Name: 根圏土壌からの多種バイオフィルム群集構築へのアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: 学ぶ根圏土壌由来の多種バイオフィルム構築法。キュウリ種子を用いた標準化プロトコルで、合成細菌群集を効率的に確立し、第二世代バイオ肥料開発への応用可能性を示します。

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この研究は、中国国家自然科学基金会(42307173および42107328)および国家重点研究開発プログラム(2022YFD1500202および2022YFF1001800)によって財政的に支援されました。P.W.、Z.Xが研究を設計しました。P.W、B.X、Z.C、J.X、N.Zがデータを分析し、数値を作成しました。P.W.は原稿の初稿を書きました。Z.X.、R.Z.、Q.S.が原稿を改訂しました。

このプロトコルは、一般に、さまざまな植物からの根圏土壌微生物叢に適用できます。ここでは、キュウリを例に挙げます。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1.細菌の分離
<ol><li>根圏土壌の分離<ol><li>キュウリの文化<ol><li>キュウリの種子を75%エタノールと2%次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)溶液で消毒し、滅菌水ですすいでください11。</li>
			<li>無菌条件下で種子を発芽させ、二葉ステージ12に達するものを選択します。その後、一貫して発芽したキュウリの苗を2kgの黒い土が入った鉢に移植します。 注:システマティックエラーを減らすために、中国北東部の異なる場所からの2種類の黒土が使用されています。</li>
		</ol></li>
		<li>土壌懸濁液の準備<ol><li>製剤を使用してPBS-S緩衝液を調製します:6.33 gのNaH2PO4·H2O、16.5 g の Na2HPO4・7H2O、200 μL の Silwet L-77、および 1 L の蒸留水。</li>
			<li>苗が四つ葉のステージ12に達したら、鉢を反転させ、滅菌した手袋を使用して、厚さ2mmの根圏土壌とともに根を分離します。</li>
			<li>50 mLの遠心チューブに根を30 mLのPBS-Sバッファーに入れます。20分間振とうした後、懸濁液を100μmのナイロンセルフィルターでろ過し、根と大きな沈殿物を取り除きます。</li>
			<li>濾液を別の50 mL遠心チューブに移し、室温で3200 x g で15分間遠心分離し、4°Cで一時的に保存します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>根圏土壌細菌細胞の抽出。 注:この方法論は、示差遠心分離法13を採用していますが、Nycodenz密度勾配遠心分離法14 もこのステップに適用されます。<ol><li>土壌懸濁液を0.2%Na4P2O7 溶液で500 mLに希釈し、1,000 x g で10分間遠心分離して、最初に生物を土壌から分離します。</li>
		<li>沈殿物を再均質化し、同じ低速で60秒間遠心分離し、このプロセスを3回繰り返します。上清を結合し、12,000 x g で20分間遠心分離し、上清を捨てます。</li>
		<li>沈殿物を50 mLのPBS-S緩衝液に再懸濁し、根圏土壌細菌細胞懸濁液を構成します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 根圏バイオフィルム微生物叢のシーケンシングと同定
<ol><li>メディアの準備 注:トリプシン大豆ブロス(TSB)および最小塩グリセロールグルタミン酸(MSgg)培地は市販されています。以下の処方は参照用です。.<ol><li>次の組成を使用してTSB培地を調製します:15 μg/mLトリプトン、5 μg/mL大豆ペプトン、5 μg/mL NaCl、pH = 7。</li>
		<li>5 mM KH2PO4、100 mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、2 mM MgCl2、700 μM CaCl2、50 μM MnCl2、50 μM FeCl3、1 μM ZnCl2、2 μM チアミン、0.5% グリセロール、0.5% グルタミン酸、50 μg/mL トリプトファン、50 μg/mL フェニルアラニン、 pH = 7です。</li>
		<li>TSB-MSgg メディアを調製するには、TSB メディアと MSgg メディアを 1:1 の比率 (v/v) で混合します15。</li>
	</ol></li>
	<li>ペリクルバイオフィルム共培養<ol><li>細胞懸濁液をTSB培地で30°Cで一晩(通常は12時間)インキュベートして、細菌を活性化します。</li>
		<li>100 μmナイロンセルフィルターを24ウェルプレート上に置きます。TSB培地で細菌をインキュベートし、3回の繰り返しを設定します。ペリクルバイオフィルムを30°Cで36時間培養します。 注:最後のステップのペリクルバイオフィルムが十分に培養されていない場合、TSB-MSgg培地はTSB培地の効果的な代替品です。</li>
