Name: サイズとパターンの柔軟性を備えた標準的な 6 ウェルプレートにおける血管透過性をモデル化するためのハイスループットバイオプリンティング法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぼう、標準6ウェルプレートを用いたハイスループットバイオプリンティング法による血管透過性モデル構築。自動化された多材料印刷技術で、動脈硬化症などの内皮関連疾患治療薬開発の再現性と効率を向上させる革新的なin vitro血管モデル製造プラットフォームを確立する方法を解説します。

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1. バイオプリンターのGコードの生成
<ol><li>印刷パスを生成して視覚化するには、オンラインのGコードシミュレーションツール(NCviewerなど)にアクセスします。</li>
	<li>インターフェイスの [新しいファイル ]アイコンをクリックして、新しいGコードファイルを作成します。</li>
	<li>犠牲チャネルとシリコンチャンバーのGコードコマンドを手動で記述して、印刷パスを生成します。標準の 6 ウェルプレートの寸法を、ジオメトリを作成するための参照として使用します。 注意: ここで使用されているGコードは、コンピューター数値制御(CNC)コードに基づいています。各コマンドの機能は、 補足表 S1 に示されています。6ウェルプレートフォーマットは、市販のマイクロプレートリーダーや顕微鏡セットアップとの互換性があり、内皮の成熟をサポートするのに十分な量の培地を収容できるため、頻繁な培地交換の必要性を最小限に抑えることができるため、6ウェルプレートフォーマットが選択されました。この作製プロトコルは、他の標準ウェルプレートと併用するためにも適合させることができます。</li>
	<li>Gコードが完了したら、インターフェイスの[ ファイルを保存 ]アイコンをクリックして、拡張子が.ncのファイルをダウンロードします。 注:他の利用可能なGコード生成アルゴリズムを使用して、印刷パスを生成できます。血管チャネルの形状は、このGコードで操作できます。</li>
</ol>2. 犠牲インクおよびシリコンチャンバーインクの調製
注:このプロトコルで使用されるすべての材料の供給源は、 材料の表に記載されています。
<ol><li>SE1700とポリジメチルシロキサン(PDMS)の2種類のシリコーンポリマーを10:2の比率で組み合わせます。各ポリマーの硬化剤を10:1の割合で添加し、ポリマーと硬化剤を添加します。</li>
	<li>プラネタリーミキサーを使用して、ポリマー混合物を2,000rpmで完全に混合し、脱気します。</li>
	<li>へらで、混合したシリコーンポリマーを10mLの使い捨てシリンジに移します。装填したシリンジを400 × g 、5°Cで3分間遠心分離し、均一な一貫性を確保し、印刷中の気泡を防ぎます。 注:チャンバーインクは、最適な印刷品質を確保するために、硬化剤の添加後2時間以内に使用する必要があります。印刷の準備をしている間、シリンジは5°Cで保管してください。このプロセスは、インクの硬化を遅らせるのに役立ち、そうしないと印刷パラメータが変わる可能性があります。</li>
	<li>プルロニックF-127(PF127)を計量して、蒸留水にPF127の40%(w / v)ストック溶液を調製します。</li>
	<li>PF127溶液をプラネタリーミキサーで400 × g で3分間混合し、均質性を確保します。均質化された混合物を4°Cに保ち、PF127を完全に溶解します。</li>
	<li>1,000 units/mL のトロンビン原液を Dulbecco リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) に調製します。 注:トロンビンストック溶液は、凍結融解サイクルの繰り返しを避けるために、100 μLアリコートで保存してください。アリコートは-20°Cで6か月以内に保管する必要があります。</li>
	<li>印刷する前に、トロンビンをPF127と1:10希釈して、PF127の最終使用濃度36%(w / v)、トロンビンの100ユニット/ mLまで混合して、犠牲インクを準備します。1 mLの犠牲インクを調製するには、100 μLのトロンビン原液と900 μLのPF127原液を混合します。 注:1枚のプレートを印刷するための犠牲インクを準備する場合、合計容量は1mLで十分です。</li>
</ol>3. 製作工程
<ol><li>製造プロセスを開始する前に、6ウェルプレートを酸素(O2)プラズマで100ワットの強度で1分間処理します。</li>
	<li>セクション2で概説した手順に従って、犠牲インクとシリコンインクの両方を準備し、インクに気泡がなく、均一に混合されて一貫した印刷が可能であることを確認します。バイオプリンターのプリントヘッドにインクを慎重にロードします。バイオプリンターのヘッドの温度を、犠牲インクの場合は37°C、シリコンインクの場合は5°Cに設定します。</li>
	<li>22 Gの両ねじねじテーパーノズルをシリコンシリンジに取り付けます。犠牲インクの場合、希望のチャネル直径に応じてノズルサイズを選択します。 注:ここでは、18 G、20 G、22 Gの3つのサイズのノズルを示しました。印刷圧力やプリントヘッド速度などの最適な印刷パラメータを 表1に示します。</li>
