Name: とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶとげマウスから線維脂肪形成前駆細胞（FAPs）を酵素処理とFACSで単離・培養する方法。筋肉組織修復と再生医療研究への応用が可能です。

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<meta charset="utf8"></head><body>マウスの心臓と骨格筋の消化による線維脂肪形成前駆細胞培養

<ol><li>Gaire, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiny+mouse+%28Acomys%29%3A+An+emerging+research+organism+for+regenerative+medicine+with+applications+beyond+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Spiny mouse (Acomys): An emerging research organism for regenerative medicine with applications beyond the skin.</a> NPJ Regen Med. 6, 1(2021).</li>
<li>Sandoval, A. G. W., Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+the+spiny+mouse%2C+Acomys%2C+a+new+mammalian+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Regeneration in the spiny mouse, Acomys, a new mammalian model.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 64, 31-36 (2020).</li>
<li>Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+mesenchymal+stem%2Fprogenitor+cells+in+skeletal+muscle%3A+Collaborators+or+saboteurs%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: Collaborators or saboteurs.</a> FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> J Cell Sci. 124, 3654-3664 (2011).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 122 (12), 143-152 (2010).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+Potential+of+Hic1-Expressing+Cardiac+Stromal+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic Potential of Hic1-Expressing Cardiac Stromal Progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+relationship+between+cardiac+fibroblasts+and+cardiomyocytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease.</a> J Am Heart Assoc. 10, 1-15 (2021).</li>
<li>Gawriluk, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+ear-hole+closure+identifies+epimorphic+regeneration+as+a+discrete+trait+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of ear-hole closure identifies epimorphic regeneration as a discrete trait in mammals.</a> Nat Commun. 71 (7), 1-16 (2016).</li>
<li>Seifert, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+shedding+and+tissue+regeneration+in+African+spiny+mice+%28Acomys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys).</a> Nature. 489, 561(2012).</li>
<li>Koopmans, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+tolerance+and+cardiac+repair+in+the+spiny+mouse+%28Acomys%29%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemic tolerance and cardiac repair in the spiny mouse (Acomys).</a> NPJ Regen Med. 6, 78(2021).</li>
<li>Peng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+spiny+mice+%28Acomys%29+exhibit+endogenous+cardiac+recovery+in+response+to+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Adult spiny mice (Acomys) exhibit endogenous cardiac recovery in response to myocardial infarction.</a> NPJ Regen Med. 6, 74(2021).</li>
<li>Maden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+chronic+skeletal+muscle+regeneration+in+adult+spiny+mice%2C+Acomys+cahirinus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Perfect chronic skeletal muscle regeneration in adult spiny mice, Acomys cahirinus.</a> Sci Rep. 8, 8920(2018).</li>
<li>Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-isolation+and+culture+of+fibro-adipogenic+progenitors+and+muscle+stem+cells+from+unperturbed+and+injured+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">FACS-isolation and culture of fibro-adipogenic progenitors and muscle stem cells from unperturbed and injured mouse skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (184), e63983(2022).</li>
<li>Low, M., Eisner, C., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors+%28FAPs%29%3A+Isolation+by+FACS+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture.</a> Methods Mol Biol. 1556, 179-189 (2017).</li>
<li>Molina, T., Fabre, P., Dumont, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-adipogenic+progenitors+in+skeletal+muscle+homeostasis%2C+regeneration+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle homeostasis, regeneration and diseases.</a> Open Biol. 11 (12), 210110(2021).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skelet Muscle. 111 (11), 1-25 (2021).</li>
<li>Fitzgerald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MME%2B+fibro-adipogenic+progenitors+are+the+dominant+adipogenic+population+during+fatty+infiltration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle.</a> Commun Biol. 61 (6), 1-21 (2023).</li>
<li>Babaeijandaghi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPIV%2B+fibro-adipogenic+progenitors+form+the+niche+of+adult+skeletal+muscle+self-renewing+resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DPPIV+ fibro-adipogenic progenitors form the niche of adult skeletal muscle self-renewing resident macrophages.</a> Nat Commun. 141 (14), 1-10 (2023).</li>
<li>Schutz, P. W., Cheung, S., Yi, L., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+activation+patterns+of+CD10%2B+fibro-adipogenic+progenitors+across+acquired+disease+states+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Cellular activation patterns of CD10+ fibro-adipogenic progenitors across acquired disease states in human skeletal muscle biopsies.</a> Free Neuropathol. 5, 3-3 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575&ndash;038</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL微量遠心チューブVWR</td><td></td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp;mL遠心分離管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe</td><td>BD</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>40&nbsp;&mu;m細胞ストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48ウェル平底組織培養プレート</td><td>Falcon</td><td>53078</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリプロピレン</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン丸底チューブ(細胞ストレーナーキャップ付き</td>) <td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp;mL遠心分離管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm ペトリ皿</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>96 well V底組織培養プレート</td><td>Corning</td><td>3894<</td><td></td></tr><tr><td>em>Acomys dimidiatus マウス (とげのあるマウス)</td><td></td><td></td>は、<td>Dr. Ashley W. Seifert(ケンタッキー大学)から贈られました。</td></tr><tr><td>塩化アンモニウムカリウム (ACK) 溶解バッファー</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>抗ペリリピン (1:100)</td><td>Sigma</td><td>P1873</td><td></td></tr><tr><td>抗 SMA (1:100)</td><td>Invitrogen</td><td>14-9760-82</td><td></td></tr><tr><td>APC PDGFRa (1:800)</td><td>Abcam</td><td>ab270085</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 23 G</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A7906-100g</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD31 (1:500)</td><td>BD biosciences</td><td>744359</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-mouseAlexa 555 (1:1000)</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ Alexa 647 (1:1000)</td><td>Invitrogen</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>Σ</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>FACS ソーター - MoFlo Astrios 5 レーザー</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B52102</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gemini</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>細かいハサミ</td><td>FST</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FGF - 塩基性組換えタンパク質 (bFGF)</td><td>Gibco</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>ヒト TGF ベータ 1 組換えタンパク質 (TGFb1)</td><td>eBiosciences</td><td>14-8348-62</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター - Heracell 160i CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 - Revolve</td><td>ECHO</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5507</td><td></td></tr><tr><td>マウスオンマウス(MOM)ブロッキング試薬</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>P1648-500G</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140&ndash;122</td><td></td></tr><tr><td>PicoLabマウスダイエット 20</td><td>LabDiet</td><td>3005750-220</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム(PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>輸送バイアル 5mLチューブ</td><td>キャプラグ エバーグリーン</td><td>222-3005-080</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr></tbody></table>