		<li>ペリクルバイオフィルムを含むフィルターを取り外します。新しい24ウェル細胞プレートに2mLのPBS-Sバッファーを加え、その中に24ウェルフィルターを入れてバイオフィルムを洗浄し、遊離細胞を除去します。洗濯を3回繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>ペリクルバイオフィルムDNAの抽出<ol><li>製造元の指示に従って、DNAキットを使用してバイオフィルムゲノムを抽出します。</li>
	</ol></li>
	<li>ハイスループットシーケンシング 注:バイオテクノロジー企業は、ほとんどのラボでシーケンシング実験を完了するのを支援できます。残りの溶液中の微生物組成物が必要な場合は、このステップで配列決定します。シーケンシングステップは機器によって異なります。製造元の指示に従ってください。ステップ2.4.1は参照用です。<ol><li>データベースに基づいて、完全長の16S rRNA遺伝子配列を使用して、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅します。サンプル16あたりの最小配列数に従って種OTUを作成します。種分類アノテーションをクラスター化し、各サンプルからコミュニティの組成を取得します。</li>
		<li>シーケンシングデータに基づいて、相対的な存在量の観点から上位5つの株を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>ハイスループットの細菌分離と培養 注:このステップは、最新の微生物学的およびバイオインフォマティクス方法論17に従って設計されています。ここでは、希釈コーティングプレート法を細菌の分離に使用できますが、ハイスループット技術に比べて時間がかかり、ターゲットを絞る必要も少なくなります。<ol><li>培養したバイオフィルムを混合します。24ウェルプレートのウェルの30%以上が細菌の増殖を示さないように、限界希釈を使用してください。 注:最適な希釈を決定するには、幅広い希釈率を使用して予備実験を行います。最適な希釈には、1ミリリットルあたり2個以下の培養可能な細菌を含める必要があり、これはウェルの30%未満での細菌のインキュベーションに相当します。</li>
		<li>ウェルやプレートの標識を添加しながら、細菌の16S rRNA遺伝子を増幅し、ハイスループットのIlluminaプラットフォーム17を使用してそれらをシーケンシングします。</li>
		<li>市販のソフトウェアを用いてバイオインフォマティクス解析を行い、各培養物の純度や種の分類情報を取得します。</li>
		<li>上位5種類の豊富な純細菌を連続系統培養で培養し、グリセロールを使用して-80°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 合成微生物群集の構築
<ol><li>再構築されたバイオフィルム培養 注:詳細については、Ren et al.18を参照してください。5つの系統は、5つの単一種、10の2種、10の3種、5つの4種、および1つの5種のコンソーシアムを含む31の合成組み合わせに対応します。<ol><li>5つの菌株をTSB培地でOD600 が1になるまでインキュベートして活性化します。</li>
		<li>TSB培地で24ウェルプレートを数枚調製し、その上に100 μmナイロンセルフィルターをセットします。 注:最後のステップのバイオフィルムが十分に培養されていない場合、TSB-MSgg培地はTSB培地の効果的な代替品です。</li>
		<li>培地中の31種類の合成コミュニティの組み合わせをインキュベートします。各ウェルで細菌の接種数が一貫していることを確認してください。組み合わせごとに 3 回の繰り返しを設定します。</li>
		<li>バイオフィルムを30°Cで36時間培養します。</li>
	</ol></li>
	<li>ペリクルバイオフィルムの定量化<ol><li>ステップ 2.2.3 と同じ手順に従います。</li>
		<li>バイオフィルムを180 μLのクリスタルバイオレット溶液を含む新しい24ウェルプレートに移し、20分間染色します。</li>
		<li>染色したサンプルを、200 μL の 96% エタノールを含む別の 24 ウェルプレートに移し、30 分間溶出して OD590 を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. ペリクル細胞数の定量化
注:各種の割合とペリクルおよび残りの溶液中の細胞数を決定するには、定量的PCRが必要です。詳細については、Sun et al.16を参照してください。
<ol><li>選択した合成微生物群集の菌株特異的プライマーを設計します。</li>
	<li>Roaryを使用してゲノム比較を行い、各分離株の株特異的な単一コピー遺伝子を見つけます。プライマーがこれらの遺伝子を標的にしていることを確認してください。</li>
	<li>増幅されたフラグメントをPMD19Tプラスミドにリガーゼします。対応するフラグメントを含むプラスミドをテンプレートとして使用して、標準曲線を生成します。</li>
	<li>ステップ 2.2 で説明したのと同じ手順に従います。</li>
	<li>反応成分は、7.2 μLのH2O、10 μLの2x qPCR Masterミックス、各プライマーの10 μMの0.4 μL、および2 μLのテンプレートDNAを調製します。</li>
	<li>リアルタイムPCR装置を用いて、95°Cで10分間、95°Cで30秒間、60°Cで45秒間のサイクルを行い、その後、標準的な融解曲線セグメントを経る条件でPCRを実行します。</li>
	<li>各治療に対して6回の生物学的複製を行います。</li>
</ol>