	<li>目的のGコードをロードし、バイオプリンターのソフトウェアインターフェースの サーボレディ 機能を3秒間押します。プレートをステージ上のGコードの開始点に配置し、[ 開始 ]をクリックして印刷プロセスを開始します。 注:通常、6つのチャンバーを含む1つのプレートの製造には、約1時間10分かかります。Gコードのロードと実行を含むステップ3.4は、使用する特定のバイオプリンターによって異なります。バイオプリンターの使用中は、汚染を避けるために無菌状態が維持されていることを確認してください。</li>
	<li>プレートに蓋をし、プレートを加湿したCO2 インキュベーターに37°Cで72時間移して、シリコンチャンバーを硬化させます。 注:シリコン硬化はインキュベーター内でゆっくりとした速度で発生する可能性がありますが、プレートをドライオーブン内に置かないでください。</li>
</ol>4. ハイドロゲルの調製とチャネル埋め込み
<ol><li>20 mLの1x PBSを含む50 mLのコニカルチューブを準備します。0.01 gのフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を円錐管に入れて、0.05%(w / v)LAP溶液を作ります。粉末が完全に溶解するまでボルテックスします。 注意: 光にさらされないように、円錐形のチューブをホイルで包みます。LAPストック溶液は4°Cで保存します。</li>
	<li>20 mLのLAP溶液に3 gのゼラチンメタクリレート(GelMA)と0.2 gのフィブリノーゲンを加えて、最終濃度15%のGelMAと1%のフィブリノーゲン(GelFibと呼ばれる)を達成します。混合物を37°Cのウォーターバスに入れ、溶液が完全に溶解するまで定期的にボルテックスミックスします。</li>
	<li>セクション3で概説したように作製した後、予熱したGelFibを各ヒドロゲルチャンバーに300 μL加えて、犠牲パターンを埋め込みます。GelMAを波長405nm、強度85mW/cm2 の紫外線(UV)光と120秒間迅速に架橋します。他のすべてのウェルに対してこの手順を繰り返します。 注:フィブリノーゲンは、トロンビンを含む犠牲パターンと接触すると急速に架橋します。室温でのGelMAの不要なゲル化を避けるために、ハイドロゲルを添加し、ウェルごとに個別にUV架橋を行うことをお勧めします。さらに、UV硬化プロセス中の汚染を防ぐために、無菌状態を維持する必要があります。</li>
	<li>各ウェルの血管チャネルの両側に 1 mL の DPBS を添加し、プレートを 4 °C で 15 分間保持して PF127 を液化します。</li>
	<li>15分後、DPBSを吸引し、手順4.5を3回繰り返してPF127を完全に洗浄します。</li>
	<li>細胞をチャネルに導入する前に、1%マトリゲルを含むDMEM F12をチャネルを通じて30分間灌流し、細胞の接着を促進します。</li>
</ol>5. HUVECの文化
<ol><li>温めた内皮細胞増殖培地(ECGM)を37°Cの水浴中で30分間。</li>
	<li>その間、凍結保存されたHUVECのバイアルを窒素タンクから取り出し、バイアルのキャップをそっと緩めてから、再度締めて糸から窒素を放出します。バイアルを37°Cのウォーターバスに2分間浸して細胞を解凍し、バイアル内に少量の氷が残るようにします。バイアルを70%エタノールですすいで、汚染を防ぎます。 注:窒素タンクから細胞を回収するときは、安全ゴーグルを着用してください。このプロセス中は、バイアルのキャップを水位より上に保つ必要があります。</li>
	<li>5 mLの予熱済みECGMを含む15 mLのコニカルチューブを準備します。マイクロピペットを使用して、解凍した細胞をバイアルから円錐形のチューブに慎重に移します。細胞が残らないようにするには、1 mLの新鮮な予熱培地をクライオバイアルに加え、内部をすすぎ、残りの細胞を円錐管に移します。</li>
	<li>コニカルチューブを200 × g で3分間遠心分離し、細胞ペレットを得ます。上清を捨て、細胞を10 mLの新鮮な培地に再懸濁し、細胞をT75フラスコに移し、フラスコを37°C加湿CO2 インキュベーター内に置きます。 注:このステップは、遠心分離によってクライオバイアル内の凍結媒体中に存在するジメチルスルホキシドを除去するために重要です。</li>
	<li>細胞が80〜90%のコンフルエントに達するまで、隔日で培地をリフレッシュします。</li>
</ol>6. チャネルの内皮化
<ol><li>温めたECGM、DPBS、トリプシン中和溶液、およびトリプシンエチレンジアミン四酢酸(TE)を37°Cの水浴中で30分間。</li>
	<li>90%の密度で、T75フラスコで細胞を10 mLのDPBSですすぎ、0.25% TEを1 mLフラスコに加え、3分間インキュベートします。</li>
	<li>フラスコの側面を軽くたたいて、5 mLのトリプシン中和溶液を加えてTEを中和します。細胞を15mLのコニカルチューブに移します。5 mLの新鮮なECGMを使用して残りの細胞を採取し、それらを円錐管に加えます。</li>
	<li>コニカルチューブを250 × g で3分間遠心分離し、細胞ペレットを回収します。</li>
	<li>上清を捨て、細胞ペレットを新鮮なECGM1 mLに再懸濁します。血球計算盤で細胞をカウントし、ステップ6.4を繰り返して細胞ペレットを採取します。300万個の細胞を90 μLのフレッシュECGMに再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液をチャネルに導入する前に、チャネルを短時間真空吸引して内腔をクリアにします。 注意: チャネルの完全性を損なわないように、チャネルを長時間吸引しないでください。</li>
