Name: 磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学ぶMACS法によるマウス視床下部ミクログリア単離法。高純度・高収率で細胞を取得し、栄養と脳機能の関係、ミクログリアと神経細胞の相互作用を研究するのに有用です。

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ANは、フランス国立大学研究所(IUF)、ボルドー大学、フランス脳研究財団(FRC)、GLN(Lipid-Nutrition Group)、国立研究機関(ANR、PRC 2023-MicroNRJ)の支援を受けています。CAは、Fondation pour la Recherche Médicale(FRM-ARF201809006962)の支援を受けました。このプロジェクトは、MSCA Doctoral Networks 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

記載されているすべての動物実験は、欧州連合の勧告(2013/63/EU)に厳密に準拠して実施され、ボルドー大学の地元の倫理委員会(CEEA50)およびフランス高等教育研究イノベーション省によって承認されました(承認されたプロジェクトNTS-FR-619193 v.1、23-12-2022の非技術的要約)。
次のプロトコルは、平均生後 2 か月から 4 か月の成体 C57BL/6 マウスで実行されます。しかしながら、CNSの免疫細胞のランドスケープが変化し、常在するマクロファージおよび単球の割合が増加する可能性があること(例えば、老化および神経変性において)を考慮すると、全てのマウスの年齢および条件において実施することができる。
1. 溶液の調製
注:以下の容量および溶液は、厳密にはCd11b+細胞の単離を参照しています。
<ol><li>サンプル数に基づいて、必要なD-PBS/0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)の総量を決定します。市販のD-PBSとカルシウム、マグネシウム、BSA粉末を使用して溶液を調製します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>標識解離チューブ(Cチューブ)を調製し、成人の脳組織解離キットに付属の1,900 μLのバッファーZをそれぞれに充填します( 材料表を参照)。酵素を解凍し、次のステップで必要なすべてのバッファーとともに氷上に保ちます。</li>
	<li>氷上での灌流(ステップ2.6)に必要な1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)( 材料表を参照)を調製し、常設します。各動物につき10mLに10%を加えた過剰量を計算します。</li>
	<li>RT-qPCR解析では、サンプルごとにqPCRバッファーを調製します:2.5 μLのチオグリセロール+ 250 μLの溶解バッファー、RNAを精製するための市販のキットを使用します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>タンパク質の定量には、ホスファターゼ阻害剤カクテルとプロテアーゼ阻害剤カクテルを哺乳類抽出バッファーで1:100に希釈して溶解バッファーを調製します( 材料の表を参照)。</li>
	<li>活性酸素種(ROS)の検出および食作用アッセイには、市販の10x HBSSから1x HBSSを調製します( 材料表を参照)。次に、1x HBSSに0.2% BSAを添加してFACSバッファーを調製します。</li>
</ol>2.脳の除去
<ol><li>キシラジンの20 mg / kgの用量で動物を鎮静させます。次に、400 mg / kgのペントバルビタールの過剰摂取でマウスを安楽死させ、解剖トレイに仰向けに置きます。. 注:動物を安楽死させるための他の麻酔薬の組み合わせも機能します。</li>
	<li>10 mLのシリンジに10 mLの氷冷した1x PBSを入れ、バタフライ21 G針に取り付けます。</li>
	<li>マウスが完全に麻酔をかけられたら(反応の欠如を確認するために足をつまんで確認します)、呼吸が止まり、心臓が細動になったら、鉗子で皮膚をテント張り、最後の肋骨と胸骨のレベルで胸腔をはさみで開きます。</li>
	<li>ハサミを使って、胸郭の側面に沿って胸郭の上部に向かって深く切り込みを入れ、心臓を露出させます。</li>
