Name: 薬効研究のためのシャーガス病モデルマウスのIn vivo生物発光イメージングの謎解き (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶ Trypanosoma cruzi 感染マウスの生体発光イメージングによる薬効評価プロトコル。D-ルシフェリンを用いた非侵襲的な寄生虫負荷のリアルタイム追跡と、治療薬の有効性を定量的に解析する方法を解説する。

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著者らは、薬効アッセイに関するBLIのトレーニングとサポートを提供してくれたAmanda Franscisco氏、John Kelly氏、Fanny Escudié氏、寄生虫を提供してくれたJohn Kelly氏とSimone Calderano氏、動物実験のサポートを提供してくれたGabriel Padilla氏に感謝します。A.C.Sは、ロンドン大学衛生熱帯医学大学院(英国)での研修に対してCAPES PSDE奨学金を授与されました。また、著者らは、IVIS Spectrum機器解析の技術サポートを提供してくださったサンパウロ大学科学研究コア施設のFlow Cytometry and Imaging Research(FLUIR)プラットフォーム(CEFAP-USP)と、マウスの特異的病原体フリーとしての品質管理のための実験後アッセイを提供してくださったLaboratory of Genetics and Sanitary Control ICB-USPに感謝します。このプロジェクトはDNDiによって資金提供されました。DNDiは、2003年のDNDiの設立以来、すべての活動に資金を提供してくださった官民の寄付者に感謝しています。DNDiの寄付者の完全なリストは、https://dndi.org/about/donors/ でご覧いただけます。

シャーガス病の生体内発光モデルによる薬剤評価のためのプロトコール

著者には、宣言すべき利益相反はありません。

生物発光イメージングは、可視および赤外スペクトルの電磁放射を使用してレポート遺伝子を検出できる画期的な方法です。したがって、試料35を追跡するために放射性標識マーカーを使用する必要はない。BLIは、げっ歯類モデルやその他の小さな種に適しています。より安全で、数回の画像ラウンドが可能で、動物の不快感を最小限に抑えることができるため、前臨床試験に非常に役立ちます。その上、 in vivo イメージングは、生物発光、蛍光、および陽電子放出断層撮影法36などの他の技術を組み合わせる可能性があるため、非常に柔軟である。
光学イメージングは、吸収や散乱などの光学的物理的特性によって支配されます。すべての組織は、異なる方法で区別された波長の光を吸収および散乱します37。重要なステップの1つは、化学反応によって生成される光の放出波長を考慮せずにレポーター遺伝子を選択することです。生物発光アッセイでは、レポーター遺伝子の発現レベルがin vitroで高くなる可能性がありますが、in vivo設定に進むと、同じレベルの発現が得られない可能性があります。このプロトコルでは、617 nmで光を放出するトリパノソーマチド9用の赤方偏移Photinus pyralis luciferase(PpyRE9H)38コドン最適化バージョンを使用しました39。600nmより長い波長は、体内因性発色団、特にヘモグロビンとメラニンによる吸収と散乱が少なくなります。したがって、赤色光は数センチメートルの組織を介して透過することができ、光子は内臓組織39,40内からでもCCDカメラに到達することを可能にする。
イメージング環境における懸念事項の1つは、その機能と効果を包括的に理解していないことです。ビニングは、前処理技術であり、連続した検出器によって取得された情報をより大きなピクセルに結合します。このプロセスにより、S/N比が向上し、バックグラウンドノイズが低減され、感度が向上します。しかし、空間分解能の精度を低下させ、ピクセル化された画像41,42をもたらす。このトレードオフは、イメージング戦略における重要な考慮事項です。
「Target Product Profile」と「Target Candidate Profile for Chagas Disease34」に基づき、この概念実証試験は、 T. cruzi を検出し、新薬候補が無菌治癒を達成できるかどうかの立証に役立つ感度に焦点を当てています(数回の免疫抑制ラウンド後の再発の欠如で表されます)。したがって、画像を過飽和にすることなく、最高のビニング係数を使用してBLIを実行します。画像が過飽和になると、より低いビニング係数を使用して新しい取り込みが実行されます。解析中に、異なるビニングが必要な画像に数学的補正が適用されます。このように、最終データは同じビニングを使用して表示する必要があります。 表 1 は、同じ画像と ROI に特徴的なビニング係数を適用した場合に得られるさまざまな値を示しています。