	<li>ウェルあたり50万個の細胞の播種密度で細胞懸濁液をチャネルに穏やかにロードします。マイクロピペットを使用して、この懸濁液を~15 μL加え、チャネルを満たします。 注:播種密度は、チャネルのサイズによって異なる場合があります。この密度は、20 Gノズルと約900 μmの内径でプリントされたチャネルに最適化されています。</li>
	<li>プレートをインキュベーター内に平らに置き、2時間待ちます。その後、プレートを180°に反転させ、次の2時間フラットな位置に維持します。</li>
	<li>4時間後、DPBSでチャネルを洗浄し、非接着性細胞と死細胞を除去します。各ウェルに2 mLの新鮮なECGMを加えます(チャネルの両側に1 mL)。10°の傾斜角度と5rpmでロッカーの動的培養を開始するには、チャネルをロッキングの方向に平行にしてロッカーにプレートを配置します。成長培地は一日おきにリフレッシュしてください。 注:動的培養は、リザーバーとチャネル間の培地交換を促進し、細胞が一晩で増殖するのを助けます。</li>
</ol>7. 内皮成熟評価
<ol><li>ECGMおよびDPBSを37°Cのウォーターバスで30分間予温し、Cell Counting Kit-8(CCK8)試薬を室温で使用。</li>
	<li>各ウェルに100 μLのCCK8試薬と1 mLの新鮮なECGMを混合して、CCK8の作業溶液を作成します。プレート/6チャンネルで作業しながら、600 μLのCCK8試薬を6 mLの新鮮なECGMと組み合わせて調製します。</li>
	<li>吸引して増殖培地を取り出し、DPBSでチャネルをすすぎます。各ウェルに1 mLのCCK8ワーキング溶液を加え、プレートをインキュベーター内で30分間平らに保ちます。その後、ステップ6.9で説明したようにロッカーで動的培養を開始し、このプロセスを次の3時間続けます。</li>
	<li>3時間後、プレートを片側に傾けて各ウェルから内容物を取り出し、新しい6ウェルプレートに移します。DPBSでチャネルをすすぎ、新しい培地を追加します。 注意: 吸光度が測定されるまで、プレートをアルミホイルで覆います。すべてのウェルで試薬量を一定に保ち、測定値が均一になるようにします。ピペッティング中は、光学濃度の読み取り精度を損なう可能性のある気泡の混入を慎重に避けてください。</li>
	<li>プレートを15秒間静かに振とうして色が均一に混ざり合うようにした後、マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定します。</li>
	<li>事前定義された時間間隔でこの手順を繰り返します。各時点の平均光学密度を計算し、グラフ作成ソフトウェアで成長曲線をプロットします。この曲線は、経時的な内皮の相対的な成熟を示しています。</li>
</ol>8. 透過性アッセイ
<ol><li>目的の1つのウェルから培地を取り出します。 注:透過性アッセイでは、他のチャネルが乾燥し、血管透過性が変化するのを防ぐために、各ウェルを別々に処理することをお勧めします。</li>
	<li>70 kDaのFITCデキストランをDPBSに溶解して、FITC標識デキストランの0.1 mg / mL溶液6 mLを調製します。. 注:100 mgのFITCデキストランを5 mLのDPBSに溶解して、20 mg / mLのFITCデキストランストック溶液を準備します。.溶液を穏やかにボルテックスした後、凍結融解サイクルが繰り返されないように、500 μLを1.5 mLチューブに分注します。これらのアリコートは、-20°Cで最大6ヶ月間保存できます。アッセイを行う前に、ストック溶液を0.1 mg/mLの使用濃度に希釈してください。</li>
	<li>プレートを顕微鏡ステージにしっかりと配置し、位相差モードで対物レンズの倍率を調整すると、視野内で関心領域のチャネル壁と近くにあるゲルがはっきりと見えるようになります。 注:効果的な透過性評価のために、視野内の関心領域を囲むゲルの面積を最大化するようにしてください。この側面は、デキストラン輸送の正確な監視の鍵となります。</li>
	<li>目的の領域に焦点を合わせた後、位相差から蛍光モードに変更します。 [画像取得 ]タブで、 FITC を 広視野チャネルに追加し、デキストラン溶液を添加する前に画像を取得して、バックグラウンド蛍光強度を計算します。次に、1 mLのFITCデキストラン作動溶液をチャネルの片側に加え、静水圧差によって駆動される溶液をウェルの反対側に向けて流します。</li>
	<li>あらかじめ決められた時間間隔で画像を取得します。透過性の高いチャネルではより頻繁に、透過性の低いチャネルではその頻度が低くなります。</li>
</ol>9. ImageJにおける蛍光強度測定
<ol><li>ImageJ画像解析ソフトウェアでは、初期時点の強度(It1)、後の時点で観測された平均強度(It2)、およびバックグラウンドノイズによる強度(Ib)を以下に概説するように測定します。式(1)を使用して、透過係数(PD)を計算します。T1 と T2 は、画像取得の初期時点とその後の時点を指します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)<ol><li>ImageJを起動し、初期点で取得した画像を開きます。</li>
		<li>ImageJ でスケールを設定します。 [分析] |スケールを設定します。既知のスケールと測定単位を入力します。</li>
		<li>長方形ツールを選択し、蛍光強度測定が必要なゲルの領域に長方形を描きます。</li>
		<li>[分析] |[測定] を設定し、[平均] グレーの値がオンになっていることを確認します。 注意: このオプションは、選択した領域内の平均強度を測定します。他のパラメータは、特定の解析に必要に応じて選択できます。</li>
