Name: 多能性幹細胞の分化を監視するための生細胞画像ベース機械学習戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学ぶ 生細胞明視野画像と機械学習を用いて多能性幹細胞の分化を非侵襲的に監視・制御する手法。リアルタイムでの系統同定とプロトコル最適化により、細胞治療や疾患モデリングへの応用可能性を示す。

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<meta charset="utf8"></head><body>画像ベースML戦略による多能性幹細胞分化のモニタリング

<ol><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+10+years+later%3A+for+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications.</a> Circ Res. 120 (12), 1958-1968 (2017).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Mordwinkin, N. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+high-throughput+drug+discovery%2C+cardiotoxicity+screening%2C+and+publication+standards%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery, cardiotoxicity screening, and publication standards.</a> J Cardiovasc Transl Res. 6 (1), 22-30 (2013).</li>
<li>Vanden Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes under defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1353, 163-180 (2016).</li>
<li>Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+culture+and+cardiomyocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Hum Genet. 87, 1-15 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+tissue-like+constructs+for+repairing+the+infarcted+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium.</a> Stem Cell Rep. 9 (5), 1546-1559 (2017).</li>
<li>Smith, A. S. T., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+tissue+engineering+strategies+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening.</a> Biotechnol Adv. 35 (1), 77-94 (2017).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+to+assess+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity.</a> Nat Protoc. 13 (12), 3018-3041 (2018).</li>
<li>Mehta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+targeted+and+testable+antiarrhythmic+therapy+for+long-QT+syndrome+type+2+using+a+patient-specific+cellular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a targeted and testable antiarrhythmic therapy for long-QT syndrome type 2 using a patient-specific cellular model.</a> Eur Heart J. 39 (16), 1446-1455 (2018).</li>
<li>Cahan, P., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+implications+of+pluripotent+stem+cell+variability+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 357-368 (2013).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Rouhani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+drives+transcriptional+variation+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS Genet. 10 (6), e1004432(2014).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Matoba, N., Yamashita, T., Takayama, K., Sakurai, F., Mizuguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+human+iPS+cell+culture+method+for+efficient+hepatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Optimal human iPS cell culture method for efficient hepatic differentiation.</a> Differentiation. 104, 13-21 (2018).</li>