表1:ビニング設定がBLI定量に及ぼす影響。 急性モデル(d13)と慢性モデル(d118)の画像上での3つのROIの定量化、異なるビニング因子で分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
現在の臨床におけるシャーガス病のシナリオにより、創薬努力は寄生虫を完全に排除すること(寄生虫学的治療)を目指しています27,34。したがって、in vivo 前臨床プロトコルには、BLI の技術的感性の限界を克服するアプローチが含まれています。そのアプローチの1つは、マウスをシクロホスファミドで治療して、寄生虫の負荷を制御する免疫応答を減らすことです。別の戦略は、組織の深さを減らし、カメラへの光の経路を妨げる筋肉、皮膚、毛皮の層を取り除くことです。ex vivo法により、小さな生物発光スポットを検出し、図5Cに示すように、Posaで処理したマウスのex vivo結果に示すように、in vivo BLI閾値を下回る寄生虫病巣を明らかにすることができます。
モデル自体と感染動態を評価するためのパイロット実験を設計することは、抗寄生虫薬の有効性評価のための正確な実験を確立するために重要です。したがって、研究者は適切なBLI設定と感染時間経過を事前に定義することができます。探索的実験では、取得設定を定義するのに役立つツールの1つが「自動露光」です。このツールを使用すると、研究者は3つの設定(露光時間、 ビニング、 F / Stop)の優先順位を確立して、可能な限り最高の画像を取得します。特に、研究者は、CCDカメラのダイナミックレンジ内で画像が取得され、過飽和や露出不足がないことを確認する必要があります。これは、スケールの下限と最大の制限、および自動露出機能(メニュー 編集 > 設定 > タブ取得 > タブ自動露出)で確認できます).このプロトコルでは、カメラの絞りを最大値 (F/Stop: 1) に設定し、急性モデルと慢性モデルで露光時間とビニング係数を区別しました。これらの設定により、異なる画像ラウンドを同時に実行するための時間予測可能性が得られます。レポーター法が酵素反応に基づいていることを考えると、マウスへの基質の生体内分布とルシフェラーゼ速度論の両方が生物発光シグナルに影響を与え、したがって感染の定量化に影響を与えます(図1B)。その結果、酵素動態の異なる瞬間に画像を取得すると、説明も補正もできないデータのばらつきが発生し、総フラックス(光子/秒)または放射輝度(光子/秒/cm2/ステラジアン)の計算に影響を与えます。さらに、 T. cruzi 感染は、マウスで動的な空間的位置(異なる領域と組織、深さ、および寄生虫の負荷)を示します。したがって、取得するカウントの値を設定すると、別の強いシグナルのソースが定義された自動曝露基準を満たしている場合、弱いシグナルソース(組織のより深い特定のスポットに寄生虫の数が少ない)を見逃す可能性があります。
Living Imageソフトウェアのトリッキーな機能は、取得した画像を自動カラースケールで表示することです。選択したスケール値に従って、新しく取得した画像を自動的に表示するようにスケールを事前に設定するオプションはありません(プロトコルステップ6.2を参照)。この状況では、研究者は画像を1つずつ選択した最大値と最小値に手動で変更する必要があります。その結果、経験の浅いユーザーや十分なトレーニングを受けていないユーザーは、取得セッション中に適切な読み出しを得ることができず、その時点でデータを誤解させたり、重要な情報を失ったりする可能性があります。そのためには、パイロット実験が有益です。
概念実証実験デザインに関する最も一般的な質問の1つは、治療期間と用量の選択方法です。新しい化学物質の場合、これらのパラメータは通常、in vitroでの化合物の効力と選択性によって定義され、薬物代謝および薬物動態(DMPK)によって生成されたデータおよびin vivoでの有効性試験前に実施された忍容性試験と組み合わされます。要約すると、細胞内の寄生虫を選択的に殺すことができる化合物を特定した後、最初のADME実験(吸収、分布、代謝、排泄)をin vitroで実施し、化合物の水溶性、細胞透過性、代謝安定性などのパラメーターを推定します。化合物がin vitro特性(通常は標的候補プロファイルで定義される)のバランスが良好である場合、これらの候補は健康なマウスでのin vivo薬物動態(PK)研究に進み、血液中(およびおそらく組織内)での化合物曝露の概要を説明し、さまざまな用量レベルでの忍容性の一般的なアイデアを提供します17。34,43.理想的には、ほとんどの感染症におけるPK評価の目標は、EC50/EC90濃度44(寄生虫のそれぞれ50%または90%の成長を殺す、または少なくとも90%の成長を阻害する有効濃度)を超える遊離血漿濃度(血漿タンパク質結合を補正)に十分に長期間到達する可能性を決定することである。