Name: 軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: 学ぶ血液脳関門破壊の評価法。マウスモデルでブラスト衝撃波による軽度外傷性脳損傷後の血液脳関門ダイナミクスを可視化し、治療効果評価の新たな指標を提供します。

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<meta charset="utf8"></head><body>蛍光色素を用いたマウスの血液脳関門破壊の可視化

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</ol>

<table><tbody><tr><td>10% ホルマリン中性緩衝液</td><td>富士フイルム和光ケミカルズ</td><td>062-01661</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFAP, ウサギ</td><td>DAKO-Agilent</td><td>IR524</td><td></td></tr><tr><td>抗 Iba1, ウサギ</td><td>富士フイルム 和光ケミカルズ</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>クライオマウント</td><td>武藤純薬</td><td>33351</td><td>組織凍結培</td></tr>地 <tr><td>ドミター</td><td>オリオン コーポレーション</td><td></td><td>メデトミジン</td></tr><tr><td>ドンキー 抗ウサギ IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24ウェルポリスチレン透明平底未処理細胞培養プレート、蓋付き、個別包装、滅菌、50 /ケース</td><td>コーニング</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート&ndash;デキストラン平均分子重量 40,000</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>FD40S</td><td>FITC-デキストラン</td></tr><tr><td>ガラスベースディッシュ 27mm (No.1 ガラス)</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>3910-035</td><td>35mm ガラス底皿</td></tr><tr><td>IX83 倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS 親水性接着顕微鏡スライド</td><td>松波ガラス</td><td>MAS-04</td><td></td></tr><tr><td>松波&nbsp;カバーガラス(No.1)&nbsp;18 x 18mm</td><td>松波ガラス</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>ミダゾラム注射 10mg [SANDOZ]</td><td>サンド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド EMPROVE ESSENTIAL DAC</td><td>Merck Millipore</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211 II-H</td><td></td></tr><tr><td>RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal ASI</td><td>INSTRUMENTS</td><td>RBM-2000C</td><td>Brain Slicer</td></tr><tr><td>Vetorphale</td><td>Meiji アニマルヘルス</td><td>VETLI5</td><td>ブトルファノール</td></tr></tbody></table>