<li>Volpato, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+molecular+phenotypes+after+long-term+differentiation+to+human+iPSC-derived+neurons%3A+A+multi-site+omics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study.</a> Stem Cell Rep. 11 (4), 897-911 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Rep. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Sepac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cardiomyogenic+potential+among+human+ESC+and+iPSC+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC lines.</a> Cell Transplant. 21 (11), 2523-2530 (2012).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Volpato, V., Webber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+variability+in+iPSC-derived+models+of+human+disease%3A+guidelines+to+promote+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Addressing variability in iPSC-derived models of human disease: guidelines to promote reproducibility.</a> Dis Model Mech. 13 (1), 042317(2020).</li>
<li>Hu, B. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Huo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+batch+variations+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+human+cardiomyocytes+from+2+major+suppliers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of batch variations in induced pluripotent stem cell-derived human cardiomyocytes from 2 major suppliers.</a> Toxicol Sci. 156 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+based+machine+learning+for+identification+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image based machine learning for identification of macrophage subsets.</a> Sci Rep. 7 (1), 3521(2017).</li>
<li>Christiansen, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+labeling%3A+Predicting+fluorescent+labels+in+unlabeled+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In silico labeling: Predicting fluorescent labels in unlabeled images.</a> Cell. 173 (3), 792-803 (2018).</li>
<li>Buggenthin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+hematopoietic+lineage+choice+by+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of hematopoietic lineage choice by deep learning.</a> Nat Methods. 14 (4), 403-406 (2017).</li>
<li>Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+single-cell+imaging+of+direct+reprogramming+reveals+an+early+specifying+event%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 521-526 (2010).</li>
<li>Fan, K., Zhang, S., Zhang, Y., Lu, J., Holcombe, M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+machine+learning+assisted%2C+label-free%2C+non-invasive+approach+for+somatic+reprogramming+in+induced+pluripotent+stem+cell+colony+formation+detection+and+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A machine learning assisted, label-free, non-invasive approach for somatic reprogramming in induced pluripotent stem cell colony formation detection and prediction.</a> Sci Rep. 7 (1), 13496(2017).</li>
<li>Kusumoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+deep+learning-based+system+to+identify+endothelial+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated deep learning-based system to identify endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 10 (6), 1687-1695 (2018).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+predictive+identification+of+neural+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 2614(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+for+quality+control+of+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 4580(2021).</li>