一定の用量レベルで十分な曝露が達成された場合、このレジメンはシャーガスBLIモデルを使用した有効性試験中に使用できます。ドラッグリポジショニング研究には、in vitroおよびin vivo PKデータが利用可能である必要があります。薬物再プロファイリングの良いスタートは、PubChem45のような化学データベースであり、これらは、アロメトリックスケーリング46を使用してマウスに変換し、試験すべき安全で毒性のない治療レジメンを推定することができる認識されたデータを提供する。しかし、必ずしもそうではありません。PK研究は、学術科学においてまだ見過ごされている分野であり、PKの結果を発表している製薬会社はほとんどありません。創薬科学コミュニティは、in vivo PK評価をin drug efficacy assays(薬力学)とともに含めることを推奨しています47。したがって、前臨床イメージングは化合物測定と同時に互換性があり、この関連するアプローチによりデータの堅牢性が向上します。
さらに、マウスの取り扱い、体重、健康状態は、実験全体を通じて監視されます。猫背、震え、バランスの喪失、動きたくない、摂食や飲酒をためらう、衰弱、またはグループまたは個々のマウスの状態に存在するその他の異常などの毒性および副作用の兆候は、前臨床試験に登録し、報告する必要があります。.光学イメージングの目標の1つは、動物の健康を確保することです。したがって、人道的なエンドポイントは、「しかめっ面スケール48」に記載されている痛みの徴候を持つマウスに適用する必要があります。また、マウスの体重は、BLIの獲得中、およびより頻繁には薬物投与およびCTX治療中に毎週体重を量りました。動物福祉の規制に従い、体重が20%以上減少したマウスは、直ちに人道的に安楽死させなければなりません。
T. cruzi生物発光モデルは、シャーガス病の新たな治療法の発見と開発のための最先端の実験モデルとなりました。T. cruzi感染症とシャーガス病49の主要な特徴を再現するモデルで、寄生虫症のリアルタイムモニタリングと、既知の作用機序に関連するさまざまな有効性プロファイルを持つ化合物の鑑別を可能にします。BLIは、感染組織を特定する際の自己主張を強化する技術です。これにより、感染組織の正確な選択を、T. cruzi 研究50,51 ですでに適用されているすべての古典的な方法を含む、幅広いアプローチで使用できます。さらに、研究者は最先端の技術を探求し、新しい技術を開発することができます33。さらに、BLIは、動物の健康の改善と、3Rの原則10,35に従って、より合理的な使用を一度に提供します。
顧みられない熱帯病に焦点を当てたいくつかの研究グループは、in vivoイメージングデバイスが利用できない国に配置されています。現在のシナリオを克服するために、Global BioImagingやその関連コンソーシアムのような新しい国際ネットワークは、イメージングの中核施設へのオープンアクセスを提供し、スタッフとイメージング科学者のトレーニングを改善するための行動を促進している52,53。これらのイニシアチブは、このようなフレンドリーなユーザープロトコルとともに、すべての研究者にハイエンドテクノロジーを民主化する条件を提供することができます。この方法を前臨床創薬に導入することで、シャーガス病の創薬を促進する臨床転帰の確かな有効性と予測値が得られました。

シャーガス病はラテンアメリカで流行しており、世界中で約700万人が罹患しています1。毎年、50,000人以上が死亡し、約70億ドルの経済的損失が、この病気の障害性に起因しています2。シャーガス病は、原虫のTrypanosoma cruziという原虫によって引き起こされ、哺乳類(野生および家畜)やトリアトミンベクター(半翅目、Reduviidae)3に感染するヘテロキセン性血液鞭毛虫寄生虫で、ベクター感染が確立されています。その他の重要な感染経路には、輸血、臓器移植、経口(感染したトリアトミンで汚染された食物の摂取による)4、先天性感染などがあります。非媒介性の伝播経路は、シャーガス病が非流行地域に広がる一因となっています3,5。
シャーガス病は、2つの臨床段階に現れます。急性期は、ほとんどの場合、無症候性です。症候性感染症は通常、発熱、疲労、筋肉痛、リンパ節腫脹、脾腫、肝腫大などの非特異的な徴候と関連しています。急性期は、しばしば特許寄生虫症および寄生虫の全身循環と関連しています。診断された症例の最大10%、特に経口感染症の症例で死亡する可能性があります6。慢性期は、症状が長期間存在しないことを特徴としています。時間が経つにつれて、数十年前に感染した患者の約3分の1は、通常は線維症および心筋の炎症、および/または主に巨大食道および/または巨大結腸症候群の発症に関連する胃腸障害を伴う心臓症状を示します3,5,6。