	<li>21 Gの針を左心室の遠位部分に挿入します(針の約1/3が心室の内側にあることを確認してください)。すぐにハサミを使用して右心房を切開します。</li>
	<li>氷冷した1x PBSを10mL注入して、循環免疫細胞から脳をきれいにします。 注:脳を目視でチェックして、脳が清潔で十分に灌流されていることを確認します。</li>
	<li>マウスの頭を切り取り、脳を慎重に抽出し、氷で満たされてアルミホイルで覆われたシャーレの上に置きます。 注:ペトリ皿とホイルは、脳の部分を見るのに役立ちます。代謝活動を制限するために、脳のピースを刻んでいる間、涼しい環境を維持することは有益です。</li>
	<li>鉗子を使用して視床下部を分離し、かみそりの刃で細かく切ります。<ol><li>視床下部を特定して解剖するには、脳を逆さまにして置き、皮質が腹側になり、視床下部が上面の背側に見えるようにします。湾曲した鉗子を使用して、第3脳室の両側の脳の底部にある視床下部を分離します。成体C57BL/6マウスの視床下部の平均重量は15mgです。 注意: 脳の部分はできるだけ小さくする必要があります(<0.5 mm)。小さな断片に切断することは、細胞の解離を改善し、より高い収率を可能にするため、重要なステップです。</li>
	</ol></li>
	<li>視床下部の断片を、1,900 μLのバッファーZをあらかじめ充填した解離チューブ(Cチューブ)に集めます(ステップ1.2)。 注:アッセイを実行するのに十分なミクログリア細胞の良好な収量を得るには、チューブごとに最低2つ(タンパク質定量用)または3つ(qPCRおよびRNAseq用)の視床下部をプールします。</li>
</ol>3.組織の解離
注意: すべての手順は氷上で実行する必要があります。どのステップでも細胞懸濁液をボルテックスしないでください。1,000 μLのピペットで慎重に混合するだけです。
<ol><li>表1に従って酵素ミックス2を調製します(すべてのチューブの総容量+ 10%の過剰量を計算)。各Cチューブに、ミックス1に含まれる酵素50 μL(表1を参照)と酵素ミックス2 30 μLを加えます。すべての酵素は、成体脳組織解離キットに含まれています(材料の表を参照)。</li>
	<li>Cチューブを閉じ、メーカーの指示に従って、加熱ブラケット付きの解離器に逆さまに置きます。プログラム 37C_ABDK_02を実行します。</li>
	<li>15 mLのスナップチューブ( 材料表を参照)を準備し、その上に70 μmのストレーナを取り付けます。ストレーナーを2mLのD-PBSで濡らします。</li>
	<li>解離/消化プログラムが終了したら、C-Tubeをストレーナーに空にし、200 μLのチップで引っ掻いて、細胞ろ過を増やし、フィルター上の組織ホモジネートの付着を減らすことで細胞損失を減らします。</li>
	<li>チューブを2 x 5 mLのD-PBSで洗浄し、洗浄液を空にしてストレーナーに付着させ、洗浄液の間に200 μLのチップで引っ掻きます。</li>
	<li>300 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。 表1に従って、細胞ペレットを適切な量の冷たいD-PBSで慎重に再懸濁します。</li>
	<li>直ちに450 μLの密度勾配試薬(デブリ除去溶液、 材料表を参照)と慎重に混合し、2 mLの冷D-PBSを非常に穏やかに重ねます( 表1を参照)。 注:異なる密度グラジエント層を得るには、D-PBSを1 mLピペットで一度に1 mLずつ、可能な限り「乱れ」を抑えながら、一滴ずつゆっくりと重ね合わせる必要があります。</li>
	<li>3,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、ゆっくりと加速し、ブレーキを遅くします(9がフルと等しい場合は5を使用します)。</li>
	<li>3つのフェーズが形成されます。上部の 2 つのフェーズを完全に吸引し、破棄します。3番目のボトムフェーズを誤嚥しないように注意してください。</li>
	<li>1800μLの冷たいD-PBSを充填し、チューブを3回静かに反転させます。</li>
	<li>1,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、全加速および全ブレーキで遠心分離し、上清を完全に吸引します。2 mLのD-PBS/BSA でゆっくりとピペッティングして、細胞ペレットを慎重に再懸濁します。</li>
</ol>4. CD11b+細胞の磁気的分離
