軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

私たちは、爆風誘発衝撃波への曝露によって引き起こされる軽度の外傷性脳損傷の根底にある複雑なメカニズムを理解しようとしています。また、これらの症状を緩和する方法についても検討しています。これは、低強度の爆風誘発衝撃波による血液脳関門破壊の初期段階の包括的な説明でした。

具体的には、被爆後約3時間で突然崩壊が始まり、発症後約1日間、患部のリモデリングが行われます。この方法により、BBBの内訳をより詳細に調べることができ、爆発が発生した場合に採用できるさまざまな治療の有効性を評価するための追加の指標を提供します。まず、動物を爆風による衝撃波にさらすためのショックチューブを準備します。

麻酔をかけたマウスをショックチューブの出口端から5cm離して配置し、本体の軸がチューブの軸と平行であるが、位置が合っていないことを確認します。次に、最大過圧が25キロパスカルの単一の爆風衝撃波を動物の頭に照射します。エバンスブルー注射の場合は、生理食塩水に体積で4%の重量のエバンスブルー溶液を準備します。.

溶液をボルテックスし、使用するまで暗闇に保管します。エバンスブルー溶液をグラムあたり2.5マイクロリットルの投与量で尾静脈に注入します。麻酔をかけたマウスにFITC-デキストラン色素とパラホルムアルデヒドを灌流した後、手術用ハサミとピンセットを使用して脳を慎重に除去します。

脳を同じ固定剤で摂氏4度で一晩ポストフィックスします。翌日、固定剤をPBSに交換します。まず、Evans blueおよびFITC-dextran染料を注入した爆風衝撃波処理マウスから固定脳を取得します。

各ウェルのpH 7.4に調整したリン酸緩衝液中の500マイクロリットルの20%グリセロールを含む24ウェルプレートを調製します。脳スライサーを使用して、脳を冠状に12スライスに切り、それぞれ1ミリメートルの厚さにします。各スライスを24ウェルプレートの対応するウェルに移し、プレートを摂氏4度で少なくとも2時間保存します。

次に、溶液を50%グリセロールリン酸緩衝液と交換し、再度摂氏4度で少なくとも2時間保存します。最後に、溶液を100%グリセロールと交換します。顕微鏡ですぐに観察するには、スライスを室温で少なくとも2時間放置します。

500ミリメートルのガラス底皿の底に35マイクロリットルのグリセロールを追加します。脳切片をグリセロール溶液に移し、表面をカバーガラスで覆います。カバーガラスの端から余分なグリセリンを取り除きます。

蛍光顕微鏡でスライスの蛍光強度を測定します。顕微鏡測定後、スライスをプレートのウェルに戻します。各ウェルに500マイクロリットルのリン酸緩衝液を加え、24ウェルプレートを摂氏4度で一晩保存します。

溶液を30%グリセロールリン酸緩衝液と交換し、免疫組織化学エバンスブルーラベリングを実行する前に、摂氏4度で少なくとも2時間プレートをインキュベートします エバンスブルーラベリングは、血液脳関門またはBBBの破壊が爆風衝撃波曝露後6時間以内に始まり、最大7日間続いたことを示しました。蛍光ホットスポットのサイズと強度はさまざまで、Evansブルーのみのホットスポットは、Evansブルー注射中のBBB分解とFITCデキストラン注射後の修復を示しています。反応性アストロサイトのクラスターは、免疫組織化学によって確認されたBBB分解部位と密接に関連していました。

活性化ミクログリアとアメーバミクログリアは、爆風衝撃波曝露の3日後に反応性アストロサイトとともに観察されました。