シャーガス病の病因治療は、ベンズニダゾールとニフルチモックスの2つの薬のみで構成されています。これらの駆虫剤は50年以上にわたって利用可能であり、かなりの毒性と限られた有効性を持っています5,7,8。そのため、シャーガス病患者に対して、より安全で、より効果的な新しい治療法の開発が急務となっています。
より高度で正確な技術により、シャーガス病の新たな治療法の探索を進めることを可能にする古い疑問に対する答えを得ることが可能になりました。この意味で、科学界は、感染の経過と薬効の評価に関するin vivo研究のために遺伝子組み換え寄生虫から大きな恩恵を受けています9,10,11,12。生物発光イメージング(BLI)システムに基づく縦断的アッセイにより、治療レジメン中および治療レジメン後の有効性評価が可能になり、トリパノサイド活性を有する化合物の同定につながります10,13。BLI法は、遺伝子組み換えホタルルシフェラーゼ12を構成的に発現する遺伝子組み換えT. cruzi CL Brener Luc::Neon系統11によって生成される光の定量を通じて、循環中または組織および器官内の両方で寄生虫負荷を直接測定する。
それにもかかわらず、シャーガス病BLI動物モデルおよび薬効研究が確立されてから約10年が経過した現在、この手法を支配している研究グループはごくわずかです。この事実は、適切なイメージング機器へのアクセスが減少しているだけでなく、トレーニングが不足していることや、構造化された詳細なプロトコルが利用できないためです。この方法は、顕微鏡検査による寄生虫血症の評価、血清学、または寄生虫DNA検出のためのqPCRによる臓器/組織感染評価に依存する他のアプローチに比べて、マウスの健康状態を改善し、in vivoでより堅牢で統合されたデータを生成する可能性により動物の使用を減らすことができるため、いくつかの利点があります。さらに、この方法は、薬物治療10,12後の内臓臓器の寄生虫病巣の容易な検出を可能にするため、おそらくより感度が高い。したがって、このプロトコルは、寄生虫学およびその他の感染症に関する研究グループが、技術的な手順を詳細に説明することにより、この方法論を研究室で確立するように導くことを目的としています。ここでは、Drugs for Neglected Diseases initiative(DNDi)がコーディネートする創薬活動の一環として、ラテンアメリカで初めてのシャーガス病BLIモデルをブラジルで実施した経験を共有します。

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa&trade;X-20 Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance (動物施設)</td><td>複数のサプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Revvity (旧PerkinElmer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJ Software v10.7.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software for Spectrum v4.7.1</td><td>Revvity (旧PerkinElmer)</td><td></td><td>Spectral Instruments Imaging社(ブルカー社)(https://spectralinvivo.com/software/)</td></tr><tr><td>Microsoft Officeソフトウェア</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v8.4.0</td><td>GraphPad Software Inc.が提供する</td>最も基本的な機能に使用できる「Aura Imaging」と呼ばれるライセンスフリーの解析ソフトウェア。<td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 低グルコース</td><td>Vitrocell</td><td>D0025</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 0.5% EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>LIT medium</td><td>Inハウス</td><td></td><td></td></tr>ハイ<tr><td>グロマイシンB(50mg / mL)</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grace&prime;昆虫ミディアム</td><td>シグマ-アルドリッチ&nbsp;</td><td>G9771</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>IVISBrite d-luciferin カリウム塩</td><td>Revvity(旧PerkinElmer)</td><td>122799</td><td>VivoGlo Luciferin、in vivo grade(Promega / P1043)も使用できます。