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model

骨格筋と心臓のFAPを分離して培養するためのこのプロトコルの概略図を 図1にまとめています。組織採取の場合、肝臓の色が濃い赤から淡い黄色に変わることは、通常、灌流が成功したことを示しています。とげのあるマウスの指定された年齢範囲では、心臓の重量は通常約200 mgですが、大腿四頭筋は約350 mgです。
ステップ3.5-3.7の各消化バッファーの変更中、細胞が組織から放出されると、消化チューブ内の消化バッファーは不透明に見えます。消化の最後には、溶液は比較的均質なスラリーでなければならず、いくつかの組織片が残っている必要があります。細胞の生存率や培養結果に悪影響を与える過剰消化を避けるために、すべての組織が完全に消化される前に必ず消化を終了してください。
FACSの予想されるフロープロットを 図2に示します。FAPは、生細胞およびLIN-細胞の約2%を占めると予想されています。PI+ イベントの割合は、サンプル調製の品質の指標であり、10% 未満である必要があります。この研究では、心臓あたり 150k FAP (心室のみ) と 2 つの大腿四頭筋から 100k FAP が通常取得されます。
プレートに入れると、細胞は通常72時間以内に付着し、5日以内に80%のコンフルエントに達し、突起のある典型的な線維芽細胞の形態を示します(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66717/66717fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概略図と各ステップに必要なおおよその時間。 ティッシュコレクション:マウスあたり10分。組織消化:1.5-2時間細胞染色:45分-75分蛍光活性化細胞ソーティング:2時間。線維脂肪形成前駆細胞(FAP)の拡大:4日間。FAP分化:線維形成分化の場合は48時間、骨格筋FAPの場合は脂肪分化の場合は6日、心FAPの場合は14日。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66717/66717fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66717/66717fig02.jpg"> 図2:骨格筋(上)と心臓(下)のFAP分離の代表的なFACSプロット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66717/66717fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66717/66717fig03.jpg"> 図3:トゲマウス骨格筋FAP分化 (A)線維形成分化制御。(B)線維形成分化。(C)脂肪形成分化制御。(D)脂肪原性分化。ペリリピン(緑)、SMA(マゼンタ)、DAPI(青)、スケールバー= 100μm。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66717/66717fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66717/66717fig04.jpg"> 図4:トゲトゲマウスの心拍FAP分化 (A)線維形成分化制御。(B)線維形成分化。(C)脂肪形成分化制御。(D)脂肪原性分化。ペリリピン(緑)、SMA(マゼンタ)、DAPI(青)、スケールバー= 100μm。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66717/66717fig04large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66717/66717fig05.jpg"> 図5:培養5日後、分化前のとげのあるマウス骨格筋(A)と心臓(B)FAPの明視野画像。 スケールバー = 360 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66717/66717fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コントロール</td>
			<td>CD31 SCの</td>
			<td>PDGFRα SC</td>
			<td>CD31 FMOの</td>
			<td>PDGFRα FMOの</td>
			<td>見本</td>
		</tr><tr><td>CD31抗体</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>PDGFRα抗体</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr></tbody></table>表1:コントロールおよびサンプル用の抗体染色カクテルのセットアップに関する概略ガイド。 SC = 単色コントロール、FMO = 蛍光 - 1 コントロール、+ = 対応する抗体あり、 - = 対応する抗体なし。

Due to its exceptional repair program, the spiny mouse is an emerging research model for regenerative medicine. Fibro-adipogenic progenitors are ...

fibro-adipogenic-progenitor-isolation-expansion-differentiation-from

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本稿では、マウス大動脈周囲脂肪組織からの間質血管分画由来前駆脂肪細胞を単離、培養、脂肪誘発し、血管周囲脂肪組織の機能や血管細胞との関係を研究することを可能とする。...

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