地に交換しました。乳腺上皮細胞を表皮細胞培地で培養し、~8日後には満足のいく被覆率を達成し、現在では継代に適しています。必要に応じて、一部の細胞を細胞凍結保存に供することができます。略語:HMECs = ヒト乳腺上皮細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig02.jpg"> 図2:初回接種後に得られたHMECの画像。 接種後2日以内に、(A)一次HMECをY-27632を含む初期培地で培養し、(B)一次HMECをY-27632を含まない初期培地で培養しました。48時間の培養期間の後、無血清ケラチノサイト培養培地を両群で交換した。細胞の増殖状況を1日おきに記録するために写真を撮影しました。代表的な画像群は、いずれも接種後3日目、5日目、9日目に倒立顕微鏡(100倍)を用いて撮影したものです。スケールバー = 100 μm。略語:HMECs = ヒト乳腺上皮細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig03.jpg"> 図3:Y-27632によるPassage 1 HMECs(P1)の成長促進。 凍結したP0細胞を解凍し、Y-27632の有無にかかわらず培養しました。細胞(P1)を1日、3日、5日、7日、9日で採取し、CCK-8キットを用いて450nmで吸光度を分析しました。1日目に、Y-27632を含有する初期培地中の接着生存細胞の数は、Y-27632を含まない細胞よりも有意に多かった。さらに、Y-27632で処理した細胞の成長曲線は、より急峻な増加を示しました。**p &lt; 0.01、***p &lt; 0.001.略語:HMECs = ヒト乳腺上皮細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig04.jpg"> 図4:HMECマーカーの発現(P0)。 HMECにおけるCK7およびGATA3の発現を免疫蛍光染色により解析しました。HMECは、(A)CK7(赤)および(B)GATA3(赤)について染色しました。DAPI(青)を用いて核を染色しました。画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡(400倍)を使用して撮影しました。スケールバー = 20 μm. (C) 染色中の陽性細胞の割合;(D)HMECの代表画像(P3)。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig05.jpg"> 図5:P0およびP3におけるHMECのCK7およびGATA3の発現。 qRT-PCRを使用して、7日目にP0およびP3のHMECにおける(A)CK7、P0およびP3のHMECにおけるGATA3、(C)7日目にY27632の有無にかかわらず培養したP1 HMECのCK7、(D)7日目にY-27632の有無にかかわらず培養したP1 HMECにおけるGATA3の発現を検出しました。 NSP &gt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本研究は、少量の乳腺組織から初代ヒト乳腺上皮細胞(HMEC)を効率的に分離し、増殖するための、より簡単で時間を節約し、経済的なプロトコルを報告しています。このプロトコールは、実験室および臨床アプリケーションの両方で一次HMECを迅速に製造するのに適しています。

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

私たちの研究は、難治性肉芽腫性乳房炎の治療手段を解明することに焦点を当てています。伝統的な中国と西洋の医療方法論を同時に組み合わせた統合的なアプローチを活用することで、病気とその合併症を引き起こす複雑な病原性メカニズムが明らかになり、これらの問題を軽減し、患者の予後を改善することに焦点を当てます。私たちの研究は、少量の乳腺組織から初代ヒト乳腺上皮細胞(HMEC)を効率的に分離および増殖するための、より簡単で時間を節約し、経済的なプロトコルを報告しています。このプロトコールは、ラボおよび臨床アプリケーション用の一次HMECを迅速に製造するのに適しています。この研究に基づいて、肉芽腫性乳房炎乳腺上皮細胞モデルの開発を目指しており、病因と検証済みの治療戦略についての理解を深めます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

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初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

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