D-ルシフェリン、モノカリウム塩(Thermo Scientific / 88293)またはPierceD-ルシフェリン、モノナトリウム*塩(Thermo Scientific / 88291);D-ルシフェリン、カリウム塩(GoldBio / LUCKまたはeLUCK);D-ルシフェリン、ナトリウム*塩(GoldBio / LUCNAまたはeLUCNA)*ナトリウムまたはカリウム塩の違いは、溶解度に最小限の可能性に依存しますが、in vivoの性能には影響しません。</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>シクロホスファミド (CTX)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr> <tr><td>(ヒドロキシプロピル)メチルセルロース (HPMC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>09963-25G</td><td></td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>ベンズニダゾール</td><td>ELEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポサコナゾール (ノキサフィル市販製剤)</td><td>シェリング・フォフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>・ギムサ</td><td>いくつかのサプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr><tr><td>強制針 (ステンレス鋼ストレート) - 22GA</td><td>Aton</td><td>&nbsp;CA2003</td><td></td></tr><tr><td>1 mLシリンジと31G針</td><td>複数のサプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr><tr><td>1 mLシリンジと取り外し可能な26G針</td><td>複数のサプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr><tr><td>1 mLシリンジと取り外し可能な24G X&frac34; 針</td><td>複数のサプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター0.2 & マイクロ;m</td><td>複数のサプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr><tr><td>A4 マットブラックペーパー 120gr または厚手</td><td>紙 カラー/キャンソン (複数のサプライヤーから入手可能)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>複数のサプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr><tr><td>ノイバウアーチャンバー</td> 複数の<td>サプライヤー</td><td></td><td></td>から入手可能</tr></tbody></table>

薬効研究のためのシャーガス病モデルマウスのin vivo生物発光イメージングの謎解き

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

シャーガス病、リーシュマニア症、アフリカトリパノソーマ症などのヒト原虫病の公衆衛生への影響を抑制し、減少させるためには、新薬やワクチンの開発を加速する必要があります。しかし、このプロセスには、寄生虫の生物学的な問題や疾患の病因が非常に複雑であること、顧みられない熱帯病によくあるように、研究開発のための資金が比較的限られていることなど、困難が伴います。したがって、これらの疾患の研究を進めるためには、感染や疾患の主要な特徴を十分に再現し、リソースを合理的に利用できる in vitro および in vivo 研究モデルが不可欠です。その一例がシャーガス病の in vivo bioluminescence imaging(BLI)マウスモデルで、ルシフェラーゼを発現する Trypanosoma cruzi 寄生虫が生成する長波長光を高感度に検出することができます。この手法が in vivo での薬効研究の標準的なアプローチになっているにもかかわらず、適切なBLI機器がすぐに利用できる場合でも、機器の取り扱いや品質管理手順の適用に関する適切な実践的なトレーニングが不足しているため、研究グループは依然としてその実装に苦労する可能性があります。このシナリオを考慮して、このプロトコルは、シャーガス病や他の感染症マウスモデルのいずれかについて、BLIの経験がほとんどまたはまったくない研究グループでのプロトコルの実施を容易にする詳細とともに、実験の計画からデータ取得および分析までのガイドとなることを目的としています。

