Name: カエルレインとリポ多糖の腹腔内注射の組み合わせによる重症急性膵炎のマウスモデルの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶカエルレインとLPSの腹腔内注射による重症急性膵炎マウスモデルの構築法。C57BL/6Jマウスを用いた非侵襲的アプローチで、膵組織損傷と臓器不全を誘導し、治療標的の探索に貢献します。

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本研究は、淮南市の健康・医療科学研究プロジェクト(No.HNWJ2023005);淮南市市市指導科学技術計画プログラム(第2023151号)安徽省省大学の学生のイノベーションと起業家精神のトレーニングプログラム(第S202310361254号)。「50·Stars of Science and Technology」イノベーションチームは、淮南市と安徽省の主要な臨床専門建設プロジェクトにあります。安徽科技大学第一付属病院の検査部に、関連する検査データを提供してくださったことに感謝いたします。

腹腔内薬物注射によるマウスの膵臓損傷の誘発

<ol><li>Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+severe+acute+pancreatitis%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Management of severe acute pancreatitis: An update.</a> Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).</li>
<li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF11+ameliorates+severe+acute+pancreatitis+through+modulating+macrophage+M1+and+M2+polarization+by+targeting+the+TGFbetaR1%2FSMAD-2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway.</a> Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).</li>
<li>Zhang, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+method+of+an+ideal+model+of+multiple+organ+injury+of+rat+with+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).</li>
<li>Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+regenerating+protein+%28reg+I%29+and+reg+I+receptor+mRNA+are+upregulated+in+rat+pancreas+after+induction+of+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis.</a> World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).</li>
<li>Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+molecular+weight+heparin+on+pancreatic+micro-circulation+in+severe+acute+pancreatitis+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model.</a> Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).</li>
<li>Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hemorrhagic+pancreatitis+%28massive+necrosis%29+with+fat+necrosis+induced+in+mice+by+DL-ethionine+fed+with+a+choline-deficient+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet.</a> Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+XIAP+reduces+the+severity+of+acute+pancreatitis+via+regulation+of+cell+death+and+nuclear+factor-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity.</a> Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+Protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPP4+inhibitor+attenuates+severe+acute+pancreatitis-associated+intestinal+inflammation+via+Nrf2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling.</a> Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+protects+severe+acute+pancreatitis+by+inhibiting+HMGB-1+active+secretion+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages.</a> Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sitagliptin+activates+the+p62-Keap1-Nrf2+signalling+pathway+to+alleviate+oxidative+stress+and+excessive+autophagy+in+severe+acute+pancreatitis-related+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Schmidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+better+model+of+acute+pancreatitis+for+evaluating+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.</a> Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+paracentesis+drainage+attenuates+severe+acute+pancreatitis+by+enhancing+cell+apoptosis+via+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway.</a> Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).</li>
<li>Fontaine, D. A., Davis, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attention+to+background+strain+is+essential+for+metabolic+research%3A+C57BL%2F6+and+the+international+knockout+mouse+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium.</a> Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+CHRM3+activation+causes+pancreatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice.</a> JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).</li>
<li>Sah, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerulein-induced+chronic+pancreatitis+does+not+require+intra-acinar+activation+of+trypsinogen+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice.</a> Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+AMPK+ameliorates+acute+severe+pancreatitis+by+suppressing+pancreatic+acinar+cell+necroptosis+in+obese+mice+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models.</a> Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).</li>
<li>Jin, C., Li, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+severe+acute+pancreatitis+model+in+mice+induced+by+combined+Rain+Frog+Peptide+and+lipopolysaccharide+and+exploration+of+its+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Exp+Bio+Sinica%22%5BJournal%5D)">Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism.</a> Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).</li>
<li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+aggravates+acinar+cell+apoptosis+and+injury+by+regulating+p53%2FAIFM2+transcription+in+severe+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis.</a> Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).</li>
<li>Roy, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Ubap2+deletion+regulates+glucose+tolerance%2C+inflammation%2C+and+protection+from+Caerulein-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis.</a> Cancer Lett. 578, 216455(2023).</li>
<li>Chen, R., Kang, R., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+HMGB1+secretion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The mechanism of HMGB1 secretion and release.</a> Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).</li>