<ol><li>300 g×g、4°Cで 10分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。細胞ペレットを90 μLのバッファーD-PBS/BSA に慎重に再懸濁します。</li>
	<li>CD11b-マイクロビーズ混合物10μLを加え、ピペットでよく混ぜます。</li>
	<li>氷上ではなく、冷蔵庫で2〜8°Cで15分間インキュベートします。1 mLのD-PBS/BSAを加えて細胞を洗浄し、300 × g で4°Cで10分間遠心分離します。上清を完全に吸引します。500 μLのD-PBS/BSA に慎重に再懸濁します。</li>
	<li>画面の指示に従って、セパレーターで POSSEL2 プログラムを起動します。小さな柱( 材料の表を参照)を磁場の中に置きます。 注:マグネティックセルのソーティングには、予想される平均セル数に応じて、小さいカラムまたは大きなカラムを選択できます。小さなカラムの容量は最大1 × 107 、大きなカラムは最大1 × 108です。視床下部などの小さな構造から細胞を単離する場合は、小さなカラムが推奨されます。大きなカラムを使用する場合、試薬の容量は異なります(製造元の指示を参照)。</li>
	<li>カラム( 材料表を参照)を500 μLのD-PBS/BSAで濡らします。さらなる分析のために細胞の陰性画分(CD11b-)が必要な場合は、カラムの下にコレクションプレートを置き、カラムに細胞懸濁液を塗布します。</li>
	<li>一度に500 μLのD-PBS/BSAをカラムに添加し、バッファーがカラムを通過するのを待つたびに、3つの洗浄ステップを実行します。 注:カラムの上部が乾燥するのを防ぐことが重要であるため、すべてのバッファーが通過するまで待たないことをお勧めします。</li>
	<li>CD11b- フラクションの総流出物を収集プレートのウェルから15ミリリットルのチューブに移します。</li>
	<li>カラムをセパレーターから取り出し、5 mLのチューブにセットし、1 mLのD-PBS/BSAをカラムにピペットで注入します。</li>
	<li>カラムに付属のプランジャーをしっかりと適用することにより、磁気標識されたセル画分をすぐに洗い流します。</li>
	<li>最終的には、血球計算盤またはその他の方法でCD11b + 細胞をカウントします。視床下部あたり~15,000個の細胞が期待できます。</li>
	<li>細胞懸濁液を300 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。</li>
</ol>5. 分析
<ol><li>RT-qPCR解析では、細胞ペレットをqPCRバッファー(調製についてはステップ1.3を参照)で再懸濁し、mRNAが抽出されるまでチューブを-80°Cで保存します。トータルRNAを単離し、MIQEガイドライン14に従って処理および分析します。最後に、cDNAを合成し、RT-PCRデバイスを使用してqPCRを実行します。使用されているすべての市販キットについては、 材料の表 を参照してください。</li>
	<li>タンパク質の定量には、細胞ペレットをD-PBS(BSAなし)で少なくとも2回洗浄してBSAを除去します。次に、2つの視床下部から細胞ペレットを20 μLの溶解バッファーで再懸濁します。タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質の定量を進めます( 材料の表を参照)。 注:我々は、セリン/スレオニンキナーゼ活性アッセイを実施するためのタンパク質を定量するために、製造業者の指示15 に従った。</li>
	<li>ミクログリア細胞内の活性酸素種(ROS)を検出するには、ペレットを1x HBSSに再懸濁します。フローサイトメトリーアッセイのキットの製造元のプロトコルに従って細胞を治療します( 材料の表を参照)。次に、処理した細胞を200 μLのFACSバッファーに再懸濁し(調製についてはステップ1.5を参照)、FACSを実施して酸化ストレスを受けた細胞を検出します。</li>
	<li>食作用アッセイでは、選別した細胞をD-PBS/BSAで蛍光ラテックスビーズ( 材料表参照)と30分間インキュベートします。ビーズの数を、セルあたり平均4つのビーズを持つように調整します。次に、300 × g で4°Cで7分間遠心分離し、200 μLのFACSバッファーに再懸濁し、FACS(λex 575 nm; λem 610 nm)による蛍光発光を読み取ります。</li>
</ol>