ルシフェラーゼを構成的に発現するトランスジェニック寄生虫に基づく適切なマウスモデルを使用して、宿主への害を最小限に抑える主要なヒト T.cruzi 感染特徴を再現することが可能であり、宿主の全身BLIによる寄生虫の長期的(生涯的)な方法で、最大数ヶ月にわたって寄生虫をリアルタイムで追跡することができる12。
図3 は、BALB/cマウスの感染後1日目から150dpiまでのCL Brener Luc::Neon感染の時間経過を示すパイロット実験を示しています。最初の20dpiでは、生物発光によって推測される寄生虫負荷が増加し、これは寄生虫症のピークに典型的なもので、その後、マウスの免疫制御により寄生虫負荷が急激に減少します。したがって、感染の急性期は最初の50dpiと見なされます。慢性期は、感染が100〜150dpiの一定の生物発光速度に達したときに定義されます。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg"> 図 3: モデルを理解する。BALB/cマウスにおけるTrypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon感染の動態(n = 11)。トップパネル:腹腔内注射による1 x 10³血流トリポマスティゴテスによる感染後150日間の異なる時点からの腹側および背側の生物発光画像(dpi)。輝度(p / s / cm2 / sr)での生物発光シグナルのヒートマップスケール(Log10)。カラーコード:パープル= 5 x 103;赤 = 1 x 107.底面パネル:全身マウスの全フラックス(p/s)中の生物発光シグナル定量。データは、平均値 (線) と標準偏差 (影付きの領域) で表されます。このマウスモデルでは、感染の急性期と慢性期に定義された期間がオレンジ色で強調表示されています。非感染マウス(n = 3)の発光平均値を閾値(薄い灰色の線)として示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
感染の主な段階はマウスモデルでよく再現されているため、治療結果も予測できます。したがって、BLIは現在、化合物の有効性の可能性と開発パイプラインの進行に関する意思決定を支援する概念実証研究を通じてトランスレーショナルサイエンスに適用されています10,27。急性マウスモデルでは、感染が寄生虫症のピーク(約14-21 dpi)に達したときに経口治療を開始する必要があります。これは、血流中の多数のトリポマスティゴテス(約1 x 105トリポマスティゴート/ mL - データは示されていません)および全身感染によって特徴付けられます。慢性期では、マウスの治療は100dpiで開始され、寄生虫の負荷が比較的低く、安定したサブパテント寄生虫血症を示します。
本研究では、上記のプロトコールを抗寄生虫薬の評価に応用することを実証するため、シャーガス病の治療に用いられる標準薬であるベンズニダゾール(BZ)と、シャーガス病の臨床試験で失敗し、またin vitroおよびin vivoでT. cruziに対する抗寄生虫薬としても効果がないことが示されているステロール14α-デメチラーゼ(CYP51)阻害剤であるポサコナゾール(Posa)の治療効果を比較しましたこのプロトコル13,18,28,29,30に記載されているBLIモデルを含む。
急性マウスモデルでは、グループあたり6匹のマウスのコホートを、1日1回、強制経口投与31 回、20 mg / kgのPosaまたは100 mg / kgのBZで20日間経口治療しました。.マウスにもBZを1日1回100mg/kgで5日間投与し、短時間治療の効果を評価しました。化合物の排除後(治療終了後10日後)、BLI陰性のマウスは免疫抑制されましたが、これは寄生虫学的治癒が達成されない場合に感染の再発を促進する状態です(図4A)。ポーザ処理により、治療終了時に生物発光で推論される寄生虫負荷が99.49%±0.27%(平均±標準偏差)減少し、薬物化合物の排泄期間中、非感染マウスと同程度のレベルに留まりました(ただし、40dpiで一過性のシグナルを示すマウス#3、44dpiで弱いBLIスポットを示したマウス#2を除く)。非治療群と比較して、BZ治療を20日間行うと、治療終了時の生物発光で推論される寄生虫の負担が100%±0.01%減少しました。