<li>Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+mechanisms+of+major+DAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Release mechanisms of major DAMPs.</a> Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+circulating+histones+in+predicting+persistent+organ+failure+and+mortality+in+patients+with+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis.</a> Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).</li>
<li>Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+high+mobility+Group+Box+1+and+Interleukin-6+levels+in+acute+pancreatitis%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis.</a> J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

現在、重度の急性膵炎患者の高い死亡率を改善するための効果的な手段が不足しています。免疫安定性メカニズムの強化における薬剤の有効性を調べることは非常に重要です。重症急性膵炎の理想的な動物モデルが急務となっています。C57BL/6Jの遺伝的背景を持つマウスは、SAPの病態生理学の研究を含む生物医学研究で広く使用されています。B6Jマウスにおける70年以上にわたる遺伝的分化により、いくつかのエクソンが自然に欠失し15、Caerulein誘発性膵臓損傷に対する感受性が低下している16。また、既存の急性膵炎動物モデルには、外科的外傷や大型動物への適用性などの限界があり、これらのモデルを用いた科学的な研究には支障をきたしています。したがって、この特定の遺伝子系統を用いて、安定的で効率的かつ簡便な動物モデルを確立することは非常に価値があります。
カエルレインは、コレシストキニンの類似体であり、マウスが絶食して十分な量の消化液を貯蔵した短時間内に、高周波注射を通じて膵臓消化液および酵素分泌の相対的閉塞を引き起こすことにより、膵臓組織の損傷を誘発する17。LPSは細菌の細胞壁に見られる主成分であり、マウスにMODおよびSIRSを引き起こす可能性があります18。以前の研究では、異なる頻度でのカエルレイン注射と腹腔内注射によるさまざまな用量のLPSを組み合わせると、ヒトのSAPで観察された同様の病理学的変化が引き起こされることが示されました19,20。この研究では、非侵襲的アプローチを使用して、さまざまな頻度のCaerulein注射とマウスに腹腔内投与されたLPSの異なる用量を組み合わせることにより、さまざまな程度の膵臓損傷を誘発しました。腹膜による均一な吸収を確保することは、プロトコール開発において非常に重要でした。この要件を満たすためには、各薬物投与を正確に制御するために、腹腔内注射のステップを厳守することが重要です。さらに、各投薬注射後に滅菌綿棒で注射部位を穏やかにこすり、適切な圧力を加えることは、腹腔全体に薬を均一に分配するために不可欠です。さらに、ピンヘッドを腹腔内に正確かつ精密に配置し、針を上腹部の中央部に向けて配置することが最も重要です。オペレーターが腹腔内に針を挿入する際の抵抗の不在を正確に認識できるように、事前のトレーニングを実施する必要があります。手動操作の代わりに微量輸液ポンプを利用すると、薬物注射の品質が向上する可能性があります。残念ながら、これはこの研究では実施されませんでした。それにもかかわらず、異なる注射スキームを採用することにより、さまざまな程度の膵臓損傷を誘発し、CaeruleinとLPS注射の組み合わせによって誘発される同一の技術的条件下で、異なる周波数と用量によって引き起こされる膵臓損傷の違いを効果的に観察しました。これは、重度の急性膵炎誘発のための非侵襲的動物モデルにおけるカエルレインの将来の使用に関する貴重な洞察を提供します。
カエルレインとLPSの併用により、血清アミラーゼとリパーゼのレベルが有意に上昇し、膵臓の重量が増加し、炎症細胞の広範な浸潤、膵臓腺房細胞の浮腫、壊死、出血などの組織学的変化がもたらされました。これは、ヘマトキシリンとエオシン(HE)の染色で示されています。さらに、LPSの投与量が増加すると、膵臓の病理学的変化がより顕著になりました。しかし、PI IV群とPI V群の間で膵臓の病理スコアに識別可能な差がなかったのに対し、膵臓組織細胞の壊死の程度はPI IV群と比較してPI III群でより顕著であったことは注目に値します。この観察結果は、Caeruleinの投与頻度が膵臓損傷に寄与する主要な要因として役立つ可能性があることを示唆していますが、LPSはその進行を悪化させ、全身性炎症性損傷を引き起こします18,21。HMGB-1は、その位置に応じて機能するタンパク質です22。細胞外HMGB-1は、炎症の警告信号に関与するタンパク質として作用し、急性膵炎の重症度と密接に関連しています23,24,25。本研究では、すべての実験群のマウスの血清HMGB-1レベルは、対照群と比較して有意に高く、PI V群が最も有意な増加を示しました。免疫組織化学的およびタンパク質電気泳動実験でも、膵臓組織におけるHMGB-1の高発現が確認されました。この重要なタンパク質は、重症急性膵炎における炎症性ストームを抑制するための治療標的として役立つ可能性があります。
要約すると、マウスで非侵襲的で、シンプルで、実行が容易なSAPモデルを開発することが重要です。この実験プロトコルでは、CaeruleinとLPSを組み合わせた膵臓損傷の誘発は信頼性が高く効果的です。カエルレインを50μg/kgの用量で10日間連続して腹腔内投与し、その後、15mg/kgのLPSを腹腔内注射を1回行うことで、安定した、信頼性、費用対効果、効率的なSAPの動物モデルを確立することができます。

重度の急性膵炎は、消化器系疾患領域1内での急速な発症、急速な進行、および高い死亡率を特徴としています。その高い致死率は、常に臨床研究の顕著な焦点でした。臨床状態の予測不可能な変化、疾患症状の不均一性、ヒト検体の入手可能性の制限などにより、動物モデルの確立は疾患研究にとってますます重要になっています。
総胆管へのタウロコール酸ナトリウムの逆行性注射は、SAP2 のラット モデルを作成するために一般的に使用されます。膵胆道閉塞をシミュレートし、胆汁と膵液の逆流を誘発することにより、このモデリング手法は SAP 動物モデルの複製で高い成功率を示します。ただし、侵襲的な手術は動物モデル自体に影響を与えることに注意する必要があります。さらに、この方法は、主に実験対象として使用されるラットやイヌなどの大型動物に限定されています。十二指腸挿管3、直接十二指腸穿刺4、胆管-膵管5の直接穿刺などの代替技術は、モデリング目的で頻繁に利用されます。