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

図1A は、BSWの発症に対する色素注入の時間経過を示しており、ピーク過圧は25 kPaです。「ポスト」プロトコルでは、エバンスブルー溶液をFITC-デキストラン灌流の2時間前に血管内投与し、BSW曝露の6時間後、1日後、3日後、および7日後に実施しました。「Pre」プロトコルでは、Evansブルー溶液をBSW曝露の直前に注入しました。「Post」プロトコルでは、Evans blueの濃度は灌流固定の約2時間前に最大に達すると予想されますが、「Pre」プロトコルでは、BSW曝露の頃に最大に達すると予想されます(図1B)。脳血管内のFITC-デキストランの濃度は、灌流中に2分間一定に保たれました。
Evansの青色のラベルは、BBBの分解が6時間以内に開始し、BSW曝露の7日後まで続いたことを示しました(図2A)。特に、「Pre」プロトコルでは3時間後にEvans青色色素の血管外漏出がなかったため、BSW曝露直後にはBBBの分解は起こらなかった(図2B)。驚くべきことに、Evansブルーによる長期標識は、「Pre」プロトコルでその累積的な性質を示しました（図2B）7。
2 つの異なる色素をそれぞれ 2 時間以上の間隔で導入することで、それらの分布を比較することにより、BBB の完全性の時間的変化を調べることができました。 図3 は、Evans blueとFITC-dextranの分布に有意な差を示したスライスの蛍光画像を示しています。
さまざまなサイズの多数の蛍光ホットスポットが観察されました。一部のホットスポットはピクセルの上位0.1%にランクインするほど明るく、多くは周囲の組織よりもわずかに明るいだけでした。染料間の不一致は、この間隔内で変化が起こったことを示唆しています。エバンスブルー蛍光のみを示すホットスポットは、エバンスブルー注射時に進行中のBBB分解を示し、これは後にFITC−デキストラン注射によって修復された。対照的に、FITC-デキストラン蛍光のみを示すホットスポットは、2つの色素注入間でBBBの破壊が発生したことを示唆しました。最後に、両方の色素から蛍光を示すホットスポットは、注入期間全体にわたって連続的なBBBの分解を示しました。
図4A は、エバンスブルー(エバンスブルーのみおよびエバンスブルー/FITC-デキストランダブルポジティブホットスポットの両方を含む)、FITC-デキストラン(FITCデキストランのみおよびエバンスブルー/FITC-デキストランダブルポジティブホットスポットの両方を含む)、または両方の色素(エバンスブルー/FITC-デキストランダブルポジティブホットスポットのみ)に陽性のホットスポットの数を示す。3時間の「Pre」プロトコルでは、多数のFITC-デキストランのみのホットスポットが観察されました。「Post」プロトコルの 6 時間 1 日で、Evans ブルーのみのホットスポットと FITC-デキストランのみのホットスポットの両方が検出されました。しかし、「Post」プロトコルの3日後と7日後には、ホットスポットは主に両方の色素に対して陽性でした。これらの知見は、BBBの破壊が3時間後に起こり、1日ごとに改造され、BSW曝露の7日後まで持続したことを示唆しています(図4B)。重要なことに、前述のように、BBBの分解の程度は7日間減少する傾向がありました。
色素血管外漏出実験の完了後、スライスの免疫組織化学的染色を実施した7。免疫組織化学画像スキャンは、色素血管外漏出の画像スキャンと一貫して比較され、蛍光物質のキャリーオーバー効果が実質的に無視できることが確認されました7。 図5に示すように、反応性アストロサイトのクラスターは、BBBの破壊部位と密接に関連していました。さらなる観察により、活性化されたアメーバ状のミクログリアが、BSW曝露の3日後に反応性アストロサイトとともに存在していたことが明らかになりました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig01.jpg"> 
図1:実験計画法 (A)実験の時間経過。Evans Blue 溶液は、BSW 曝露後 (「ポスト」プロトコル) または直前 (「プレ」プロトコル) に静脈内注射されましたが、FITC-デキストランは固定前に 2 分間経心灌流されました。(B) 「Post」および「Pre」プロトコルの血管内の Evans blue および FITC-dextran の予想濃度。BSW、爆風誘発衝撃波;FITC、フルオレセインイソチオシアネート。この図はNishii et al.7から引用しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig02.jpg"> 
図2:脳スライスの蛍光強度の比較。 脳内の最も明るい0.1%のピクセルの蛍光強度を12のスライスすべてで評価し、「ポスト」(A)条件と「プレ」(B)条件で比較しました。差の変動性と重要性が示されています。xxx は p &lt; 0.001 を示します。xxxx は p &lt; 0.0001 (F 検定の p 値) を示します。*p &lt; 0.05;p &lt; 0.0001 (ダネットの多重比較の事後検定による分散分析)。この図はNishii et al.7から引用しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig03.jpg"> 
図3:エバンスブルーとFITC-デキストランによる二重標識を使用して、さまざまな時点でBBBのブレークダウンが観察されました。 エバンスブルー(マゼンタ)、FITC-デキストラン(緑)、およびマージされた画像が表示されます。染料注入プロトコルは左側に示されています。一部のホットスポットでは、Evans blue(矢印)またはFITC-dextran(矢印)の優勢な蛍光が示されました。アスタリスクは、脈絡叢と関連する血管を示します。BBB、血液脳関門;FITC、フルオレセインイソチオシアネート;CVO、第3心室の心室周囲器官。スケールバー:1mm。この図はNishii et al.7から引用しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig04.jpg"> 
図4:蛍光ホットスポットの定量化。 (A)エバンスブルー(マゼンタ)、FITC-デキストラン(緑)、および両方の染料(灰色)に陽性のホットスポットの数。これらは、「Pre」プロトコルの3時間で得られた画像から、および「Post」プロトコルの6時間、1日、3日、および7日で得られた画像から収集されました。3時間から1日にかけて、蛍光ホットスポットのかなりの部分で色素間のミスマッチが示されましたが、3日から7日では、そのようなミスマッチはほとんど観察されませんでした。(B) BBB格の内訳の時間経過をまとめたスキーム。縦軸は、BBBの分解による染料の漏れの強度を概念的に表しています。3時間から1日にかけてのジグザグパターンは、この期間中、染料の漏れの位置と強度が不安定であることを示しています。FITC、フルオレセインイソチオシアネート;BBB、血液脳関門;BSW、爆風誘発衝撃波。この図はNishii et al.7から引用しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig05.jpg"> 
図5:GFAPとIba1のアストロサイトとミクログリアのマーカーとしての発現。 図の各列には、Evans blueまたはFITC-dextranによる色素血管外漏出の蛍光画像と、GFAPまたはIba1免疫組織化学画像が含まれています。カラーバーは、GRN内の蛍光強度を使用して、エバンスブルーとFITC-デキストランの正規化された蛍光強度を示しています。染料注入プロトコルは左側に示されています。「Pre」プロトコルの1日のスライスは、EvansブルーとFITC-デキストランの両方の蛍光を示していますが、「Pre」プロトコルの3日間のスライスは、Evansブルー(矢印)の蛍光のみを示しています。色素血管外漏出画像の矢印で示されている領域は、免疫組織化学画像と一致しています。矢印は反応性アストロサイトのクラスターを示しています。ポリクローナルGFAP抗体は、白質内およびその周辺、および軟膜に隣接する神経組織中のアストロサイトを標識しました。その結果、dcw内およびDCWに近いアストロサイトがこの図で標識されています。Iba1 列のフレームまたは矢印に対応する拡大画像は、挿入図に描かれています。スケールバー:色素の血管外漏出および免疫組織化学画像用にそれぞれ1 mmおよび200 μm。GFAP、グリア線維性酸性タンパク質;Iba1、イオン化カルシウム結合アダプター分子1;FITC、フルオレセインイソチオシアネート;BSW、爆風誘発衝撃波;DCW、深部脳白質。この図はNishii et al.7から引用しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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