In vitroアッセイのためのMACSを用いたマウスからの視床下部ミクログリアの単離

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</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

現在のプロトコルは、磁気活性化細胞ソーティングによる、新たに灌流された成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの分離を示しています。上記の結果は、単離された細胞の純度と生存率、およびこの方法が生体外でミクログリアを 機能的に特徴付ける方法の有効性、例えば食作用活性やROS産生定量化を通じて確認されています。特定の細胞集団を単離するための古典的な方法は、ミクログリア細胞にも使用できます。密度勾配分画は、サイズや密度に応じて異なる細胞とその粒子を分離するためのよく知られた方法です。この技術は、初代ミクログリアの単離と培養に適用できる可能性があります。しかし、成体ミクログリアの精製には、蛍光活性化細胞ソーティングまたは免疫磁気細胞ソーティングを用いて、単離された脳細胞をさらにソーティングする必要があります。
具体的には、FACSは蛍光タグ付きの生化学的抗体に依存して細胞を標識し、サイズや代謝状態など、表面マーカーを超えた多数の変数に従って細胞を区別します。それにもかかわらず、細胞精製のプロセスは遅く、穏やかではないため、死細胞の数が増えるだけでなく、かなりの初期収量が必要になります。したがって、視床下部ミクログリアの数が少ないことはすでに制限要因です。MACSは、特定の細胞エピトープに対する特定の抗体に結合した磁気ビーズを利用し、ミクログリアダイナミクスに関する領域特異的な研究を容易にする適度な初期収量で機能する可能性があります。マイクロビーズの強い磁場のため、最小限のラベリングが必要です。したがって、FACSよりも穏やかで、細胞の完全性の維持を保証します。さらに、MACSは、多数のサンプルを同時に処理する必要がある場合に、FACSよりも高速です。これにより、高い細胞生存率を維持できるという明確な利点が得られますが、これは小さな初期収量からももたらされます(表3)。
視床下部からのミクログリアの単離における主な課題は、MACS技術を通じて効果的に対処できることであり、十分な最終収率を達成することと細胞の完全性を維持することが含まれます。必要な細胞量は、分離後に選択した解析の性質によって異なります。例えば、 in vitro でのミクログリアの機能的役割の研究には、かなりの数の細胞が必要です。このことは、分離プロセスに進む前に、同じ条件の異なるマウスから同じ脳領域の最初のプールを得ることの重要性を強調しています。逆に、高精度のシングルセルシーケンシングなどの手法では、大きな細胞集団を必要とせず、ひいては複数のマウスをプールする必要もありません。
細胞収量を最大化するには、プロトコールの特定のステップを順守することが重要です。効果的な解離は、視床下部を細かく切断し、プロセス中にそれらがチューブの底にあるバッファーに維持されるようにすることによって開始されます。次に、機械的解離と細胞外マトリックスの酵素的分解の組み合わせにより、有意に高い細胞収量が保証されます。しかし、37°Cで行われた酵素解離は転写および翻訳変化を誘発する可能性があるため、結果の解釈には非常に注意する必要があります19。技術的に媒介される変化を防ぐために、転写阻害剤および翻訳阻害剤による適切な制御を使用することができる19。また、冷蔵室などの低温で酵素解離に進むことも可能であり(効果が低下する可能性があります)、解離は酵素よりも機械的効果に依存する場合があります。解離後、細胞懸濁液を予備洗浄してストレーナに移し、細胞の損失を防ぐためにチューブをさらに2回徹底的に洗浄します。もう1つの重要なステップは、密度勾配遠心分離と異なる層の形成によって達成される破片とミエリンの除去です。したがって、かなりの最終収量を達成するには、視床下部組織と細胞懸濁液の両方を細心の注意を払って取り扱い、代謝を遅らせ、 in vivo 表現型を維持するために常に氷上に保持する必要があります。
また、ミクログリアの最高純度を達成し、ミクログリア細胞の表現型を維持するためには、細心の注意を払うべき点があります。最初に、4°Cで行われる灌流は、すべての循環CD11b+ 細胞の排除に重要であり、最高のミクログリア純度を確保します。しかし、血液脳関門の破裂の場合、循環免疫細胞の割合が高くなると、脳にコロニーを形成し、ミクログリア自体の研究が妨げられます。この問題を軽減するために、別のアプローチとして、CD45抗体に結合したマイクロビーズを利用した二次的な磁気絶縁を実施します。CD45は、マクロファージ20 において高い発現を示す細胞表面マーカーであり、このラウンドのその後のフロースルーは、ミクログリア細胞のみを含む。2ラウンドの磁気絶縁を使用するこの戦略は、プロセスの特異性を高めます。それにもかかわらず、追加の時間がかかるため、細胞の完全性やミクログリアの表現型が中断される潜在的なリスクがあります。したがって、細胞の機能特性と完全性を維持するための重要な要素は、脳組織を迅速に分離し、解離プロセスが開始されるまで氷上に保持することです。要約すると、この分析的アプローチは、ミクログリアの機能と行動の理解を深め、視床下部での動的応答に関する貴重な洞察を提供します。