<li>Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+prediction+of+three-dimensional+fluorescence+images+from+transmitted-light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy.</a> Nat Methods. 15 (11), 917-920 (2018).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+live-cell+image-based+machine+learning+strategy+for+reducing+variability+in+PSC+differentiation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems.</a> Cell Discovery. 9 (1), 53(2023).</li>
<li>Selvaraju, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grad-CAM%3A+Visual+explanations+from+deep+networks+via+gradient-based+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Int+Conf+Computer+Vision+%28ICCV%29%22%5BJournal%5D)">Grad-CAM: Visual explanations from deep networks via gradient-based localization.</a> Proc IEEE Int Conf Computer Vision (ICCV). , 618-626 (2017).</li>
<li>Isola, P., Zhu, J. -Y., Zhou, T., Efros, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-to-image+translation+with+conditional+adversarial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+%28CVPR%29%22%5BJournal%5D)">Image-to-image translation with conditional adversarial networks.</a> Proc IEEE Conf Computer Vision Pattern Recognition (CVPR). , 5967-5976 (2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ResNeSt%3A+Split-attention+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE%2FCVF+Conf+Computer+Vision+Pattern+Recognition+Workshops+%28CVPRW%29%22%5BJournal%5D)">ResNeSt: Split-attention networks.</a> Proc IEEE/CVF Conf Computer Vision Pattern Recognition Workshops (CVPRW). , 2735-2745 (2022).</li>
<li>Halabi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-activatable+cell+tracker+for+controlled+and+prolonged+single-cell+labeling%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-activatable cell tracker for controlled and prolonged single-cell labeling).</a> ACS Chem. Biol. 15 (6), 1613-1620 (2020).</li>
<li>Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 8 (2), 430-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+quiescent+cardiac+fibroblasts+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 2454, 109-115 (2022).</li>
<li>Harding, M. J., McGraw, H. F., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+and+regulation+of+multicellular+rosette+structures+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles and regulation of multicellular rosette structures during morphogenesis.</a> Development. 141 (13), 2549-2558 (2014).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+robust+generation+of+functional+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+epiblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and robust generation of functional oligodendrocyte progenitor cells from epiblast stem cells.</a> Nat Methods. 8 (11), 957-962 (2011).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+insulin-producing+pancreatic+%CE%B2+cells+from+multiple+human+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of insulin-producing pancreatic β cells from multiple human stem cell lines.