腹腔内注射と食事モデリング法は、あらゆるサイズの動物に適用できる非侵襲的な利点を提供します。コリン欠乏エチオニン(CDE)6の摂食によって誘導されるSAPのマウスモデルは、制御が不十分な高血糖や低カルシウム血症などの特定の合併症を呈するため、新しい診断および治療アプローチの評価には適していません。一方、L-アルギニン7と組み合わせたカエルレインの腹腔内注射は、マウスの急性膵炎を誘発するために最も一般的に使用される方法です。具体的には、カエルレイン(コレシストキニン類似体)の腹腔内反復投与は、病因、炎症、再生過程など、この破壊的な疾患に関連するさまざまな側面を調査するための非常に適切なアプローチを提供します。コレシストキニン(CCK)との構造的類似性により、カエルラインは胆嚢の収縮と膵臓の酵素分泌を効果的に刺激し、酵素分泌の不均衡を引き起こし、その後の自己破壊を引き起こします8。リポ多糖(LPS)は、病原体に関連する分子パターン分子として広く研究されており、腹腔内注射によりカエルレインと組み合わせることで、SAPの効果的なマウスモデルを確立することができます。この組み合わせは、かなりの数の炎症性サイトカインを急速に引き起こして放出し、過剰な局所的および全身的な炎症を引き起こします。いくつかの研究で、LPSと組み合わせたCaeruleinの腹腔内注射によるマウスでのSAPモデルの誘導が報告されています。これは、Caeruleinの腹腔内注射がマウスに膵臓浮腫と出血を引き起こす可能性があるという事実に起因する可能性がありますが、LPSの添加はすぐに膵臓壊死を誘発し、全身性炎症反応、敗血症、さらには臓器不全を悪化させる可能性があります。現在、腹腔内カエルレイン注射の投与量と頻度にはばらつきがあり、追加のLPS投与量にも一貫性がありません。.マウスのSAPモデルで一貫性を達成することは困難です9,10,11,12;したがって、理想的なモデルを得るためには、標準化されたプロトコルを確立する必要があります。この記事では、マウスの腹腔内注射のプロトコルについて説明し、LPSの最適な注射頻度と追加投与量を調査します。

<table><tbody><tr><td>20&倍;クエン酸抗原修復液(pH 6.0)</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー有限公司、中国</td><td>G1202-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>アミラーゼ</td><td>Mindray、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アネキシンV-FITC / PI</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.、Ltd、中国</td><td>&nbsp;G1511</td><td>&nbsp; 1:20 で希釈</td></tr><tr><td>抗 HMGB1 ウサギ pAB</td><td>武漢 servicebio Technology Co.,Ltd、中国</td><td>GB11103</td><td>&nbsp; 1:1800 で希釈</td></tr><tr><td>BCA タンパク質定量検出キット</td><td>武漢 servicebio Technology Co.,Ltd、中国</td><td>G2026-200T</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II フローサイトメーター</td><td>BD Life Sciences、カリフォルニア州サンノゼ、95131、米国</td><td>BD FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>GC305010-100g</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>キャビオン実験動物有限公司、常州、中国</td><td></td><td>ライセンス番号 SCXY (Su) 2011&ndash;0003</td></tr><tr><td>セルールタイド</td><td>&nbsp;MCE、ニュージャージー州、米国</td><td>17650-98-5&nbsp;</td><td>50 & マイクロ;g/kg</td></tr><tr><td>化学発光イメージャー</td><td>Cytiva CO.,LTD.;米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸抗原修復液(乾燥粉末pH 6.0)</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>G1201-5 L</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国&</td><td>nbsp;GC305014</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>DAB(SA-HRP)チューネル細胞アポトーシス検出キット</td>武<td>漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>G1507-100 T</td><td></td></tr><tr><td>寸法 EXL、LM 統合化学システム付き</td><td>シーメンスヘルスケア診断株式会社ブルックフィールド、米国</td><td>YZB/米国 8311-2014</td><td></td></tr><tr><td>ECL 開発者</td>武<td>漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エオシン色素(アルコール可溶性)</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>G1001-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>EthoVision XT&</td><td>nbsp;オランダ、</td><td></td><td></td>ノルダス</tr><tr><td>FITC 標識ヤギ抗ウサギ IgG</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>GB22303</td><td>&nbsp; 1:50 で希釈</td></tr><tr><td>全自動血球分析装置</td><td>Zybio Inc. 