ミクログリアは全神経細胞の5〜20%に相当し、卵黄嚢の赤骨髄前駆細胞に由来し、胚の日E9.5 1,2頃に発達中の脳にコロニーを形成し始める唯一のグリア細胞です。それらは、骨髄由来の細胞3とは無関係に、ゆっくりと自己再生を経る能力を持つ長寿命の細胞です。最も高度に動的な細胞の一部として、それらは文脈的および環境的な手がかりに応答して多様な表現型を獲得することができます2,4。その活動を調節できるシグナルの中で、中枢神経系(CNS)の損傷、ニューロンの活動、および栄養素が最も強力です。ますます多くの研究が、怪我、神経変性疾患、および肥満におけるミクログリアの重要な役割を示しています2,5,6。それにもかかわらず、生理学的プロセスと病態生理学の両方におけるミクログリアの正確な役割については、さらなる研究が必要です。したがって、DNA、RNA、タンパク質の局在化、定性的比較、およびミクログリアの形態学的特性評価にはin situ研究が適切であるため、さまざまな条件下でのそれらの転写、代謝、および機能の特性評価は非常に重要であり、それらの分離が必要です。
ミクログリアの単離には、Percoll勾配法7、フローサイトメトリー細胞選別法(FACS)8、磁気活性化細胞選別法(MACS)など、さまざまな手法が記載されています。適切な分析法の選択は、研究の目的と、ダウンストリームアプリケーションに必要な純度のレベルによって異なります。成体マウスの脳、特に視床下部のような小さな脳構造から純粋なミクログリアを単離することは、ミクログリア細胞の数が限られているため困難です。Miltenyi技術を使用した視床下部の自動穏やかな解離により、比較的高いミクログリアの収率を短時間で精製することができ、gentleMACS Octo Dissociatorを使用して最大8つのサンプルを同時に進めることができます。
組織の均質化に続いて、MACSカラムベースの技術と超磁性ナノサイズのCD11b+ビーズを使用したミクログリアの精製が行われます。したがって、すべてのサンプルはまったく同じ方法で処理され、無傷のCD11b+細胞が得られます。CD11bはミクログリアのみに存在するのではなく、マクロファージや単球を含む他の骨髄系譜細胞にも発現していることは注目に値する9。これを制限するために、視床下部抽出の前に氷冷生理食塩水による脳灌流(プロトコルステップ2.6を参照)は、ほとんどの骨髄細胞の排除を確実にし、常在マクロファージまたは血管に付着したマクロファージの潜在的に小さな部分のみを残します。健康な定常状態の中枢神経系の常在マクロファージおよび単球は、全脳免疫細胞のわずかな割合を構成する(それぞれ~10%および<2%)10,11。したがって、脳細胞をCD11b+ビーズで選別すると、ミクログリアとマクロファージの両方を単離することができますが、大多数はミクログリアです。
ミクログリアの最終収量とその生存率の維持により、特定の脳領域を解析できる利点を活かして、ex vivoおよびin vitroアッセイを行うことができます。最新の証拠は、ミクログリア集団が非常に不均一であり、領域特異的な遺伝子発現と形態学的特性および機能を表していることを示しています2,12,13。したがって、現在のプロトコルは、地域特異的な方法で成虫のミクログリアを分離および分析することを目的としています。実際、成体の視床下部ミクログリアの遺伝的、転写的、翻訳的プロファイルを、RT-qPCRやRNAシーケンシングなどの方法を用いて、またin vitro機能解析を行うことで特徴づけることができます。