対照的に、BZによる5日間の短時間治療は、19dpiで99.98%±0.03%の減少をもたらしました(閾値レベルと同様)。しかし、この場合、BLIの減少は一過性であり、その後の獲得では、すべてのマウスが感染再活性化を示しました(図4B)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg"> 図4:シャーガス病急性モデルにおける生物発光イメージングによる概念実証実験デザインと結果 (A)化合物の有効性評価のための前臨床試験のためのシャーガス病急性マウスモデルにおけるタイムラインプロセスの概略図。黒い点:イメージングの時点。薬液とオレンジ色のバー:それぞれ治療の開始と終了。シリンジのアイコン:シクロホスファミド注射。DPI:感染後日。カラーコード:灰色=未治療の感染症。オレンジ=治療期間;青=化合物の除去フェーズ。黄色=免疫抑制期間。(B)Trypanosoma cruziの治療の時間経過。左パネル:BALB/cマウスの腹側生物発光画像(i)未処理または(ii)ポサコナゾール(Posa)を20 mg/kg、(iii)ベンズニダゾール(BZ)を100 mg/kgで20日間処理、(iv)BZ(100 mg/kg)を(n = 6/群)で5日間処理して20日間処理したマウス。すべての治療は、1日1回強制経口(10mL/kg)による投与でした。Log10スケールのヒートマップは、低レベル(青)から高レベル(赤)までの生物発光シグナル強度を示します。右グラフ:生物発光イメージングデータの全身定量化。データは、平均値 (線) と標準偏差 (影付きの領域) で表されます。キー:薬液:治療開始(14 dpi);オレンジ色のバー:治療終了(18 dpi / 33 dpi);シリンジアイコンシクロホスファミド注射(44-53日目から);オレンジ色の点:ex vivo手順によって分析されたマウス。§ 尿中のD-ルシフェリン漏出のため、データは除外されています。(C)臓器および組織におけるT. cruzi病巣検出のためのEx vivo手順。プレートの分配キーは、図の下部に表示されます(BioRender.com:ZY26LG8AOFで作成)。in vivoパネルと同じ放射輝度スケール。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このモデルでは、抗寄生虫治療により、寄生虫の負荷をBLI検出限界の1000寄生虫未満に減らすことができます。したがって、マウスはBLI陰性10として現れる。寄生虫学的治癒を確実に達成するためには、シクロホスファミド治療を用いてマウスの免疫抑制を促進する必要がある29,32。薬物治療後もまだ検出できない寄生虫量を持つマウスは、免疫抑制後にBLI陽性になります。この効果は、寄生虫の再発を促進する急性モデルでのポーサ治療によってより広範囲に示されます。この実験では、寄生虫組織の親和性を評価するために、生物発光シグナルが最も低いマウスでex vivo手順を実行しました(図4C)。未治療のマウスは、特に消化管(TGI)および内臓脂肪や腸間膜などの関連組織で、強い生物発光シグナルを示します。さらに、皮膚は寄生虫の持続性に関連する部位でした。Posaで治療されたマウスは、結腸、腸間膜、および内臓脂肪により限定された低強度の生物発光スポットを示しました。一方、根治的治療レジメンでBZ100mg/kgを20日間投与したマウスでは、免疫抑制下でも生物発光シグナルは検出されません。したがって、生物発光シグナルが1000寄生虫10の閾値レベルを超えて上昇する条件を促進し、内臓を露出させることで感度を高めた後、BZ 100 mg / kgを20日間投与することで無菌治癒が得られると考えられる。無菌治癒の評価は、以前に異なる技術によって検証されていた10,13,17,33,34。
同様の研究デザインが慢性モデル(図5A)に適用され、マウス(n = 6 /グループ)が感染後100日目に治療を開始しました。この時点で、Posa 20 mg / kg、BZ 100 mg / kg、または1日1回10 mg / kgを20日間経口投与しました。.薬物排除期間後、BLI陰性マウスは免疫抑制されました。さらに、無菌治癒を評価するために、免疫抑制期の終了時にまだBLI陰性であったマウスを ex vivo 分析に供しました。