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>希釈した消化物を CPC および CM 消化に使用</td></tr><tr><td>PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGIHC016</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル細胞培養プレート</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル細胞培養プレート</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement Minus Insulin</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>GPC BIOTECH</td><td>AA904-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celldiscoverer 7</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Instruments used to taking brightfield images throughout differentiation and final cTnT images</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG(H + L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A-21202</td>二次<td>抗体</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciencesフロー</td><td></td><td>サイトメトリーソーター</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>VISTECH</td><td>SE100-B</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>YEASEN</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>ヒト多能性幹細胞化学定義培地</td><td>Cauliscell Inc</td><td>400105</td><td>PSC調製培地の基礎培地</td></tr><tr><td>iPS-18</td><td>TaKaRa</td><td>Y00300</td><td></td></tr><tr><td>iPS-B1</td><td>セラピー</td><td>CA4025106</td><td></td></tr><tr><td>iPS-F</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-B</td><td></td></tr><tr><td>iPS-M</td><td>Nuwacell</td><td>RC01001-A</td><td></td></tr><tr><td>IWR1-1-endo</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td>IWR1</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>N/A</td><td>バージョン 6.4.0</td><td><a href="https://jupyter.org/">https://jupyter.org/</a</td></tr><tr><td>>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>バージョン R2020a</td><td>科学計算および画像注釈用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>マウス モノクローナル IgG1 抗 cTnT</td><td>Thermo</td><td>MA5-12960</td><td>cTnT 一次抗体</td></tr><tr><td>ノーマル ロバSerum</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V3 デジタルCMOSカメラ</td><td>浜松</td><td>C13440-20CU</td><td>Celldiscoverer7</td></tr><tr><td>PBS</td><td>NEB</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>多能性 成長材料 1 基礎培地</td><td>セラピー</td><td>CA1007500-1</td><td>PSCの基礎培地培地</td></tr><tr><td>多能性 成長材料 1 サプリメント</td><td>Cellapy</td><td>CA1007500-2</td><td>PSC 培地のサプリメント</td></tr><tr><td>プリズム</td><td>グラフパッド</td><td>バージョン 8/9</td><td>統計分析とプロットのための統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>Python</td><td>N/A</td><td>バージョン 3.6</td><td>科学計算のための Python 3 環境、パッケージ pytorch (1.9.0)、numpy、scipy、pandas、visdom、scikit-learn、scikit-image、opencv-python、および科学計算と画像注釈用のmatplotlibソフトウェア。</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875176</td><td></td></tr><tr><td>Supplement hPSC-CDM (500x)</td><td>Cauliscell Inc</td><td>00015</td><td>PSC 調製培地</td></tr><tr><td>TiE</td><td>Nikon</td><td></td><td>の補遺 領域分離精製 Triton 用の倒立蛍光顕微鏡 (修正付き)</td></tr> &<tr><td>nbsp;X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Versene Solution</td><td>Thermo</td><td>15040066</td><td>EDTA solution for PSC digestion</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Zen</td><td>Zeiss</td><td>Version 3.1</td><td>Celldiscoverer7 の画像取得、処理、解析をサポートするソフトウェア</td></tr></tbody></table>

多能性幹細胞の分化を監視するための生細胞画像ベース機械学習戦略

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

明視野イメージングとMLに基づいて、全体的な差別化プロセスをインテリジェントに監視し、最適化することができます。PSC段階では、初期のPSCコロニーの形態学的特徴に従って最終的な分化効率を予測できるMLモデルを開発し、分化を開始するのに最も適した、または適切な時点を決定しました(図4A、B)。ランダムフォレストモデルによって予測される微分効率は、真の微分効率(ピアソンの r = 0.76、 P &lt; 0.0001)と高い相関があります(図4B)。トレーニング済みのモデルでは、差別化にとって最も重要な特徴も強調表示されます。すべてのコロニー形態学的特徴の中で、中心輪郭距離(CCD)の標準偏差、最小、最小/最大比、および円周、円周、面積、面積/円周比、凸性、および真円度は、最も重要な重みを持つ8つの特徴です。これらの特徴と最終的な効率との関係は、中程度の面積を持ち、より長く不規則な周辺を持つ初期のPSCコロニーは、より高い分化効率を持つ傾向があったことを示唆しており(図4A)、消化溶液の処理時間を長くして、より長く、より不規則な境界を持つ小さなコロニーを生成することにより、分化効率を改善するように促されます(プロトコルステップ1.3.1を参照)。MLによるPSCコロニーのモニタリングと最適化された細胞継代操作により、初期細胞状態の最適化を実現します。