<table><tbody><tr><td>成人脳解離キット</td><td>Miltenyi</td><td>130-107-677</td><td>このキットには、緩衝液Z、緩衝液Y、酵素AおよびP、破片除去液、緩衝液A(酵素Aを溶解する)が含まれています。</td></tr><tr><td>アルブミンウシ FrV BSA</td><td>EuroMedex</td><td>04-100-812-C</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (ミクログリア) Microビーズ、ヒトおよびマウス - 小型</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-636</td><td></td></tr><tr><td>CellROX グリーンフローサイトメトリーアッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>C10492</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ、スナップポップ蓋 15 mL</td><td>CellTreat</td><td>978449</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウム、グルコース、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C チューブ</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>ヒーター付き gentleMACS オクト ディスソシエーター</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Halt ホスファターゼ阻害剤カクテル (100x)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Halt プロテアーゼ阻害剤カクテル、EDTA フリー (100x)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)、カルシウム、マグネシウム、フェノール不使用、赤色</td><td>サーモフィッシャー</td>、<td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>ラテックスビーズ、カルボン酸変性ポリスチレン、蛍光赤色</td><td>、シグマ・アルドリッチ</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&nbsp;480 SYBR グリーン I マスター</td><td>ロッシュ&nbsp;</td><td>4707516001</td><td>この試薬はPCRに使用しました。&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers(70 & マイクロ;m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermofisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Extraction Buffer</td><td>Thermofisher</td><td>78503</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td>プロトコルではスモールカラムと呼ばれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>MultiMACS Cell24セパレータープラス</td><td>ミルテニー130-098-637</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBSS、pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quanta biosciences</td><td>733-1177</td><td>このキットは、cDNAの合成に使用されました。</td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td>このキットには、1-チオグリセロールとBLバッファー(プロトコルでは溶解バッファーと呼ばれる)が含まれており、トータルRNAの分離に使用されました。</td></tr><tr><td>Vacutainer safety-lok 21 G</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>367282</td><td></td></tr></tbody></table>

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離  

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting

ミクログリアは、脳の常在するマクロファージとして、脳の恒常性を維持するために不可欠です。彼らは、発生中にニューロン回路を形成し、破片や死んだ細胞のために環境を調査し、脳の感染や損傷など、さまざまな機能に対応します。しかし、神経発達やシナプス可塑性、病態生理学におけるそれらの重要な役割は完全には定義されておらず、さらなる研究の必要性が浮き彫りになっています。これらのプロセスにおけるミクログリアの役割をより包括的に理解するためには、ミクログリアを単離し、遺伝的、代謝的、機能的に特徴付ける必要があります。しかし、成体マウス、特に小さな脳構造からのミクログリアの単離は、ミクログリアが全脳細胞のごく一部を占め、単離されたミクログリアの収量が低すぎることが多いため、困難である。ここでは、CD11b+ マイクロビーズを用いたミクログリアの磁気的分離により、灌流したばかりの成体マウス脳の視床下部からミクログリア細胞を選別することができます。現在の方法では、細胞生存率を維持しながら、比較的高い純度と収率を短期間で達成することができます。