根圏土壌からの相乗的多種バイオフィルムの開発

<ol><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+from+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
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<li>Palková, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+microorganisms%3A+Laboratory+versus+nature%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature.</a> EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+in+plant-microbe+beneficial+interactions%3A+a+toolbox+for+precise+management+of+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes.</a> Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

プロトコルに従って、一連の堅牢な合成多種バイオフィルムコミュニティが、さまざまな植物の根圏土壌中の微生物叢に基づいて構築されます。定量的PCR技術を用いて、各コミュニティの構成を明瞭に解読します。バイオフィルムのバイオマスは、それらの潜在的な代謝相互作用の強さを示しているが、協力の背後にあるさまざまな特性やメカニズムはここでは明らかにできなかった19。天然の微生物群集の規模と複雑さを考えると、合成群集(SynCom)は既存の障害を克服するためのモデルシステムを表しています14。このプロトコルは、複雑な根圏土壌微生物叢から合成バイオフィルムコミュニティを構築するための体系的かつ基本的な方法論を強調しています。
最後の部分から、SQR9、XL-1、XL-2が実際の根圏で安定的にコロニーを形成する可能性が強いことは明らかです。研究者は、これらの株に基づく代謝関係と共コロニー形成メカニズムの調査を開始できます。キュウリの微生物接種剤に関するその後の研究も、その後アクセス可能になります。
前述の利点にもかかわらず、プロトコルの欠点を見落とさないことが重要です。実験室培養と in situ 条件の違いにより、各合成コミュニティの結果は、実際の根圏土壌20の微生物叢を正確に表していない可能性があります。さらなる根圏接種による確認が必要です。さらに、これらの結果の再現性は比較的劣ります。実験室のペリクルバイオフィルム種は、土壌中の野生型と比較して、何世代にもわたって突然変異を起こした可能性があり、制御不能な不正確さにつながっています。
プロトコルの特定の手順には、いくつかの代替手段があります。例えば、ステップ1.2では、Nycodenz密度勾配遠心分離法は、土壌細胞サンプル13の収集に対して比較的効率的である。さらに、ステップ2.4では、最新のハイスループット培養と細菌の同定により、コストは高くなりますが、実験効率が大幅に向上します。したがって、従来の希釈コーティングプレート法は、少数の動物種を選択するのに依然として適しています。最後に、ステップ3.2では、培養バイオフィルムのバイオマスを、クリスタルバイオレット染色と分析天びんで直接計量することで評価できます。
このプロトコルは、単に微生物や環境研究のための基本的な実験材料を作成するだけではありません。最も堅牢な合成細菌の多種バイオフィルムコミュニティを特定することは、オープンで複雑な根圏生態系を解明するための第一歩にすぎません。SynComの中核種に焦点を当てることで、研究者は、より的を絞った迅速な方法で、実際の 現場 の状況についての洞察を得ることができます。このアプローチは、根圏土壌凝集体などの大規模なバイオフィルムを探索し、植物の成長と健康のための根圏微生物群集の正確な管理のための新しい視点を提供する可能性もあります21。
最も重要なことは、この方法論は、根圏土壌微生物叢の集合とダイナミクスを支配する種間相互作用に関するさらなる研究に光を当てることです。例えば、複雑な根圏コミュニティを扱う場合、共起ネットワーク解析やゲノムスケールの代謝モデリング15 などの他の分析手法が、これらの基本的なステップと組み合わされて、代表的なバイオフィルムコミュニティを人工的に構築することが多い。これには、種間関係の考慮事項が含まれます。