中国</td><td>&nbsp;Zybio-Z3 CRP</td><td></td></tr><tr><td>GapDH</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー有限公司、中国</td><td>GB11103</td><td>&nbsp; 1:1500 で希釈</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン ブルー リターン ソリューション</td><td>武漢 サービスバイオ テクノロジー 株式会社、中国</td><td>G1040-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン分化ソリューション</td><td>武漢 サービスバイオ テクノロジー 株式会社、中国</td><td>G1039-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン染料</td><td>武漢 サービスバイオTechnology Co.、Ltd、中国</td><td>G1004-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>HMGB-1 ELISAキット</td><td>njjcbio Co.、Ltd、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td>武<td>漢サービスbioテクノロジー株式会社、中国</td><td>KZ-III-F;IC111150 100222</td><td></td></tr><tr><td>HRP標識ヤギ抗ウサギIgG</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー有限公司、中国GB23303</td><td></td><td>&nbsp;1:1500で希釈</td></tr><tr><td>IL-6 ELISAキット</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国GEM0001</td><td></td><td></td></tr>リ<tr><td>パーゼ&nbsp;</td><td>Mindray、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類&nbsp;</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国GC205009</td><td></td><td>15 mg/kg</td></tr><tr><td>低温高速遠心分離機</td>長<td>沙平扇装置&Instrument Co.,Ltd.、中国</td><td>TGL-20M</td><td></td></tr><tr><td>膜破壊液</td><td>Wuhan servicebio Technology Co.、Ltd、中国</td><td>G1204</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.;中国</td><td>CR-601ST</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td>武<td>漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td></td><td>200メッシュ</td></tr>ワン<tr><td>ステップTUNEL細胞アポトーシス検出キット(DAB染色法)</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国G1507-100T</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィン組織包埋機</td>精密<td>医療機器有限公司;中国常州</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>病理学的組織乾燥装置</td><td>PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO.,LTD;常州、中国</td><td>PHY-III</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>G4202-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>G2008-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>陽性蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社、東京、日本</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>プロカルシトニン</td><td>ミンドレイ、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDFメンブレン</td>ミ<td>リポア、米国</td><td></td><td>0.22&マイクロ;m</td></tr><tr><td>RIPA</td><td>武漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>G2002-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Beyotime Biotechnology、中国</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&α;ELISAキット武</td><td>漢サービスバイオテクノロジー株式会社、中国</td><td>GEM0004</td><td></td></tr>超音波<tr><td>ウォーターバス</td>東<td>莞KQAO超音波機器有限公司;中国</td><td>KQ-200KDE</td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロット</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロットイメージングシステム</td><td>グローバルライフサイエンスIP Holdco LLC、日本</td><td>Amersham ImageQuant 800&nbsp;</td><td></td></tr>ワー<tr><td>ルプールミキ</td><td>サーSCILOGEX;米国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カエルレインとリポ多糖の腹腔内注射の組み合わせによる重症急性膵炎のマウスモデルの準備