最終収率の評価は、単離された細胞の純度と量に依存し、RT-qPCR、細胞計数、およびタンパク質定量によって決定できます。視床下部から単離された磁気細胞の純度は、RT-qPCRによるCD11b、C1qa、Gad1、およびGFAPの遺伝子発現解析によって確認されました(図1)。CD11bおよびC1qaは、主に定常状態でミクログリアによって発現され、CNS16 およびGad1およびGFAPは、それぞれニューロンおよびアストロサイトマーカーとして機能します。1つの視床下部からの総cDNAは55〜98 ngの範囲でした。注目に値するのは、正の画分のみがCD11bおよびC1qaの発現を示し、陰性画分ではミクログリア細胞の潜在的な損失がないことを示していたことです。プライマーを 表2に示します。
さらに、ニューロンマーカーとアストロサイトマーカーのマイナーレベルは、常在するマクロファージと単球が健康な脳の全免疫細胞ランドスケープのわずか10%を構成するため、単離された細胞の大部分がミクログリアであることを確実にします10,11。これらの結果は、磁気選択の有効性を証明し、新たに選別された視床下部ミクログリア細胞におけるすべての対象遺伝子の発現レベルを評価するためのRT-qPCRの適用への道を開くものです。同様に、視床下部でソートされたミクログリアに対してRNAseq解析を行い、トランスクリプトームを包括的に把握することができます。
単離された細胞の量は、細胞計数によって決定され、視床下部あたり~15,000細胞であることがわかりました(プロトコルステップ4.10で言及されています)。さらに、選別されたミクログリアのタンパク質濃度を定量したところ、プールされた2つの視床下部から単離されたCD11b+ 細胞の平均濃度が0.5 μg/μLであることが明らかになりました(図2)。この知識により、最小タンパク質閾値に応じて異なるアッセイを実行することができます。さらに、視床下部をより多くプールすることで、より高い濃度を達成することができ、潜在的な分析の範囲が広がります。視床下部ミクログリアから抽出されたタンパク質は、AlphaLISAイムノアッセイやキナーゼ活性アッセイなど、さまざまな手法を容易にします。
さらに、記載されたプロトコルにより、研究者はいくつかの ex vivo 分析を行うことができ、生理学的および病理学的状況の両方で視床下部におけるミクログリア活性およびそれらの役割の調査が可能になります。ROS産生の定量化は、ミクログリア免疫応答の重要な側面を表しています17。したがって、分離後、ミクログリアは、酸化時に蛍光シグナルの増加を示すことにより、生細胞中のROSの検出を可能にする市販の試薬で処理することができます。 図3Aに示すように、3つのプールされた視床下部から磁気的に分離されたミクログリアは、FACSによってROSを検出するのに十分ですが、私たちの結果は、分析した条件間で細胞のROS産生のかなり高い変動性を示しています。注目すべきは、上記の市販キット( 材料表を参照)では、DNAに結合すると蛍光の増加を示す細胞不透過性の死細胞染色のおかげで、選別されたCd11b+細胞の生存率も評価できたことです。具体的には、私たちのデータは、細胞の99%が生きていることを示しています(図3B)。ゲーティング戦略は、蛍光特性に基づいて、生きた細胞と死んだ細胞、および酸化的にストレスを受けた細胞とストレスを受けていない細胞を区別するために使用されました。
ミクログリア活性のもう一つの主要な特徴は、免疫監視、組織修復、および中枢神経系の全体的な恒常性において重要な役割を果たす動的で厳密に制御されたプロセスである食作用である18。驚くべきことに、磁気結合ビーズで選別されたCd11b+ 細胞は、24時間培養した後、異なる時点で蛍光ラテックスマイクロビーズとインキュベートして、FACSまたは蛍光顕微鏡のいずれかによって、異なる条件下での食作用活性の変化を評価することができる。選別したばかりのミクログリアは、チューブ内で蛍光ビーズや任意のタイプのpHrodo共役粒子(シナプトソームなど)に直接さらすこともでき、食作用はFACS分析によって評価できます。
具体的には、選別された細胞懸濁液、プールされた2つの視床下部から分離されたミクログリア、または蛍光ラテックスビーズを含む全脳を含むチューブ内で直接インキュベートしました。少なくとも1つの蛍光ビーズを食作用させたミクログリアは、食作用性ミクログリアが増強された蛍光を示すため、フローサイトメトリーによって非食作用細胞と区別することができる。ビーズでインキュベートされていないネガティブコントロールをゲーティングに使用しました。私たちの実験条件(チャウを与えられたマウスと高脂肪食(HFD)を与えられたマウス)の両方で、食作用性ミクログリアの割合が非常に低いことが観察されました(図4A)。しかし、この結果は、この方法の有効性を実証するためにここに示されており、驚くべきことに、1ビーズ、2ビーズ、3ビーズなどの食細胞を区別することも可能にします(図4B)。最後に、すべてのオミクスアプローチは、孤立した視床下部ミクログリアに適用できる可能性があります。これらのアッセイを実行するのに十分な細胞を持つために、3つの視床下部をプールすることをお勧めします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig01.jpg"> 図1:RT-qPCRによるCD11b+ 細胞純度の評価。 インテグリン CD11b、補体C1qサブコンポーネントサブユニットA C1q、グルタミン酸デカルボキシラーゼGad1、およびハウスキーピング遺伝子 Eef1a1 および SdhaのmRNAレベルで正規化されたグリア線維性酸性タンパク質GFAPのmRNA発現の選別細胞における定量化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig02.jpg"> 図2:細胞ソーティング後の視床下部細胞からのタンパク質定量。 CD11b+ およびCD11b- 細胞におけるタンパク質濃度の定量化。CD11b+ 細胞とCD11b- 細胞の両方を20 μLの溶解バッファーで溶解しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig03.jpg"> 図3:ミクログリア生細胞におけるROSの検出。 (A)酸化ストレスを受けた細胞と(B)選別されたCd11b + 細胞の集団内の生細胞の定量化、および相対的なFACS等高線プロットによる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66769/66769fig04.jpg"> 図4:ミクログリア食作用の定量化。 (A)2つの視床下部または1つの脳から選別されたCd11b + 細胞の食細胞の食細胞の定量化、および相対的なFACS等高線プロット。(B)相対FACS等高線プロットで食細胞化されたビーズの数に応じた食細胞の割合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66769/66769fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">酵素ミックス2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>酵素A</td>
			<td>バッファ Y</td>
			<td>酵素P</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μL</td>
			<td>20μL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>D-PBSの</td>
			<td>デブリ除去ソリューション</td>
			<td>オーバーレイD-PBS</td>
		</tr><tr><td>15-100 mgの構造</td>
			<td>1000 μL</td>
			<td>450μL</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr></tbody></table>表1:解離混合物(容量は単一のサンプルを参照)とグラジエントオーバーレイヤーの調製。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>遺伝子</td>
			<td colspan="3">蛋白質</td>
			<td colspan="3">フォワード</td>
			<td colspan="3">逆</td>
		</tr><tr><td>イットガム</td>
			<td colspan="3">インテグリンαM(CD11b)</td>
			<td colspan="3">CTCATCカクトGCTggcctatacaa</td>
			<td colspan="3">GCAGCTTCATTCATGTCCTT</td>
		</tr><tr><td>スダ</td>
			<td colspan="3">コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラビンタンパク質サブユニットA</td>
			<td colspan="3">CCCTCTCATTGTGGACATCAA</td>
			<td colspan="3">CAAGGTCTTGTCGATAACAGGT</td>
		</tr><tr><td>C1QAの</td>
			<td colspan="3">補体成分1、qサブコンポーネント、αポリペプチド</td>
			<td colspan="3">CGAGGTGTGGATCGAAAAGG</td>
			<td colspan="3">GAAGATGCTGTCGGCTTCAGT</td>
		</tr><tr><td>ガッド1</td>
			<td colspan="3">グルタミン酸デカルボキシラーゼ1</td>
			<td colspan="3">GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAG</td>
			<td colspan="3">CTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT</td>
		</tr><tr><td>グファップ</td>
			<td colspan="3">グリア線維性酸性タンパク質</td>
			<td colspan="3">AGGTCCGCTTCCTGGAACA</td>
			<td colspan="3">GGGCTCCTTGGCTCGAA</td>
		</tr></tbody></table>表2:RT-qPCRプライマー配列。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>フローサイトメトリーセルソーティング(FACS)</td>
			<td>磁気活性化セルソーティング(MACS)</td>
		</tr><tr><td>蛍光タグ付き生化学的抗体</td>
			<td>抗体に結合した磁気ビーズ</td>
		</tr><tr><td>細胞表面マーカーを超えた分化</td>
			<td>細胞表面マーカーのみによる分化</td>
		</tr><tr><td>大幅な初期歩留まり</td>
			<td>控えめな初期歩留まり</td>
		</tr><tr><td>MACSよりも低速で、多くのサンプルを同時に処理できます</td>
			<td>FACSよりも高速で、多くのサンプルを同時に処理できます</td>
		</tr><tr><td>MACSよりも穏やかではない</td>
			<td>FACSよりも優しい</td>
		</tr></tbody></table>表3:FACSとMACSの特性と制限の表現

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro アッセイを実行するためにプレーティングすることができます。

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Research

JoVE Journal

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