バイオフィルムは、表面に付着しているか、界面に結合している複雑な微生物群集を表しています。自然の生息地、臨床現場、産業環境など、さまざまな環境で遭遇する細菌の大部分は、バイオフィルムコミュニティ内で存続していることは広く認識されています1。土壌では、根の表面とそれに隣接する厚さ2 mmの領域を含む根圏は、栄養の利用可能性が高まった生態学的ニッチを形成します。特定の細菌は、このニッチを利用するための戦略を進化させ、微生物の増殖を促進し、根圏2でのバイオフィルムコミュニティの形成を促進しました。
根圏微生物は植物の「第2のゲノム」と考えられています3。植物生長促進微生物(PGPM)は、植物と共生し、生育促進と生物制御機能4を発現します。一方では、PGPMは植物の根に栄養素を供給し、栄養素の取り込みを促進し、病原体から防御し、根圏土壌の汚染物質を分解することができます5。一方、PGPMは、植物の根の滲出液を成長と進化の栄養源として利用し、それによって根圏の土壌と根系に独自の代謝を通じて影響を与えます。これらすべての機能の前提条件は、植物の根圏におけるPGPMの効果的なコロニー形成であり、安定したバイオフィルムを形成することであることは注目に値します6。
根圏バイオフィルムは根圏微生物の集合過程に影響を及ぼし、根圏微生物集合の時間的・空間的特性は多種バイオフィルムの相互作用と密接に関連している7。植物とマイクロバイオームの相互作用のハブとして機能し、植物が効果的に相互作用するための安定した制御可能なニッチを提供します。したがって、根圏バイオフィルムの研究は、植物と微生物の相互作用についての洞察を得るための重要な方向性でもあります。
しかし、現在、根圏の多種バイオフィルムに関する研究はほとんどありません。マイクロバイオームの構成は非常に複雑であるため、天然の微生物群集を取り巻く基本的な生態学的問題に答えることが難しくなっています8。実験の過程では、土壌の種類、植物の種類、多数の微生物群集など、多くの条件を考慮する必要があります。根圏マルチスピーシーズバイオフィルムの研究には、さまざまな要因が限界があります。
種間相乗相互作用や代謝物クロスフィーディング8など、根圏土壌からの多種バイオフィルムコミュニティをさらに調査するためには、実験室条件下で単純化された、代表的な、安定的で扱いやすい合成微生物コミュニティを人工的に構築することが望ましい9,10。ここでは、標準化されたプロトコルが、最新の微生物学的およびバイオインフォマティクス技術のいくつかを組み合わせています。