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

死亡率が高い重症急性膵炎(SAP)の治療は、重大な臨床的課題を提起しています。動物モデルを使用してSAPに関連する病理学的変化を調査することは、潜在的な治療標的を特定し、新しい治療アプローチを探求するのに役立ちます。以前の研究では、主にタビアウロコール酸ナトリウムの逆行性胆管注射による膵臓損傷を誘発しましたが、動物モデルの品質に対する外科的損傷の影響は不明のままです。この研究では、C57BL/6Jマウスの膵臓損傷を誘発するために、さまざまな頻度の腹腔内Caerulein注射とさまざまな用量のLPSを組み合わせて使用し、5つの腹腔内注射プロトコル間で損傷の程度を比較しました。マウスの急性膵炎の誘発に関して、腹腔内注射プロトコルが提案されています 5日以内に80%もの死亡率をもたらします。具体的には、マウスにカエルレイン(50μg/kg)を1日10回腹腔内注射し、続いて最後のカエルレイン投与の1時間後にLPS(15mg/kg)を注射しました。注射された薬の頻度と投与量を調整することにより、膵臓損傷の重症度を効果的に操作できます。このモデルは、強力な制御性を示し、複製サイクルが短いため、高価な機器を必要とせずに、1人の研究者で完成させることが可能です。ヒトのSAPで観察される主要な疾患特性を便利かつ正確にシミュレートし、高い再現性を実証します。

マウスモデリングの実験プロセスを図1に示します。注入完了の12時間後、オープンフィールドビデオレコーダーを使用して、マウスのさまざまな実験グループの移動距離と不動時間を5サイクルモニターしました(図2A)。5サイクルの間、PI V群のマウスは3分以内に低いレベルの移動距離を維持しましたが、3分以内の不動率はその後のサイクルごとに増加しました(図2B、C)。さらに、5サイクル間の異なる実験グループのマウスの総移動距離について統計解析を行いました。PI V群は、他の実験群と比較して総移動距離が最も小さく、その差は統計的に有意でした(p &lt; 0.001)(図2D、E)。対照群とPI I群を除いて、他の実験群のマウスはD値の重みがマイナスに成長しました。その中で、PI V群は体重の変化が最も大きく、他の実験群と比較した体重変化の差は統計的に有意でした(図2F)。各実験群でさらに10匹のマウスの生存率を評価した結果、PI V群のマウスの死亡率は5日目に80%に達したことが示された。しかし、他の4つの実験群と対照群のマウスとの間には、死亡率に統計的に有意な差はありませんでした(図2G)。
高倍率顕微鏡を用いて、マウスのPI IV群およびPI V群において、有意な細胞腫脹、壊死、および炎症性細胞浸潤が観察されました(図3A、B)。 補足表2に規定されている評価基準を用いて、マウスの異なる実験群の膵病理を評価し、対照群マウスと比較して膵臓病理スコアの有意差(p &lt; 0.001)を観察した(図3C;補足図1)。また、対照群と比較して、測定マウスの血清アミラーゼおよびリパーゼのレベルは、PI II実験群とPI V実験群で有意に高く、その差は統計的に有意であった。興味深いことに、PI I群マウスには統計的に有意な差はありませんでした(図3D、E)。ELISA法を用いて、マウスの血清中のTNF-αおよびIL-6を含む炎症マーカー14のレベルを評価した。その結果、PI V群マウスのTNF-αおよびIL-6レベルは他の実験グループよりも有意に高く、その差は統計的に有意であることが明らかになりました(図3F、G)。対照群と比較すると、PCTレベルは4つの実験群すべてで増加しましたが、PI V群の差のみが統計的に有意でした(p &lt; 0.05)(図3H)。
マウスの異なる実験グループにおける膵臓組織のアポトーシス状態 マウスの各グループの膵臓組織でTUNEL染色を行うことにより、異なる実験グループの膵臓組織における細胞壊死状態が観察されました(図4A)。膵臓組織切片の単位面積あたりのグレースケール値(OD)と細胞壊死の陽性率を、Image Jソフトウェアを使用して半定量的に分析しました。その結果、PI V群マウスの膵臓組織における細胞壊死のレベルは、他の実験群と比較して有意に増加し、その差は統計的に有意(p &lt; 0.001)であることが示されました(図4B、C)。タンパク質免疫ブロッティング実験を行い、細胞壊死マーカーであるシステインアスパラギン酸特異的プロテイナーゼ-3(Caspase-3)の発現レベルを、さまざまな実験群のマウスの膵臓組織で評価しました(図4D)。カスパーゼ-3の発現を定量したところ、PI V群の膵臓組織におけるカスパーゼ-3タンパク質の発現レベルが有意に増加し、その差は統計的に有意であった(p &lt; 0.001)。タンパク質の発現レベルを定量化し、内部制御のGapDHに正規化しました(図4E)。さらに、新鮮な膵臓腺房細胞懸濁液をAnnexin V-FITC/PIで標識し、フローサイトメトリーで分析しました。マウスの他の実験グループと比較して、PI Vグループは細胞死の陽性率が有意に高く、これは統計的に有意であることがわかりました(p &lt; 0.001)(図4F、G)。