心分化のステージIでは、MLを使用してCHIR(早期心分化の誘導剤)の線量を評価および調整しました。ロジスティック回帰を使用して、0〜12時間のタイムラプス明視野画像を使用してCHIR線量を早期に評価できます。ロジスティック回帰分類器は、CHIR 期間を 24 時間として選択した場合、93.1% の精度、88.7% の精度、94.5% の再現率、91.1% の F1 スコア、97.2% の AUC を達成します。偏差スコア(予測結果)は、実験における各CHIR線量条件(ピアソンの r = 0.82、 P &lt; 0.0001)の「ΔCHIR濃度」(真の結果)と高い相関があり(図4C、D)、ML予測が最適値からのCHIR線量の偏差を反映できることを示唆しています。CHIRの用量を早期に評価することで、CHIRの治療期間や濃度を48時間前に最適に調整することができ、誤分化した細胞の軌道を迅速に修正し、CMの分化を高効率で維持することができます。
また、分化のステージIIおよびステージIIIの明視野画像からCPCとCMを情報として認識するMLモデルを構築しました(図5A-D)。学習済みMLモデルは、生細胞の明視野画像を入力することで、CPCとCMの地域分布を予測し、最終的な分化効率を非侵襲的に評価することができます。CPC認識の場合、ResNeStおよびGrad-CAMによって予測されたCPCセグメンテーションマスクは、手動で注釈されたマスク(図5A)と一致し、平均IoUは59.0%です。CPC領域の予測された割合は、最終的な分化効率(ピアソンのr = 0.88、P &lt; 0.0001)の指標としても役立ちます(図5B)。CM認識の場合、pix2pixモデルは、真の(実験的に得られた)cTnT蛍光画像(図5C)と類似したcTnT蛍光画像を生成することができ、予測された全ウェル分化効率指数(ピアソンのr = 0.93、P &lt; 0.0001)との間に高い相関関係があります(図5D)。このアプローチにより、免疫蛍光染色やフローソーティングによる細胞への不可逆的な損傷を回避できます。光活性化プローブ(DACT-1)をベースとして、バイオマーカーを使わずに効率的な領域選択的CPC精製に成功し(図5E、F)、分化過程で目的の細胞種をリアルタイムに精製することを可能にしました。
このように、生細胞明視野イメージングとMLを活用することで、分化プロセス全体におけるリアルタイムの細胞系譜予測と効率評価を実現し、PSCの分化を調節および安定化します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig01.jpg"> 
図1:ML支援CMの差別化ワークフローの概略図。 実験者は心臓の分化を行い、顕微鏡からタイムラプス明視野細胞画像を取得します。CMの差別化の各段階の画像は、予測のためにトレーニングされたMLモデルに渡されます。この予測をフィードバックとして、実験者は微分スキームをリアルタイムで調整・最適化し、安定して高効率な微分を実現します。スケールバー = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig02.jpg"> 
図2:細胞画像の取得 (A)70%の細胞密度を持つPSCステージからの明視野生細胞画像の例。(B)80〜90%の細胞密度を持つPSCステージからの明視野生細胞画像の例。(C)CPCステージからの明視野生細胞画像の例。(D)CMステージからの明視野生細胞画像の例。(E)明視野と免疫蛍光染色後の蛍光を同じ視野からの例。(ア-E)スケールバー = 250 μm。略語:PSC =多能性幹細胞;CPC = 心臓前駆細胞;CM =心筋細胞;cTnT = 心筋トロポニンT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig03.jpg"> 
図3:MLの使用に関するスクリーンショット (A-C)PSCステージでのMLの代表的なスクリーンショット((A)データセットの準備、(B)モデルのパフォーマンスのテスト、(C)特徴量の重要度の解釈など)。(D-F)ステージ I の ML の代表的なスクリーンショット ((D) データセットの準備と (E,F) モデル評価を含む)。(G-I)ステージ II の ML の代表的なスクリーンショット ((G) データセットの準備、(H) モデルのトレーニング、(I) モデルの評価など)。(J-L)ステージ III の ML の代表的なスクリーンショット ((J) モデル トレーニングと (K,L) モデル評価を含む)。略語:ML =機械学習;PSC = 多能性幹細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig04.jpg"> 
図4:MLベースのCM分化のためのPSCステージとステージIでの代表的な結果 (A)PSCステージでの特徴の可視化結果。差別化効率と8つの最も重要な特徴との関係が示されています。特徴の重要度は、トレーニング済みの ML モデルによって決まります。各フィーチャの範囲は 20 個のビンに分割されます。各ビン内のウェルの微分効率指数は、平均化され、色別に表示されます。色の変化の傾向は、各形態学的特徴が最終的な分化効率にどのように影響するかを表します。これらの結果をまとめると、適度な面積、より長い円周、より変動する中心輪郭距離、より低い真円度、およびより高い凸性が分化をより助長することを示唆しています。(B)真の差別化効率指数と予測された微分効率指数との間の相関分析によるPSC段階でのMLのパフォーマンス評価。高い相関関係は、PSCコロニーの分化ポテンシャルがその形態学的特徴から予測できることを示しています。n = 584ウェル。(C)バッチ内の各CHIR投与条件の予測偏差スコアと真のΔCHIR濃度との間の相関分析を使用したステージIでのMLのパフォーマンス評価。偏差スコア(-1から1の範囲)は、0〜12時間の明視野画像ストリームを使用してMLによって非侵襲的に予測されます。ΔCHIR濃度(...、-4 μM、-2 μM、0、2 μM、4 μMなど)は、最終微分結果によって実験的に決定され、各CHIR条件の最適条件からの実際の偏差を測定します。予測偏差スコアは、実際のΔCHIR濃度を強く示しており、ML予測がCHIR線量評価と調整のシグナルとして役立つことを示唆しています。青と赤のボックスは、それぞれ低用量と過剰摂取の状態を表しています。(D)クロスバッチ検証を使用したステージIでのMLのパフォーマンス評価。各ラウンドでは、1 つのバッチがテストに使用され、他のバッチはトレーニングに使用され、新しいバッチでの ML モデルの一般化能力をテストします。予測偏差スコアと真のΔCHIR濃度(CHIR期間24時間未満)との間の相関分析が行われます。ドットの色は、さまざまなテストバッチを表しています。n = 20 CHIR用量。この図はYang et al.35から引用した。略語:ML =機械学習;PSC = 多能性幹細胞;CHIR = CHIR99021。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66823/66823fig05.jpg"> 