慢性感染症では、20 mg / kgでのポーザによる治療により、治療終了時の生物発光±推測される寄生虫負荷が95.03%6.18%減少し、薬物排除期間中は非感染マウスと同様のレベルにとどまりました。.免疫抑制後、マウスの大部分は、BLIシグナルと分布のレベルが変動することを示しました(図5B)。 ex vivo 手順により、Posa で処理された全身 BLI 陰性マウス 1 匹が、 ex vivo 検査で検出可能な結腸に生物発光スポットがあることが明らかになりました (図 5C)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg"> 図5:生物発光イメージングによるTrypanosoma cruzi感染の慢性モデルにおける薬物評価実験デザインと結果。 (A)慢性シャーガス病マウスモデルの実験設計の模式図。黒い点:イメージングの時点。薬液とオレンジ色のバー:それぞれ治療の開始と終了。シリンジのアイコン:シクロホスファミド注射。Dpi:感染後日。カラーコード:グレー=未治療の感染症。オレンジ=治療期間;青=化合物の除去フェーズ。黄色=免疫抑制;ライラック=再発。(B)シャーガス病慢性モデルにおける治療効果の縦断的評価。左パネル:BALB/cマウスの腹側BLI (i)未治療または(ii)ポサコナゾール(Posa)を20mg / kgで20日間治療。(iii)100 mg / kgのベンズニダゾール(BZ)、および(iv)10 mg / kgのBZ(n = 6 /グループ)。すべての治療は、1日1回強制経口投与されました。右のグラフ:腹側と背側の全磁束の生データの合計。キー:薬液:治療開始(102 dpi);オレンジ色のバー:治療終了(121 dpi);黄色のバーと注射器のアイコン:シクロホスファミド注射(131-142日目から)。オレンジ色の点:ex vivo手順で分析されたマウス。!マウスは麻酔中に死亡しました。<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;">マウスが腹部の異常を表示します。ヒートマップスケール(Log10)は、低レベル(3 × 105、青)から高レベル(1 × 10、7、赤)までの生体発光強度を放射輝度単位で示します。(C)組織中のT. cruziの向性菌のEx vivo分析。100 mg / kgのPosaおよびBZで治療した後の免疫抑制されたin vivo BLI陰性マウス、または未治療でシグナルが最も低く、10 mg / kgグループでBZのマウスから切除された臓器の生物発光検出。プレートの分配キーは、図の下部に示されています(BioRender.com:ZY26LG8AOFで作成)。輝度スケールはin vivoパネルと同等です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
100 mg / kgでのBZによる治療は、生物発光を122 dpiで閾値レベル(93.87%±2.14%)に減少させ、実験の終了までそれ以降に減少させました。. ex vivo 解析を考慮すると、BZは免疫抑制状態や内臓を検査しても生物発光シグナルの回復を示さなかったため、100%(6/6マウス)の治癒率を達成しました。つまり、再発がないということです。それにもかかわらず、低濃度のBZ治療レジメンは、生物発光のわずかな減少(85.95%±18.43%)をもたらしましたが、マウスはその後のすべての時点で検出可能な生物発光シグナル病巣を示し続けたため、治癒はありませんでした。したがって、このモデルにより、効果のない治療 (ポサコナゾールとベンズニダゾールによる最適でない治療) と効果的な治療 (ベンズニダゾールによる最適な投与と治療期間) を定量的に区別できます。
補足図1:レポーター遺伝子mNeonGreen蛍光の測定によるT . cruzi 集団のルシフェラーゼ発現の感染前解析。 CL Brener Luc::Neon寄生虫によって構成的に発現されるmNeonGreen蛍光タンパク質のフローサイトメトリー。寄生虫数(Y軸)をmNeonGreen蛍光強度(X軸)で正規化したヒストグラム。内部凡例は、分析された株と形状、蛍光の中央値、および蛍光母集団の割合を示しています。ゲートラインは、CL Brener野生型(WT)株によって非蛍光制御として定義されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:BLI測定における分析表の例。図4Bに示す代表的な結果で使用された急性モデルにおける感染後19日目の生物発光イメージング定量から得られた生データ。グループの説明:非感染マウスとして制御(n = 3 /グループ)。未治療の感染マウスとしてのビヒクル;ポサコナゾール (Posa) を 20 mg/kg で 20 日間;ベンズニダゾール (BZ) を 100 mg/kg で 20 日間;BZ を 100 mg/kg で 5 日間処理しました (n = 6/群)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここで提供されるプロトコルは、 Trypanosoma cruzi 感染の生物発光モデルで薬効研究を実施するための詳細な手順を、データの取得、分析、および解釈に焦点を当てて説明しています。技術的な問題を最小限に抑えるためのトラブルシューティングと品質管理手順も提供されます。

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