末梢血清中のHMGB-1の含有量と膵臓組織におけるHMGB-1の発現レベル HMGB-1タンパク質と膵臓損傷との関係を調べるために、各実験群のマウスの膵臓組織に対して免疫組織化学染色と定量を行った。実験群と対照群の間には統計学的に有意な差がありました(p &lt;0.001)(図5A、B)。ELISAは、さまざまな実験グループのマウスの血清中のHMGB-1のレベルを測定するために使用されました。その結果、対照群と比較して、HMGB-1の血清レベルはすべての実験群で有意に高く、PI V群で最も高いレベルが観察され、その差は統計的に有意であった(p &lt; 0.001)ことが示された(図5C)。さらに、ウェスタンブロット分析では、すべての実験群でマウスの膵臓組織におけるHMGB-1タンパク質の発現上昇が検出され、対照群と比較して統計的に有意な差がありました(p &lt; 0.001)(図5D、E)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig01.jpg"> 図1:実験フローチャート。 2日目と3日目:腹腔内注射。4日目:オープンフィールド実験は、最後の腹腔内注射の12時間後に開始されました。5日目:腹腔内注射の36時間後に安楽死させました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig02v2.jpg"> 図2:PIマウスモデルの巨視的変化 (A)マウスのリアルタイム運動軌跡プロットが示されています。(B)マウスの異なる実験群についての各モニタリング期間内の移動の合計距離。(C)マウスの異なる実験群について、各モニタリング期間内の不動時間の割合。(D,E)15分間の総移動距離と不動時間の割合を、さまざまな実験グループのマウスについて分析しました。(F)モデリング処理前後のマウスの体重を表すD値を示す。(G)腹腔内注射後7日間、各群のマウス10匹の生存が観察された。データは平均±SEM、n = 4で表されます。「ns」は有意ではない、*P &lt; 0.05、****P &lt; 0.001 を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig03.jpg"> 図3:異なる実験群間でのマウス膵炎の病理学的変化 (A)異なる実験群におけるマウス膵臓組織のH&amp;E染色組織切片(ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したパラフィン包埋膵組織切片、100倍およびスケールバー200μmの倍率、および400倍およびスケールバー50μmの倍率。黄色の長い矢印は小島を示しています。赤い長い矢印は腺房細胞を示します。茶色の長い矢印は血管を示します。青い長い矢印はダクトを示します)。(B)マウスの膵臓重量と体重の比率の計算。(C)マウス膵臓の病理学的スコアリング。(D,E)マウスの血清アミラーゼおよびリパーゼレベルの検出。(F-G)マウスの血清TNF-αおよびIL-6レベルのELISA測定。(H) PCTレベルの評価。データは平均±SEM、n = 4で表されます。「ns」は有意ではない、*P &lt; 0.05、****P &lt; 0.001 を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig04.jpg"> 図4:マウスにおける膵臓組織のアポトーシス (A) マウスの膵臓パラフィン切片および拡大領域画像からTUNEL染色の代表的な画像を得た。(400倍、スケールバー50μm、茶色がかった黄色が陽性細胞)。(B,C)マウス膵臓組織のTUNEL染色切片の単位面積当たりのグレースケール値と陽性染色死細胞の割合の定量解析。(D)膵臓組織におけるカスパーゼ-3の発現レベルは、ウェスタンブロットによって検出されました。(E)膵臓組織におけるカスパーゼ-3発現の定量化。(F)フローサイトメトリーを用いて、マウス膵臓腺房細胞における細胞死の程度を評価した。(G)マウス膵臓腺房細胞における後期死細胞の列挙。データは平均±SEM、n = 4で表されます。「ns」は有意ではない、*P &lt; 0.05、****P &lt; 0.001 を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66780/66780fig05.jpg"> 図5:マウス膵臓組織におけるHMGB-1の発現 (A)膵切片上のHMGB-1の免疫組織化学染色の代表画像と拡大画像(x400、スケールバー50μm)。茶色がかった黄色は陽性細胞(n = 4)を示します。(B)膵臓組織切片におけるHMGB-1陽性細胞の割合(n = 24)。(C)マウス血清中のHMGB-1のレベル(n = 4)。(D,E)膵臓組織におけるHMGB-1の発現レベルを検出し、定量結果を得るためにウェスタンブロットを行いました(n = 4)。データはSEM±平均値で表され、「ns」は有意でないことを示します、*P &lt; 0.05、****P &lt; 0.001を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:PI Vグループマウスモデルにおける多臓器損傷。 (A)CONおよびPI V群マウスから採取した膵臓、肺、肝臓、腎臓組織の組織学的変化の代表的な画像を、H&amp;E染色(倍率200倍、スケールバー50μm)を用いて解析した。腺房細胞壊死に関連する病理学的変化は、黒い矢印で示されています。黄色の矢印は、間質性出血と肺胞の浮腫を特徴とする病理学的変化を示しています。肝細胞浮腫と壊死は緑色の矢印で示されます。糸球体出血に関連する病理学的変化は、赤い矢印でマークされています。(B)組織学的スコアの計算は、CONグループおよびPI Vグループマウスから得られた膵臓、肺、肝臓、および腎臓組織で行われました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/supplementary%20FIG%203.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:腹腔内注射プロトコル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表2:膵炎の重症度の病理学的スコアリング基準。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66780/66780_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

腹腔内薬物投与は、膵臓損傷を誘発するための安全で効果的な非侵襲的アプローチです。この研究では、マウスに対する5つの異なる腹腔内注射プロトコルを比較して、さまざまな程度の膵臓損傷を誘発し、重度の膵臓損傷のモデルを確立して、重度の急性膵炎(SAP)の病理学的変化と治療戦略を調査しました。

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

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