カエルレインとリポ多糖の腹腔内注射の組み合わせによる重症急性膵炎のマウスモデルの準備

重度の急性膵炎の治療は、動物モデル、特にC57BL/6Jを選択したバックグラウンドを持つマウスを使用した死亡率が高いため困難です。SAPを病理学的として研究し、治療標的の特定や新しい治療法の開発を行い、1つのSAP研究でポリマウス法を提供しています。

この研究により、HMGB1遺伝子の高発現が膵炎を損傷することが明らかになり、重度の急性膵炎の炎症性結石との関連が示唆されました。私たちのプロトコルには、カエルレインが含まれており、マウスの胆嚢収縮を誘導し、絶食を妨害し、消化液分泌をブロックすることで膵臓組織の損傷を引き起こします。LPS注射と併用することで、マウスに臓器不全を伴う重度の膵炎を誘発しました。このアプローチは非侵襲的で、短いサイクルと高い再現性で実装が容易です。

[デモンストレーター]まず、実験マウスの体重を測定して記録します。カエルレインの腹腔内注射の場合は、腹を上に向けて、頭を尾より下に置いてマウスをつかんで保持します。注射器を右手に持ち、腹部の白線の左側の皮下皮膚に針を挿入します。針を約3〜5ミリメートル前方に動かし、腹腔内に45度の角度で挿入します。針を静止させ、ゆっくりとカエルレインを注入します。針を引き抜き、滅菌綿棒で注射部位を優しくマッサージして押さえ、薬剤を腹腔内に完全に拡散させます。注射の12時間後、マウスを実験者から反対側を向いて実験ボックス内のグリッドの中央に置きます。ビデオトラッキングソフトウェアをオンにして、4つの同時視野のモニタリングを設定します。ボックス内で移動できる実験対象物の長さと幅をリアルタイム監視画面にマークします。マウスのアクティビティを 15 分間記録します。膵臓損傷マウスモデルで5サイクルの間に測定された巨視的変化は、膵損傷グループ5のマウスが3分以内に低いレベルの移動距離を維持し、3分以内の不動率がその後のサイクルごとに増加することを示しました。膵臓損傷グループ 5 は、他の実験グループと比較して総移動距離が最も短く、その差は統計的に有意でした。対照群と膵臓損傷群 1 を除いて、すべてのグループが負の D 値体重増加を示し、膵臓損傷群 5 が最大の変化を示しました。生存率分析では、対照群と有意差を示さなかった他の群とは異なり、5日目までに膵臓損傷群5の死亡率が80%であることが示された。カエルレインの腹腔内注射を36時間行った後、マウスを安楽死させ、フォームプレート上で仰臥位に固定します。腹部正中切開を行い、小腸管を右にひっくり返して膵臓を露出させます。十二指腸と幽門管を外します。膵臓の下に小腸を見つけ、腸管に沿って膵臓組織を完全に解放します。歯のない鉗子を使用して、脾臓をクランプし、そっと上に引っ張ります。膵臓の頭まで後膵臓靭帯組織を鋭く解剖します。次に、胆管と血管を外します。腹腔から膵臓組織を取り出し、吸収紙で表面の水分を軽くたたいて乾かします。膵臓組織の重量を測定して記録します。パラフィン切片を調製した後、膵臓組織をキシレンで2回、それぞれ5分間脱ワックスします。各セクションを100マイクロリットルのプロテイナーゼKで処理し、摂氏37度で20分間インキュベートします。必要な量の3%過酸化水素を組織に加え、20分間インキュベートして完全に浸潤させます。サンプルの全領域を50マイクロリットルの平衡バッファーで覆い、10分間インキュベートします。次に、56マイクロリットルのTDTインキュベーションバッファーを各組織サンプルに加え、1時間インキュベートします。組織切片をPBSで5分間4回洗浄してから、100マイクロリットルのストレプトアビジン-HRP反応溶液で30分間インキュベートします。DAB染色の場合は、各組織切片に50マイクロリットルのDABを追加します。切片をヘマトキシリン染色液に3〜5分間浸してから、純水ですすいでください。サンプルを4回の新鮮な無水エタノールでそれぞれ5分間脱水します。白色光顕微鏡下で組織学的検査を行います。マウスの膵臓組織のTUNEL染色では、膵臓損傷グループ5で細胞壊死の増加が明らかになり、他のグループと比較してグレースケール値が有意に高く、壊死率が陽性でした。 タンパク質免疫ブロッティングは、細胞壊死のマーカーであるカスパーゼ-3 発現を評価し、膵臓損傷グループ 5 組織で有意な増加を示しました。Nexin 5 fit CPI で標識された膵腺房細胞懸濁液のフローサイトメトリーは、膵臓損傷グループ 5 で他のグループと比較して細胞死率が著しく高いことを示し、統計的に有意でした。