図5:MLベースのCM差別化のためのCPCステージとCMステージでの代表的な結果 (A)ステージIIでのCPC認識のためのMLの典型的な結果。12日目の真のcTnT蛍光画像(左)、手動でアノテーションされたCPC領域(中央)、6日目に明視野画像を使用してMLによって予測されたCPC領域(右)が示されています。予測された結果は、実際の実験結果と非常によく似ています。スケールバー= 1 mm. (B) 真の分化効率指数(12日目のcTnT蛍光ラベルから)とCPC領域の予測パーセンテージ(6日目の明視野画像から)との間の相関分析を使用したステージIIでのMLの性能評価。高い相関関係は、ステージIIで分化効率を非侵襲的に予測できることを示唆しています。True Differentiation Efficiency Indexesは、0%から100%の間で正規化されます。n = 35ウェル。(C)ステージIIIでのCM認識のためのMLの典型的な結果。示されているのは、真のcTnT蛍光結果(左)、予測されたcTnT蛍光結果(中央)、および各ピクセルでの予測された蛍光強度と真の蛍光強度を比較するためのヒートマップ(右)です。蛍光画像は 512 x 512 ピクセルにサイズ変更され、ヒートマップ ビン内の数値は 100 ピクセルあたりのピクセル数の頻度を表します。ピクセルの大部分はヒートマップの対角線に沿って配置されており、予測された蛍光強度と真の蛍光強度が近いことを示しています。スケールバー = 1 mm. (D) 真の差別化効率指数と予測された微分効率指数との間の相関分析を使用したステージIIIでのMLの性能評価。真の差別化効率指数と予測された差別化効率指数は、0% から 100% の間で正規化されます。n = 36ウェル。(E)6日目の画像同定されたCPC精製効果。FACSおよび6日間の培養後、非標識画像同定CPCは、DACT-1標識非CPCおよび対照群(CTL)の細胞と比較して高いCM純度を示します。スケールバー=100μm.(F)(E)中のcTnT+細胞の割合を比較することにより、精製効果を定量的に分析。データはSD±n=5画像の平均です。* P &lt; 0.05;P&lt;、一元配置ANOVAとそれに続くダネットの多重比較検定によって0.0001を導き出しました。この図はYang et al.35から引用した。略語:ML =機械学習;PSC = 多能性幹細胞;CPC = 心臓前駆細胞;CM =心筋細胞;cTnT = 心筋トロポニンT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66823/66823fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">観察された問題</td>
			<td colspan="4">考えられる理由</td>
			<td colspan="5">解決</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">ML モデルは、トレーニング セットで適切に実行されません。</td>
			<td colspan="4">1. ML モデルのトレーニングがうまく収束しない。 2. 従来のMLでは、抽出された画像の特徴は、細胞の状態や系統を反映するのに十分な情報を提供していません。 3.深層学習の場合、設計されたニューラルネットワークの表現力は、タスクを実行するのに十分ではありません。 4.タスク自体を学ぶのが難しい。</td>
			<td colspan="5">1. ハイパーパラメータの調整(エポック数の増加や学習率の変更など) 2.画像を観察して、細胞の状態に関する形態学的な手がかりを見つけます。生物学的にもっともらしい特徴を設計します。 3. ネットワーク アーキテクチャを変更して、複雑さを増します。 4. データセットを調査し、標的細胞の特徴を簡単に特定できることを確認します。モデルがタスクの学習に失敗した場合は、イメージングの手がかりがより明確になる段階で ML を適用するか、より単純なタスクを設計してみてください。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">ML モデルは、トレーニング セットではうまく機能しませんが、テスト セットではうまく機能しません。</td>
			<td colspan="4">1. モデルがトレーニング セットに過剰適合している。</td>
			<td colspan="5">1. トレーニング データセットを充実させ、モデルを再トレーニングします。より多くの細胞株、分化条件、およびイメージング条件を含めることにより、トレーニングデータセットの多様性を高めます。 従来の ML では、特徴選択を使用して入力特徴の数を減らすと、モデルの汎化能力も向上する可能性があります。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">MLモデルは、新しいバッチや新しい細胞株ではうまく機能しません。</td>
			<td colspan="4">1.顕微鏡とイメージングのパラメータが変わります。 2. 細胞株によって形態学的特徴が異なる場合があります。</td>
			<td colspan="5">1. イメージング デバイスがモデル トレーニング中と同じであることを確認します。 2. 新しい細胞株および/または新しいイメージング条件から取得した標識データを収集し、MLモデルを再トレーニングまたは微調整します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">分化プロセスのMLガイドによる変調は、分化結果を改善するようには見えません。</td>
			<td colspan="4">1. ML出力が不正確です。 2. 実験試薬または手順に問題が存在する。 3. 細胞株に根本的な問題があり、分化能力が不足している。</td>
			<td colspan="5">1. 上記のトラブルシューティング手順を試行します。 2.実験室の試薬と実験手順を検査します。 3.細胞株を変更します。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">精製後も細胞型の汚染が残っています。</td>
			<td colspan="4">1.予測結果が不正確です。 2.精製領域の端に位置するいくつかの不要な細胞をカプセル化しました。</td>
			<td colspan="5">1. ML で予測された結果を最適化します。 2. MLで予測された結果をより保守的に、すなわちCM領域のサイズを適切に縮小して使用する。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">精製後の細胞の状態が悪い。</td>
			<td colspan="4">1.レーザー光毒性。 2.操作プロセスが遅い。 3.消化によって引き起こされる細胞の損傷。 4.フローソーティングプロセスによって引き起こされるセルの損傷。</td>
			<td colspan="5">1. 目的の細胞ではなく、レーザー照射により不要な細胞を排除します。 2.より速い操作。 3.消化酵素の濃度を下げるなど、継代方法を調整します。 4. 選別処理中に設定されるセルの流速を下げるなど、選別方法を調整します。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: トラブルシューティング テーブル。

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...

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