<table><tbody><tr><td>0.2 % Na4P2O7溶液</td><td>シノファーム化学試薬(株)</td><td>20041418</td><td>土壌懸濁液を希釈するために使用されます。</td></tr><tr><td>100 μm Nylon Cell Filter</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. (ナイロンセルフィルター 三言生物科技(上海)有限公司)</td><td>F613463-0001</td><td>培養液をろ過し、ペリクルバイオフィルムを分離するために使用されます。</td></tr><tr><td>2%NaClO溶液</td><td>シノファーム化学試薬(株)</td><td>L03336903</td><td>種子の滅菌に使用されます。</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Merck &amp; Co., Inc.</td><td>PSRP010</td><td>マイクロビアル栽培やペリクルバイオフィルムの分離に使用されます。</td></tr><tr><td>3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)</td><td>Bioolook Scientific Research Special</td><td>2360010</td><td>MSgg培地の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>50 mL遠心チューブ</td><td>Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.</td><td>62.547.254</td><td>私たちのプロトコルに適したサイズの遠心分離管。</td></tr><tr><td>75% C2H5OH溶液</td><td>シノファーム化学試薬(株)</td><td>801769680</td><td>種子の滅菌に使用されます。</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii XL-1</td><td>南京農業大学</td><td>N/A</td><td>根圏土壌から分離された株.</td></tr><tr><td>Bacillus velezensis SQR9</td><td>南京農業大学</td><td>N/A</td><td>根圏土壌から分離された株.</td></tr><tr><td>バクテリアDNAキット</td><td>Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.</td><td>D3350020000K04U021</td><td>細菌のDNAを抽出するために使用されます。</td></tr><tr><td>黒土 I</td><td>南京農業大学</td><td>N/A</td><td>吉林省の黒土。</td></tr><tr><td>黒土II</td><td>南京農業大学</td><td>N/A</td><td>黒竜江省の黒土。</td></tr><tr><td>Burkholderia cenocepacia XL-2</td><td>南京農業大学</td><td>N/A</td><td>根圏土壌から分離された株.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10035048</td><td>MSgg メディアの準備に使用します。</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.</td><td>G508009-0001</td><td>高速遠心分離機。</td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme Biotech Co.,Ltd. (英語)</td><td>Q311-02</td><td>qPCRにおけるDNA増幅に使用。</td></tr><tr><td>クリーンベンチ</td><td>蘇州アンタイエアテック株式会社</td><td>NB026143</td><td>無菌運転に使用されます。</td></tr><tr><td>恒温インキュベーター</td><td>ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd</td><td>GNP-9080BS-<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" style="margin: auto;"></td><td>微生物培養に使用。</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレットダイ</td><td>サンゴンバイオテック(上海)有限公司</td><td>A600331</td><td>ペリクルバイオフィルムの染色と定量に使用されます。</td></tr><tr><td>キュウリの種南</td><td>京農業大学</td><td>N / A</td><td>「JinchunI」キュウリの種。</td></tr><tr><td>Culturome v 1.0</td><td>The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences</td><td>N/A</td><td>ハイスループットの根圏土壌細菌培養と同定に使用</td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011918</td><td>MSgg培地の調製に使用。</td></tr><tr><td>冷蔵庫</td><td>合肥美的冷蔵庫有限公司</td><td>BCD-556WKPM(Q)</td><td>菌株保存に使用。</td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>バイオルック科学研究スペシャル</td><td>2180020</td><td>MSgg培地の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、株式会社</td><td>10010618</td><td>MSgg媒体を調製するために使用されます。</td></tr><tr><td>水耕栽培の植栽バスケット</td><td>Yulv家具店</td><td>6526262626</td><td>キュウリの水耕栽培に使用されます。</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10017618</td><td>MSgg メディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>MgCl&lt;サブ&gt;2サブ&gt;</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>7791186</td><td>MSgg メディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Xilong Scientific Co.,Ltd.