		<li>領域を選択したまま、[ 分析] |測定するか 、 単にMを押します。 結果 ウィンドウが開き、平均蛍光強度と選択したその他のパラメーターが表示されるのを待ちます。</li>
		<li>3 つの測定を行い、スプレッドシートで平均蛍光強度値を計算します。</li>
		<li>その後の時点t2で撮影された画像、および後の時点における蛍光強度を計算するためのデキストラン溶液を添加する前に撮影された画像について、この手順を繰り返して、背景蛍光を決定する。</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>プレート上の血管を使用した迅速な血管ネットワーク形成のための3Dバイオプリンティング

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>SPL SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ&nbsp;</td><td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3Dバイオプリンター&nbsp;</td><td>T&R Biofab</td><td>3DX-プリンター</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>明視野倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>細胞計数キット (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>細胞計数キット (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ 75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO、細胞培養グレード</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning、PDMS-Sylgard 184a キット</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 クリア W/C 1.1 KG キット&nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地 MV 2 (すぐに使用)</td><td>プロモセル</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ マイクロピペット(1000,200,100,20,10)</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール 99.9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿由来フィブリノーゲン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC デキストラン 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ビーズ (1.0 &mu;m、緑)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA粉末(メタクリル酸ゼラチン)50 g</td><td>3D材料&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)</td><td>Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO2 インキュベーター</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>リチウムフェニル (2,4,6-トリメチルベンゾイル) リン酸粉末&nbsp;</td><td>常陽化学工業(株)</td><td>85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マリエンフェルド・スーペリア、計数室カバー</td><td>マリエンフェルド・スーペ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リア、血球計算盤、細胞計数室</td><td>マリエンフェルド・スーペリア</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ</td> 微<td>量遠心分離</td>機 <td>5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>窒素タンク</td><td>ワージントン・インダストリー</td><td>ズ LS750</td><td></td></tr><tr><td>オムニキュアUVレーザー</td><td>エクセリタス</td><td>シリーズ 1500</td><td></td></tr>パラ<tr><td>フィルム M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>プラネタリーミキサー</td><td>株式会社シンクィ</td>ー <td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>プラズマ処理機</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>既製バッファー、(P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>試薬収納キャビネット</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイム ライブセルイメージング顕微鏡</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D デジタル</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>スクープスパチュラ</td><td>キャッシュBy</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25%</td><td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ バレル チップ キャップ</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Tally</td><td>counter Control Company</td><td>&nbsp;C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>テーパーノズル (18 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>テーパーノズル (22 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>テーパーノズル 20 G</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>ウシプラズマからのトロンビン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>タイマー、4 チャンネル</td><td>ETL</td><td>SL.Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン中和液</td><td>プロモセル</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24 mL UG 軟膏瓶</td><td>山遊</td><td>No. 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL UG 軟膏瓶</td><td>山結</td><td>No. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>ダイハン サイエンティフィック</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>ウェイトマシン</td><td>ザルトリウス</td><td>BCE2241-1SKR</td><td></td></tr></tbody></table>

サイズとパターンの柔軟性を備えた標準的な 6 ウェルプレートにおける血管透過性をモデル化するためのハイスループットバイオプリンティング法

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

サイズとパターンに柔軟性を持たせたVOPプラットフォームは、マルチヘッドバイオプリンティングシステムで製造されました。中空で灌流可能なチャネルには、内皮化を促進するためにHUVECを播種し、その後、透過性アッセイで評価しました(図1A)。この方法のマルチスケール製造能力を実証するために、ストレート、二股、畳み込みの3つの異なる構成をプリントしました(図1B)。簡単な作製アプローチにより、ハイドロゲルマトリックス内に埋め込まれた6つの中空の灌流可能な血管チャネルを、標準的な6ウェルプレート内に作製することができます。その後、これらのチャネルはHUVECで内皮化できます(図2A)。細胞は急速に付着して増殖し、血管チャネルの管腔表面を覆います(図2B)。下部管腔表面と上部管腔表面の両方に接着した細胞は、内腔内に均一な分布を示します(補足図S1)。
プレートを加湿インキュベーターに3日間置いて、シリコンインクを硬化させながら、犠牲パターンが乾燥しないようにしました(図3A)。これらのチャネルを通る流れを評価するために、緑色のマイクロビーズを導入し、チャネルが効果的に灌流可能であることを実証しました(補足ビデオS1)。チャネルの直径は、犠牲パターン印刷中にノズルサイズを22Gから18Gに変更することにより、558±38μmから1094±45μmまで変化させました。さらに、バイオプリンターのGコード (補足ファイル1) を変更してチャネルの幾何学的構成を操作し、畳み込みパターンと分岐パターンの印刷を可能にしました(図3B)。
UVによる架橋時間は120秒に最適化され、効果的な細胞増殖をサポートします(補足図S2)。この架橋持続時間により、内皮細胞の増殖を促進する生理学的に関連性のある環境がもたらされましたが、これはおそらくハイドロゲルのバランスの取れた機械的特性と多孔性によるもので、細胞の接着とその後の増殖が促進されました。HUVECは管腔表面で効果的に増殖し、播種後5日目までに丸石のような形態を示しました。内皮の成熟度は、1日目、3日目、および5日目に実施されたCCK8アッセイで評価しました(図4A、B)。内皮の成熟は、細胞播種後5日でCD31の免疫染色によって確認され、タイトジャンクションでのCD31の局在が実証されました(図4D)。