</td><td>10400101</td><td>MSgg メディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>Msgg Medium</td><td>Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.</td> (英語)<td>BES20791KB</td><td>ペリクルバイオフィルム培地。</td></tr><tr><td>Na2HPO4·7H2O</td><td>メルク・アンド・カンパニー・インク</td><td>S9390-100G</td><td>TSBメディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>NaCI</td><td>チャイナサンスペシャルティプロダクツ株式会社</td><td>HS0416</td><td>TSB メディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>NaH2PO4·H2O</td><td>メルク・アンド・カンパニー・インク</td><td>S9638-25G</td><td>TSBメディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>PBS-S バッファー</td><td>サンゴン バイオテック (上海) Co.,Ltd.</td><td>E607008-0001</td><td>生体組織用基本緩衝液。</td></tr><tr><td>フェニルアラニン</td><td>RYON</td><td>RT3486L005</td><td>MSgg培地の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>ピペット北京</td><td>Labgic Technology Co.、Ltd.</td><td>BS-1000-T</td><td>ひずみ接種に使用されます。</td></tr><tr><td>PMD19T プラスミド</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.</td><td>D102A</td><td>qPCRの標準曲線を作成するために使用されます。</td></tr><tr><td>ポット</td><td>シノファーム化学試薬株式会社</td><td>YHHWS2401</td><td>キュウリの土壌培養に使用されます。</td></tr><tr><td>qPCR用プライマー</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>N/A</td><td>qPCRにおけるDNA増幅に使用されます。</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR装置</td><td>Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.</td><td>4484073</td><td>選択したペリクルバイオフィルムに対してqPCRを行うために使用されます。</td></tr><tr><td>Roary</td><td>The Wellcome Trust SangerInstitute</td><td>N/A</td> qPCR <td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd</td><td>ZQTY-50S</td> のプライマーの設計に使用されました <td>溶液の混合と微生物栽培に使用されます。</td></tr><tr><td>シルウェット L-77</td><td>Cytiva Bio-technology(杭州) Co., Ltd.</td><td>SL77080596</td><td>TSB メディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>大豆ペプトン</td><td>青島ハイテク工業団地ホープバイオテクノロジー株式会社</td><td>HB8275TSB</td><td>メディアの準備に使用されます。</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>上海Yidian分析器械Co.、株式会社。</td><td>76713100010</td><td>ペリクルバイオフィルムクリスタルバイオレット定量化に使用されます。</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、Ltd.</td><td>SW150302</td><td>ペリクルバイオフィルムの洗浄に使用します。</td></tr><tr><td>滅菌ニトリル手袋</td><td>Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.</td><td>223016852LLZA</td><td>基本的な実験操作に使用されます。</td></tr><tr><td>テンプレートDNA</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.</td><td>N/A</td><td>qPCRにおけるDNA増幅に使用されます。</td></tr><tr><td>チアミン</td><td>Bioolook科学研究スペシャル</td><td>2180020</td><td>MSgg培地の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>LP0042B</td><td>TSB培地の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>トリプトファン</td><td>バイオルック科学研究スペシャル</td><td>2190020</td><td>MSgg培地の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>TSBミディア</td>ム広<td>東Huankai微生物科学&amp;技術有限公司</td><td>024048</td><td>広域スペクトルの細菌培地。</td></tr><tr><td>TSB-Msgg Meidium</td><td>南京農業大学</td><td>N/A</td><td>ペリクルバイオフィルム培養用の混合培地で、より幅広い適用性を備えています。</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>南京化学試薬Co.、株式会社</td><td>C0310520123</td><td>MSgg媒体を調製するために使用されます。</td></tr></tbody></table>