内皮のバリア機能を評価するために、成熟の5日目にチャネルを介して70 kDaのデキストラン溶液を灌流しました。比較のために、内皮のない(むき出し)コントロールチャネルを選択しました。内皮化されたチャネルは、経時的に血管周囲ゲル領域内の蛍光の変化が最小限であったため、内皮がそのバリア機能を効果的に維持していることが示唆されました。しかし、裸のチャネルは血管周囲ゲル領域における蛍光の増加を示し、したがって、内皮がないために透過性が高いことが示されました(図4C および 図4E)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg"> 図1:印刷された血管チャネルの調製とその構成(A)印刷された血管チャネルの作製、内皮化、および透過性アッセイの概略図。(B)この方法で示される3つの構成(直線、二股、および畳み込み)の概略図。略語:VOPs = プレート上の容器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg"> 図2:犠牲パターンとシリコンチャンバー、および血管チャネル内皮化を印刷するための製造タイムライン(A)図はウェルプレートの単一のウェルを表し、AA'は断面面に沿ったビューを指します。(B)製造工程の代表的なイメージ。スケールバー = 5 mm (B1)、200 μm (B2-4)。略語:GelFib = 15%ゼラチンメタクリレートおよび1%フィブリノーゲン、0.05% w / vリチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸溶液中。HUVECs = ヒト臍帯静脈内皮細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg"> 図3:プレート上の容器 (A)犠牲パターンとシリコンチャンバーの印刷後のプレート上の容器のグロスイメージ。(B)緑色のマイクロビーズで灌流された、さまざまな構成とサイズの血管チャネルのマルチスケール製造のデモンストレーション。スケールバー = 200 μm (ストレートチャンネル)、1,000 μm (畳み込みチャンネルと分岐チャンネル)。略語:ID =内径。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg"> 図4:血管チャネルとその内皮成熟および透過性 (A)緑色蛍光タンパク質タグ付きHUVECを播種した後の1日目、3日目、および5日目の血管チャネルの蛍光顕微鏡画像、5日目のHUVECの増殖および丸石形態を示す。(B)内皮の成熟は、細胞播種後1日目、3日目、および5日目にCCK-8アッセイで評価しました。(C)内皮化された(内皮+)および裸(内皮-)血管チャネルの透過性アッセイ。(D)CD31染色の代表的な画像は、5日目のタイトジャンクションでのCD31の局在を示しています。(E)拡散透過性の定量化。スケールバー = 200 μm (A, C, D)。略語:HUVECs =ヒト臍帯静脈内皮細胞;GFP = 緑色蛍光タンパク質;GFP HUVECs = GFPタグ付きHUVECs;CCK-8 = 細胞計数キット 8;DAPI=4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>印刷用インク</td>
			<td colspan="2">印刷パラメータ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>ノズルゲージ</td>
			<td>温度 (°C)</td>
			<td>空気圧(kPa)</td>
			<td>ヘッド速度(mm / min)</td>
		</tr><tr><td>犠牲インク</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>シリコンインク</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表1:犠牲インクとシリコンインクの印刷パラメータ。
補足ファイル1:犠牲パターンと6ウェルプレート内のシリコンチャンバーを3Dプリントするためのコマンドを含むGコードスクリプト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:細胞播種後の下部および上部管腔表面の代表的な画像で、下部および上部焦点面の両方でGFP-HUVECが付着していることを示しています。 スケールバー = 200 μm。略語:UU '=上部焦点面;LL' = 下焦点面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S2:UV(405 nm)との異なる架橋期間下でのGFP-HUVEC増殖。 スケールバー = 200 μm。略語:HUVECs =ヒト臍帯静脈内皮細胞;GFP = 緑色蛍光タンパク質;GFP HUVECs = GFPタグ付きHUVECs。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオ S1: 緑色のマイクロビーズによる灌流は、直線、畳み込み、および分岐チャネルを通る効果的な灌流を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S1:GコードおよびMコードコマンドの機能。 注意: Gコードでは、X、Y、およびZは、それぞれX軸、Y軸、およびZ軸に沿った移動の座標を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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