根圏土壌からの多種バイオフィルム群集構築へのアプローチ

An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil

マルチスピーシーズバイオフィルムは、根圏土壌を含む自然界のバクテリアの自然発生的で支配的なライフスタイルですが、現在の理解は限られています。ここでは、相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを迅速に確立するためのアプローチを提供します。最初のステップは、示差遠心分離法を使用して根圏土壌から細胞を抽出することです。その後、これらの土壌細胞を培地に接種して、ペリクルバイオフィルムを形成します。インキュベーションの36時間後、バイオフィルムとその下の溶液の細菌組成を、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング法を使用して決定します。一方、ペリクルバイオフィルムからのハイスループット細菌分離は、限界希釈法を使用して行われます。次に、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングデータ(ペリクルバイオフィルムサンプル)で最も存在量の多い上位5つの細菌分類群を選択し、多種バイオフィルムコミュニティの構築にさらに使用します。5つの細菌分類群のすべての組み合わせは、24ウェルプレートを使用して迅速に確立され、クリスタルバイオレット染色アッセイによって最も強いバイオフィルム形成能力が選択され、qPCRによって定量されました。最後に、最も堅牢な合成細菌の多種バイオフィルムコミュニティを上記の方法で取得しました。この方法論は、根圏多種バイオフィルムの研究を行い、これらの種間の相互作用を支配する原理を研究するための代表的なコミュニティを特定するための有益なガイダンスを提供します。

上記の手順に続いて、キュウリの根圏土壌微生物叢からのバイオフィルム形成能力の有意な勾配が観察されます(図1)。バイオフィルムアンプリコンシーケンシングにより、ペリクル中の種が確認されました(図2)。シーケンシングデータのヒートマッピングに基づいて、ペリクル内の存在量が残りの溶液中の細菌種よりも大きい上位5つの細菌種が選択されました(図3)。ここでは、典型的な合成コミュニティのグループを例に挙げました。クリスタルバイオレット染色と定量PCRは、コミュニティ内のペリクルバイオマスと各種の相対的な存在量の違いを直接視覚化します。共培養バイオマスの増加は、根圏土壌から相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを構築することに成功したことを示しています(図4 および 図5)。
その結果、 Bacillus velezensis SQR9、 Acinetobacter baumannii XL-1、 およびBurkholderia cenocepacia XL-2は、3種すべてからなる最も堅牢なコミュニティで、顕著な相乗的コンソーシアムを形成できることが示されています。それらは、バイオフィルム形成において強い相乗作用を示すと予測されています。XL-1が「ディケーター」として機能していることも注目に値します。XL-2およびSQR9のバイオフィルム形成を促進しますが、コンソーシアムでは成長が不十分で存在量が最小限です(図5)。多くの多種共培養バイオフィルムが相乗的な表現型を表していますが、 Chryseobacterium sp.などの一部の種は、合成バイオフィルムのバイオマスを減少させることにより、常に他の菌株と負の相関があります(図2)。この現象は、このプロトコルのターゲットとは関係ありませんが、将来的にはさらに調査する価値があるかもしれません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig01.jpg"> 図1:異なる合成コミュニティ(SynCom)のバイオフィルム形成。 ここでは、サンプルは標準の24ウェルプレートに入っています。写真は拡大せずに撮影されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig02.jpg"> 図2:ペリクルと溶液中の細菌組成。 グラフは、プロトコールステップ2.3で述べた16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングデータに基づいています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig03.jpg"> 図3:ペリクルと溶液中のバイオフィルム形成能力のヒートマップ。 赤はバイオフィルムの存在量を表し、溶液よりも多く、青はその逆を表します。差が示されていない属。上位5つの豊富さの種は左側にチェックマークが付けられています。BB:ブラックバイオフィルム;BS:ブラックソリューション。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig04v2.jpg"> 図4: 図1の合成コミュニティのバイオフィルムバイオマス定量化。 データは、OD = 590 nmの結晶紫色定量によるものです。表示されるデータは、SD±の平均、n = 5です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66926/66926fig05.jpg"> 図5:図1の合成コミュニティの細胞数と種の相対的な存在量。データは定量的PCRによるものです。表示されているデータは、SD±の平均、n = 6です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66926/66926fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、さまざまな根圏土壌から相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを確立するための迅速かつ標準化された手順を紹介します。これは、複雑な根圏土壌微生物叢を調査し、シミュレートするために設計された独自のプロトコルです。

The multispecies biofilm is a naturally occurring and dominant lifestyle of bacteria in nature, including in rhizosphere soil, although the current ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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根圏土壌からの多種バイオフィルム群集構築へのアプローチ

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